流式細(xì)胞術(shù)常見實(shí)驗(yàn)分析

——四種常見流式實(shí)驗(yàn)講解林奕婷2013年8月14日Guava流式細(xì)胞常見應(yīng)用分析當(dāng)前1頁，總共52頁。1.Guavaeasycyte8HT操作流程

2.四種常見流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)與分析DNA含量檢測(cè)與細(xì)胞周期分析胞內(nèi)活性氧水平的檢測(cè)與分析細(xì)胞表面分子的檢測(cè)與分析組合實(shí)驗(yàn)當(dāng)前2頁，總共52頁。1.Guavaeasycyte8HT操作流程

——Incyte模塊1.1開機(jī)-清洗（原則：先開儀器后開軟件，開機(jī)必清洗）1.2采集樣本1.3分析1.4關(guān)機(jī)（原則：先關(guān)軟件后關(guān)儀器，關(guān)機(jī)前必清洗）1.5日常維護(hù)當(dāng)前3頁，總共52頁。1.1清洗當(dāng)前4頁，總共52頁。1.2樣本采集editWL當(dāng)前5頁，總共52頁。當(dāng)前6頁，總共52頁。當(dāng)前7頁，總共52頁。1.3分析

見具體實(shí)驗(yàn)的分析。1.4關(guān)機(jī)當(dāng)前8頁，總共52頁。1.5日常維護(hù)保持空氣干燥，會(huì)使激光器的使用壽命長(zhǎng)一些。桌面不要有震動(dòng)，以免光路發(fā)生偏移。上機(jī)前檢查廢液瓶是否已滿，若已滿或?qū)M請(qǐng)倒掉，用超純水沖洗兩遍，放回原位；洗滌液瓶若已空或?qū)⒖照?qǐng)補(bǔ)滿（ICF：ddH2O=1：4）。實(shí)驗(yàn)臺(tái)面保持整潔，廢物缸請(qǐng)及時(shí)倒掉。自己的東西實(shí)驗(yàn)后請(qǐng)收走，流式專用的物品請(qǐng)不要帶走。做完請(qǐng)記得登記。每周在周一進(jìn)行一次easycheck。

