基因敲除小鼠的構(gòu)建

關(guān)于基因敲除小鼠的構(gòu)建第一頁，共十五頁，編輯于2023年，星期日1.基因敲除簡介2.基因敲除方法及其原理

2.1基因敲除小鼠的構(gòu)建2.2其他基因敲除方法3.基因敲除應(yīng)用第二頁，共十五頁，編輯于2023年，星期日1.基因敲除簡介基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計的同源片段替代靶基因片段，從而達(dá)到基因敲除的目的。第三頁，共十五頁，編輯于2023年，星期日2.基因敲除方法及其原理同源重組法插入突變法RNAi法第四頁，共十五頁，編輯于2023年，星期日2.1基因敲除小鼠的構(gòu)建利用同源重組構(gòu)建基因敲除小鼠的基本步驟7第五頁，共十五頁，編輯于2023年，星期日1）基因載體的構(gòu)建

把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA分子都重組到帶有標(biāo)記基因的載體上，成為重組載體。第六頁，共十五頁，編輯于2023年，星期日2）ES細(xì)胞的獲得：

現(xiàn)在基因敲除一般采用是胚胎干細(xì)胞，最常用的是鼠，而兔，豬，雞等的胚胎干細(xì)胞也有使用。第七頁，共十五頁，編輯于2023年，星期日3）同源重組：

將重組載體通過一定的方式導(dǎo)入同源的胚胎干細(xì)胞(EScell)中，使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中，從而得以表達(dá)第八頁，共十五頁，編輯于2023年，星期日4）選擇篩選已擊中的細(xì)胞：

目前常用的方法是正負(fù)篩選法（PNS法），標(biāo)記基因的特異位點表達(dá)法以及PCR法。其中應(yīng)用最多的是PNS法。5）表型研究：

通過觀察嵌和體小鼠的生物學(xué)形狀的變化進(jìn)而了解目的基因變化前后對小鼠的生物學(xué)形狀的改變，達(dá)到研究目的基因的目的。第九頁，共十五頁，編輯于2023年，星期日6）得到純合體：

由于同源重組常常發(fā)生在一對染色體上中一條染色體中,所以如果要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，需要進(jìn)行至少兩代遺傳。第十頁，共十五頁，編輯于2023年，星期日該方法通過同源重組將外源基因定點整合入靶細(xì)胞基因組上某一確定的位點，以達(dá)到定點修飾改造染色體上某一基因的目的，克服了隨機(jī)整合的盲目性和偶然性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質(zhì)的方法。直到現(xiàn)在，運(yùn)用基因同源重組進(jìn)行基因敲除是構(gòu)建基因敲除動物模型中最普遍的使用方法。第十一頁，共十五頁，編輯于2023年，星期日2.2其他基因敲除方法

2.2.1利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除

此法利用某些能隨機(jī)插入基因序列的病毒，細(xì)菌或其他基因載體，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立一個攜帶隨機(jī)插入突變的細(xì)胞庫，然后通過相應(yīng)的標(biāo)記進(jìn)行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞。

基因捕獲法是最近發(fā)展起來的利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除的新型方法。技術(shù)原理：第十二頁，共十五頁，編輯于2023年，星期日2.2.2RNAi引起的基因敲除RNAi基因敲除的優(yōu)點及應(yīng)用

比用同源重組法更加簡便，周期大大縮短。

對于哺乳動物，如對于一些敲除后小鼠在胚胎時就會死亡的基因，可以在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中利用RNAi技術(shù)研究它的功能。

RNAi還被用來研究在發(fā)育過程中起作用的基因，如可用RNAi來阻斷某些基因的表達(dá)，來研究他們是否在胚胎干細(xì)胞的增殖和分化過程中其起著關(guān)鍵作用。第十三頁，共十五頁，編輯于2023年，星期日3.基因敲除技術(shù)的應(yīng)用建立生物模型提供廉價的異種移植器官

疾病的分子機(jī)理研究和疾病的基因治療

免疫學(xué)中的