電泳技術(shù) 醫(yī)學(xué)生物化學(xué)課件

2第一節(jié)電泳技術(shù)的發(fā)展及基本原理電泳法，是指帶電荷的供試品（蛋白質(zhì)、核苷酸等）在惰性支持介質(zhì)（如紙、醋酸纖維素膜、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，在電場的作用下，向電極方向按各自的速度進行泳動，使組分分離成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜的方法。

31電泳的發(fā)展簡史1809年俄國物理學(xué)家Рейсе首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。濕粘土中插上帶玻璃管的正負兩個電極，加電壓后正極玻璃管中水層變混濁，即帶負電荷的粘土顆粒向正極移動。1909年Michaelis首次將膠體離子在電場中的移動稱為電泳。他用不同pH的溶液在U形管中測定了過氧化氫酶的電泳移動和等電點。1937年瑞典Uppsala大學(xué)的Tiselius對電泳儀器作了改進，并首次證明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白組成的，由于Tiselius在電泳技術(shù)方面作出的開拓性貢獻而獲得了1948年的諾貝爾化學(xué)獎。1948年Wieland和Fischer重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳方法，對氨基酸的分離進行研究。從20世紀50年代起，Durrum用紙電泳進行了各種蛋白質(zhì)的分離以后，開創(chuàng)了利用各種固體物質(zhì)（如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂糖凝膠、淀粉凝膠等）作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳方法。1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)，創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳，極大地提高了電泳技術(shù)的分辨率，開創(chuàng)了近代電泳的新時代。4目前，聚丙烯酰胺凝膠電泳是生物化學(xué)和分子生物學(xué)中對蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鑒定技術(shù)，是檢驗生化物質(zhì)的最高純度：即“電泳純”（一維電泳一條帶或二維電泳一個點）。由20世紀80年代發(fā)展起來的毛細管電泳技術(shù)，是化學(xué)和生化分析鑒定技術(shù)的重要新發(fā)展，己受到人們的充分重視。5按電泳的原理（或是否有支持介質(zhì)）來分，可分為二類：自由界面電泳：又稱移動界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進行的電泳。這是瑞典Uppsala大學(xué)的著名科學(xué)家Tiselius最早建立的電泳技術(shù)，是在Ｕ形管中進行電泳，無支持介質(zhì)，因而分離效果差。區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。目前電泳一般特指區(qū)帶電泳。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類型。2電泳的分類6①紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纖維素薄膜電泳：常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進行分離。③瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。④聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。其分辨率較高。聚丙烯酰胺電泳和瓊脂糖電泳是目前最常用的。按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：73.1水平式電泳凝膠鋪在水平的玻璃或塑料板上，將凝膠直接浸入緩沖液中。常用于瓊脂糖電泳分離核酸。3.2垂直板式電泳電泳槽中間是夾在一起的兩塊玻璃板，在玻璃平板中間制備電泳凝膠。垂直板式電泳常用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中蛋白質(zhì)的分離。近年來新研制的電泳槽，膠面更小、更薄，以節(jié)省試劑和縮短電泳時間。3電泳的基本裝置電泳裝置主要包括兩個部分：電源和電泳槽。84電泳的基本原理生物分子都帶電荷，其電荷的多少取決于分子性質(zhì)及其所在介質(zhì)的pH。由于混合物中各組分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù)量以及的不同，在同一電場的作用下，各組分泳動的方向和速度也各異。此外，分子量不同也會影響其電泳速度（阻滯力不同）。因此，在一定時間內(nèi)各組分移動的距離不同，從而達到分離鑒定各組分的目的。95影響電泳分離的因素1）緩沖液的pH

溶液的pH決定被分離物質(zhì)的解離程度、帶電性質(zhì)及所帶凈電荷量。若溶液pH＜pl，則蛋白質(zhì)帶正電荷，在電場中向負極移動。若溶液pH＞pl，則蛋白質(zhì)帶負電荷，向正極移動。溶液的pH離pl越遠，質(zhì)點所帶凈電荷越多，電泳遷移率越大。因此在電泳時，應(yīng)根據(jù)樣品性質(zhì)，選擇合適的pH值緩沖液。10DNA是兩性解離分子，在pH8.0-8.3時,由于磷酸基團全部解離,使DNA分子帶負電荷,在電場的作用下向正極遷移。不同大小和構(gòu)型各異的DNA分子的電荷密度大致相同，在自由泳動時，各分子的遷移率區(qū)別很小。但在采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)（瓊脂糖）作為電泳支持物時，因其具有分子篩的功能，使得分子大小和構(gòu)型不同DNA分子遷移率出現(xiàn)較大差異，從而達到分離的目的。蛋白質(zhì)電泳的緩沖液一般pH6.7，此時蛋白質(zhì)都帶負電，同樣都向正極移動。常用核酸和蛋白質(zhì)電泳緩沖液pH值112）離子強度電泳緩沖液通常要保持一定的離子強度；離子強度過低，則緩沖能力差，不易維持pH恒定離子強度過高，在待分離分子周圍形成較強的帶相反電荷的離子擴散層（即離子氛,ionicatmosphere），降低了蛋白質(zhì)的帶電量，使電泳速度減慢。12電場強度（V/cm）是每厘米的電位降，也稱電位梯度。電場強度越大，電泳速度越快。會造成電泳過程熱量增大，導(dǎo)致：

①樣品和緩沖離子擴散速度增加，引起樣品分離帶的加寬；②如果樣品對熱敏感，會引起變性失活；降低電場強度，可以減小生熱，但會延長電泳時間，引起待分離物的擴散。所以電泳實驗中要選擇適當(dāng)?shù)碾妶鰪姸?，同時可以適當(dāng)冷卻降低溫度以獲得較好的分離效果。4）電場強度：135）支持介質(zhì)的篩孔支持介質(zhì)的篩孔大小對的電泳遷移速度有明顯的影響。在篩孔大的介質(zhì)中泳動速度快。具體表現(xiàn)為電泳膠濃度不同。瓊脂糖聚丙烯酰氨2第二節(jié)瓊脂糖凝膠電泳對于分子量較大的樣品（如大分子核酸、病毒等），一般可采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣，尤其適于分離大片段DNA。瓊脂糖電泳的優(yōu)點（1）瓊脂糖凝膠含液體量大，可達98-99%，近似自由電泳，但是樣品的擴散度比自由電泳小。（2）電泳速度快。（3）透明而不吸收紫外線，可以直接用紫外檢測儀作定量測定。（4）樣品易回收，常用于制備。3DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖分離原理瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分辨范圍4瓊脂糖凝膠電泳的基本過程材料：電泳緩沖液（常用TAE或TBE）、電泳級瓊脂糖、溴化乙錠溶液（核酸顯示劑）、加樣緩沖液（保證核酸不在加樣孔中擴散和用于電泳時間的指示系統(tǒng)）、水平凝膠電泳裝置及制膠系統(tǒng)、直流電源系統(tǒng)。基本過程：制膠放入電泳槽中并加入電泳緩沖液取出梳子將適量的核酸樣品和上樣緩沖液混合并上樣于加樣孔中一定電