（自己在做實(shí)驗(yàn)之前也可進(jìn)行easycheck，流程見下面。）當(dāng)前9頁，總共52頁。微珠：10μL（用前震蕩混勻）Buffer：190μLeasycheck當(dāng)前10頁，總共52頁。2.四種常見流式細(xì)胞術(shù)2.1細(xì)胞凋亡的檢測(cè)與分析2.1.1PI單染法2.1.2Annexin-Ⅴ-PI雙染法2.1.3線粒體膜電位法當(dāng)前11頁，總共52頁。凋亡啟動(dòng)凋亡早期凋亡晚期當(dāng)前12頁，總共52頁。2.1.1PI單染法正常細(xì)胞DNA含量：2n~4n凋亡細(xì)胞：核內(nèi)DNA斷裂，乙醇固定后膜通透性增加，小片段DNA穿膜丟失，胞內(nèi)DNA含量減少。PI染色后，熒光強(qiáng)度減小而形成一個(gè)DNA含量小于2n的分布區(qū)（亞G1峰）?；驹恚翰僮鞣椒ㄅc結(jié)果分析見細(xì)胞周期部分。當(dāng)前13頁，總共52頁。優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便，快捷，價(jià)廉，應(yīng)用普遍。缺點(diǎn)：當(dāng)前14頁，總共52頁。2.1.2Annexin-Ⅴ-PI雙染法基本原理：磷脂酰絲氨酸（PS）能與連接素Ⅴ（AnnexinⅤ）發(fā)生特異結(jié)合；PI是核酸熒光染料，不能透過正常細(xì)胞膜，只能進(jìn)入已經(jīng)破損的細(xì)胞膜。正常細(xì)胞：膜完整，PS不外翻——PI-/AnnexinⅤ-凋亡早期：膜完整，PS翻轉(zhuǎn)——PI-/AnnexinⅤ+凋亡晚期：PS外翻，膜通透性增加——PI+/AnnexinⅤ+壞死細(xì)胞：膜嚴(yán)重破損，PS不外翻——PI+/AnnexinⅤ+幾乎不存在膜結(jié)構(gòu)——PI+/AnnexinⅤ-當(dāng)前15頁，總共52頁。結(jié)果分析陰性對(duì)照PIPI/AnnexinⅤ-FITCAnnexinⅤ-FITC當(dāng)前16頁，總共52頁。熒光交疊熒光補(bǔ)償原理當(dāng)前17頁，總共52頁。熒光補(bǔ)償AnnexinⅤ-FITC單染當(dāng)前18頁，總共52頁。優(yōu)缺點(diǎn)：當(dāng)前19頁，總共52頁。2.1.3線粒體膜電位法基本原理：---++++++488nm590nm正常細(xì)胞線粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。JC-1：親脂性陽離子熒光染料，特異性地與線粒體內(nèi)膜結(jié)合，膜電位高時(shí)呈聚合體，膜電位低時(shí)呈單體。凋亡細(xì)胞-++488nm529nm當(dāng)前20頁，總共52頁。結(jié)果分析用488nm激發(fā)，黃光和綠光通道收集熒光信號(hào)，調(diào)補(bǔ)償糾正綠色熒光（單體）和黃色熒光（聚合物）的重疊部分。線粒體膜電位采用比例法，即根據(jù)綠色熒光與黃色熒光陽性百分率之比。Ratio=G.M./Y.M.比值升高，膜電位降低，膜受損。當(dāng)前21頁，總共52頁。2.2DNA含量檢測(cè)與周期分析2.2.1DNA倍體分析——PI染色法2.2.2S期特異性檢測(cè)2.2.3M期特異性檢測(cè)當(dāng)前22頁，總共52頁。2.2.1DNA倍體分析——PI染色法細(xì)胞周期與DNA含量變化極其FCM分析直方圖基本原理：當(dāng)前23頁，總共52頁。結(jié)果分析

——Guava原軟件分析Red-ARed-WRed-WRed-AHAW當(dāng)前24頁，總共52頁。在用第三方軟件分析之前，請(qǐng)將流式結(jié)果按如下所示導(dǎo)出。當(dāng)前25頁，總共52頁。結(jié)果分析

——Modfit軟件分析當(dāng)前26頁，總共52頁。結(jié)果分析

——Modfit軟件分析當(dāng)前27頁，總共52頁。圖片拷貝：直接Ctrl+C當(dāng)前28頁，總共52頁。結(jié)果分析

——Flowjo軟件分析當(dāng)前29頁，總共52頁。當(dāng)前30頁，總共52頁。當(dāng)前31頁，總共52頁。2.2.2S期特異性檢測(cè)S期DNA合成期，S期的比例增多往往與細(xì)胞分裂的活躍程度相關(guān)。傳統(tǒng)的PI染色可以通過DNA的倍增區(qū)分G1期與G2/M期。S期則因界限不明顯，難以區(qū)分。若需要準(zhǔn)確的統(tǒng)計(jì)S期的變化，需要加入S期的特異性標(biāo)志，即BrdU。BrdU只在DNA合成時(shí)被摻入核酸，是指示DNA復(fù)制的金標(biāo)準(zhǔn)。因此可通過BrdU-AlexFluor?488與PI復(fù)染將S期準(zhǔn)確的區(qū)分開來。當(dāng)前32頁，總共52頁。2.2.3M期特異性檢測(cè)G2期是指DNA合成后期，M期是細(xì)胞分裂期。二者在細(xì)胞周期事件中所處的時(shí)項(xiàng)不同，所表示的生物學(xué)意義也大不相同。準(zhǔn)確檢測(cè)M期的變化對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及癌癥的研究相當(dāng)重要。M期的檢測(cè)標(biāo)志是絲氨酸磷酸化組蛋白H3(pH3)。當(dāng)細(xì)胞周期從G2期轉(zhuǎn)換到M期時(shí)，染色質(zhì)上的組蛋白H3Ser10發(fā)生磷酸化，并在有絲分裂后快速的去磷酸化。由此組蛋白H3的絲氨酸磷酸化變化將停留在G2期的細(xì)胞與M期的分裂細(xì)胞區(qū)分開來。當(dāng)前33頁，總共52頁。2.3胞內(nèi)活性氧水平的檢測(cè)與分析DCFH-DA單染法DCFH-DADCFHROSDCFDCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)酯酶作用下脫去二脂形成不發(fā)熒光的DCFH，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在H2O2，O2-，OH-等ROS時(shí)被氧化成發(fā)綠色熒光的DCF。當(dāng)前34頁，總共52頁。注意事項(xiàng)：當(dāng)前35頁，總共52頁。（1）陰性細(xì)胞群（峰）和陽性細(xì)胞群（峰）分群明顯結(jié)果分析

