口腔粘膜細胞基因組制備

關(guān)于口腔粘膜細胞基因組制備第一頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日基因組DNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫、Southern雜交（包括RFLP）及PCR分離基因等。是一般的基因工程實驗中DNA操作的最初步驟。

一、基因組DNA的提取與純化目的：第二頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日核酸分離純化的總原則：

保證核酸一級結(jié)構(gòu)完整排除其它分子的污染：細胞內(nèi)：蛋白質(zhì)、脂類、糖、RNA等提取過程中：有機熔劑、金屬離子、外源DNA

第三頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日細胞樣品的核酸提取的主要步驟破碎細胞去除細胞內(nèi)的其它分子：蛋白質(zhì)多糖脂類去除鹽類、有機溶劑等雜質(zhì)第四頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日核酸提取注意事項減少化學(xué)因素對核酸的降解如過量酸堿減少物理因素對核酸的降解機械剪切力：強烈震蕩、滲透壓急劇改變、反復(fù)凍融高溫防止核酸的生物降解核酸酶的預(yù)防

第五頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日二、人基因組DNA的制備

實驗?zāi)康募耙饬x：從人口腔上皮細胞中提取純的基因組DNA掌握基因組DNA抽提的方法，理解核酸分離純化的基本原理第六頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日分離純化基因組DNA的常用方法：不同生物（植物、動物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同，分離方法也有差異。主要根據(jù)不同細胞的特點而有區(qū)別，但原理相似，因此它們有共同的步驟：

裂解細胞：SDS裂解細胞，EDTA抑制核酸酶

除去蛋白質(zhì)：蛋白酶K水解蛋白質(zhì)，酚和氯仿/異戊醇抽提、分離蛋白質(zhì)；析出DNA：乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。第七頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日實驗材料及試劑材料：人口腔上皮細胞試劑：抽提緩沖液：Tris-ClpH8.0，EDTA，NaCl，RNAase，SDS，蛋白酶K水飽和酚氯仿/異戊醇（V/V=24:1）75%乙醇、95%乙醇TE緩沖液：Tris，EDTA第八頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日主要試劑的功能抽提緩沖液：由SDS、EDTA、蛋白酶K組成SDS的作用是裂解細胞EDTA的作用是絡(luò)合掉鎂等二價金屬離子，防止DNA酶對DNA分子的降解作用。蛋白酶K的作用是水解蛋白質(zhì)。酚和氯仿/異戊醇：抽提分離蛋白質(zhì)乙醇：沉淀DNATE：溶解DNA第九頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日取材:用生理鹽水漱口后，口含生理鹽水10~15ml約2~3min，用15ml離心管（4000rpm

10min）收集細胞沉淀①

（離心機的使用，平衡）

加入0.5ml抽提緩沖液，重懸沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管

（微量移液器的正確使用）混勻，65℃溫育30min

加入等體積的飽和酚(0.5ml)，充分顛倒混勻（不要震蕩?。㏄13實驗步驟及注意事項（一人一組）：

第十頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日12000rpm5min②，上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管

（高速離心機的使用與安全意識）

加入等體積氯仿/異戊醇，顛倒混勻12000rpm5min，上層水相轉(zhuǎn)移到新的EP管

加入2倍體積95%的乙醇，顛倒混勻12000rpm10min

③

第十一頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日第十二頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日棄上清，沉淀中加入75%乙醇

12000rpm2min

④

輕輕棄去上清，打開EP蓋，室溫靜置5~10min

加入30l0.1×TE溶液，充分混勻后檢測結(jié)果

第十三頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日分子醫(yī)學(xué)實驗注意事項微量移液器的正確使用離心機的正確使用上課紀律撰寫實驗報告的規(guī)范第十四頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日實驗結(jié)果及其分析

定性分析：DNA瓊脂糖凝膠電泳PCR-SSCP多態(tài)性分析下次實驗課進行第十五頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日常見問題：

1、提取的DNA不純：變性不充分；關(guān)鍵過程反應(yīng)時間過短；離心時間或速度不夠。2、提取的DNA成涂布狀：操作過程中用力過猛，動作粗暴；操作系統(tǒng)有污染。