——數(shù)據(jù)分析中幾種常見圖形及分析原則分析原則：根據(jù)陰性對(duì)照界定陰性置信區(qū)；允許陰性對(duì)照非特異性熒光信號(hào)（假陽性率）一般小于1%~5%；可記錄陽性細(xì)胞百分率或平均熒光強(qiáng)度。當(dāng)前36頁，總共52頁。（2）樣本管與陰性對(duì)照管峰形重疊樣本管峰形左側(cè)右移，右側(cè)有肩峰，弱陽性的樣本常出現(xiàn)此類圖形。分析原則：根據(jù)陰性對(duì)照界定陰性置信區(qū)，陰性置信區(qū)應(yīng)設(shè)在兩曲線分離處；可記錄陽性細(xì)胞百分率（近似值）或平均熒光強(qiáng)度或弱陽性；允許陰性對(duì)照非特異性熒光信號(hào)（假陽性率）高些，但陽性細(xì)胞百分率（近似值）應(yīng)減去假陽性率。當(dāng)前37頁，總共52頁。樣本管峰形整體右移。在排除非特異性染色的情況下（如設(shè)置嚴(yán)格的對(duì)照、調(diào)節(jié)抗體濃度等），方能進(jìn)行分析。分析原則：不可根據(jù)陰性對(duì)照界定陰性置信區(qū)；可記錄平均熒光強(qiáng)度，不可記錄陽性細(xì)胞百分率。當(dāng)前38頁，總共52頁。（3）同時(shí)出現(xiàn)弱陽性峰與強(qiáng)陽性峰的組合圖形分析原則：根據(jù)陰性對(duì)照界定陰性置信區(qū)，陰性置信區(qū)可設(shè)在兩曲線分離處。陽性細(xì)胞既含弱陽性細(xì)胞又含強(qiáng)陽性細(xì)胞，但陽性細(xì)胞百分率應(yīng)減去假陽性率；界定先可設(shè)在弱陽性返回基線處，陽性細(xì)胞僅表示強(qiáng)陽性細(xì)胞；可記錄陽性細(xì)胞百分率或平均熒光強(qiáng)度。當(dāng)前39頁，總共52頁。2.4細(xì)胞表面分子的檢測(cè)與分析2.4.1免疫學(xué)檢測(cè)2.4.2干細(xì)胞分析當(dāng)前40頁，總共52頁。2.4.1免疫學(xué)檢測(cè)當(dāng)前41頁，總共52頁。數(shù)據(jù)分析當(dāng)前42頁，總共52頁。2.4.2腫瘤干細(xì)胞分析當(dāng)前43頁，總共52頁。當(dāng)前44頁，總共52頁。MCF-7negativecontrol MCF-7CD24 MCF-7CD44 MCF-7CD24/CD440.08%0.03%89.8%5.35%當(dāng)前45頁，總共52頁。側(cè)群細(xì)胞當(dāng)前46頁，總共52頁。細(xì)胞周期特異性凋亡檢測(cè)：AnnexinⅤ染色后用透膜固定劑固定，然后加入PI進(jìn)行DNA染色。2.5組合實(shí)驗(yàn)當(dāng)前47頁，總共52頁。