重組DNA技術(shù)的基本工具課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第3章基因工程1.基因是什么？2.基因的功能是什么？基因通過(guò)控制蛋白質(zhì)的合成，直接或間接控制生物的性狀。轉(zhuǎn)錄DNAmRNA蛋白質(zhì)翻譯（RNA聚合酶）——體現(xiàn)相關(guān)的生物性狀知識(shí)回顧——基因基因是有遺傳效應(yīng)的DNA片段。①DNA中文全稱:

②組成元素:

③基本單位:

脫氧核糖核酸CHONP脫氧核糖核苷酸=磷酸+脫氧核糖

+含氮堿基脫氧核糖含氮堿基磷酸1′4′3′2′5′ATGC脫氧核苷酸(4種)知識(shí)回顧——DNA鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸胞嘧啶脫氧核苷酸

胸腺嘧啶脫氧核苷酸腺嘌呤脫氧核苷酸脫氧核糖A磷酸脫氧核糖G磷酸脫氧核糖T磷酸T磷酸脫氧核糖C磷酸脫氧核糖A磷酸脫氧核糖氫鍵磷酸二酯鍵脫氧核苷酸如何鏈接成脫氧核苷酸鏈的呢？知識(shí)回顧——DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)知識(shí)回顧——DNADNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：5’3’3’5’知識(shí)回顧——DNA②

和

交替連接，排列在外側(cè)，構(gòu)成

；

排列在內(nèi)側(cè)。③兩條鏈上的堿基通過(guò)

連接成堿基對(duì)，且遵循

。①DNA是由兩條單鏈組成的，這兩條鏈按

方式盤(pán)旋成雙螺旋結(jié)構(gòu)。反向平行脫氧核糖磷酸堿基基本骨架氫鍵堿基互補(bǔ)配對(duì)原則……ATGCCGTGGAATTCC…………TACGGCACCTTAAGG……①②①磷酸二酯鍵②氫鍵簡(jiǎn)圖：知識(shí)回顧——DNA操作環(huán)境及操作對(duì)象原理操作水平結(jié)果體外環(huán)境；基因分子水平概念基因工程基因重組賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品

基因工程是指按照人們的愿望，通過(guò)轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫作重組DNA技術(shù)。這種技術(shù)是在生物體外，通過(guò)對(duì)DNA分子進(jìn)行人工“剪切”和“拼接”，對(duì)生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無(wú)性繁殖，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物。不同種生物的基因能“拼接”的理論基礎(chǔ)：①DNA都是由4種脫氧核苷酸組成目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)原因：地球上所有的生物共用一套密碼子。②雙鏈DNA空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)基因工程的優(yōu)點(diǎn)：①定向改造生物遺傳性狀②克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙

番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵襲。當(dāng)番木瓜被這種病毒感染后，產(chǎn)量會(huì)大大下降?？茖W(xué)家通過(guò)精心設(shè)計(jì)，用“分子工具”培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒。DNA雙螺旋的直徑只有2

nm,對(duì)如此微小的分子進(jìn)行操作，是一項(xiàng)非常精細(xì)的工作，更需要專門(mén)的“分子工具”。那么，科學(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？準(zhǔn)確切割DNA分子將DNA片段連接起來(lái)“分子手術(shù)刀”“分子縫合針”“分子運(yùn)輸車(chē)”將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞

第1節(jié)

重組DNA技術(shù)的基本工具“分子手術(shù)刀”限制性內(nèi)切核酸酶DNA連接酶基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體“分子縫合針”“分子運(yùn)輸車(chē)”01限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”

1、來(lái)源：主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的一類酶。2、作用：①識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，②并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。*確切來(lái)說(shuō)應(yīng)該是催化磷酸二酯鍵斷開(kāi)*該過(guò)程“特定”體現(xiàn)了酶的專一性*限制酶只切割兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。3.識(shí)別序列

大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由___個(gè)核苷酸組成，也有少數(shù)限制酶的識(shí)別序列由___個(gè)、___個(gè)或__________的核苷酸組成。648其他數(shù)量EcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’BamHⅠ5’…G-G-A-T-C-C…3’3’…C-C-T-A-G-G…5’TaqⅠ5’……T-C-G-A……3’3’……A-G-C-T……5’*限制酶所識(shí)別的序列的特點(diǎn)是：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列。EcoRⅠ屬名Escherichia首字母種名coli前兩個(gè)字母R型菌株從中分離的第一個(gè)限制酶資料卡限制酶的命名例如：流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)d株中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindIHindIIHindIII4.切割結(jié)果

DNA分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式——________和_______黏性末端平末端（1）實(shí)例1——EcoRⅠ限制酶切割*EcoRⅠ識(shí)別序列為GAATTC*EcoRⅠ切割部位為GA之間的磷酸二酯鍵黏性末端黏性末端*形成的黏性末端（從5’往3’讀）為_(kāi)_________*一個(gè)限制酶切割一次形成_______個(gè)黏性末端*同一種限制酶切割形成的黏性末端_________*兩個(gè)黏性末端有__________個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。AATT-兩相同2（2）實(shí)例2——SmaⅠ限制酶切割*SmaⅠ識(shí)別序列為CCCGGG*SmaⅠ切割部位為CG之間的磷酸二酯鍵平末端現(xiàn)學(xué)現(xiàn)用：寫(xiě)出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ________EcoRⅠ________HindⅢ________BglⅡ________GATC-AATT-AGCT-GATC-思考：你從中發(fā)現(xiàn)什么現(xiàn)象了？不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端現(xiàn)學(xué)現(xiàn)用：以下黏性末端是由__種限制酶作用產(chǎn)生的3思考：你從中發(fā)現(xiàn)什么現(xiàn)象了？相同的黏性末端也可能是由不同限制酶作用形成的1.你能根據(jù)所掌握的知識(shí)，推測(cè)限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么嗎？提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制。限制酶就是它的一種防御性工具。當(dāng)外源DNA入侵時(shí)，它會(huì)利用限制酶來(lái)切割外源DNA，使之失效，以保證自身的安全。2.為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA?提示：微生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，可以將外源入侵的DNA降解掉。生物在長(zhǎng)期的演化過(guò)程中，含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開(kāi)。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶，也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。拓展思維：1.要想從一個(gè)DNA分子中獲得某個(gè)特定的基因需要有幾個(gè)酶切位點(diǎn)？產(chǎn)生幾個(gè)末端？

24CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAGGGCATCTTAAAATTCCGTAGCTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTCTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATT使用EcoRⅠ酶剪切目的基因識(shí)別序列GAATTCGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGAATTCGGCTTAA用同種限制酶切割(EcoRⅠ)拓展思維：2.把兩種來(lái)源不同的DNA進(jìn)行重組，應(yīng)該怎樣處理？

缺口怎么辦？種類E·coli

DNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源作用相同點(diǎn)大腸桿菌T4噬菌體只能將具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段連接起來(lái)既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端（但連接平末端的效率相對(duì)較低）恢復(fù)的都是磷酸二酯鍵02DNA連接酶——“分子縫合針”1.DNA連接酶作用2.基因工程常用的DNA連接酶有兩種：將雙鏈DNA片段“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵，形成重組DNA分子。兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來(lái)可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，注意：DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的兩條單鏈缺口，但不能連接單鏈DNA！E·coliDNA連接酶的縫合作用AATT

GCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶旁欄思考：DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的核苷酸鏈上，形成磷酸二酯鍵DNA聚合酶作用示意圖：DNA連接酶DNA連接酶ATAGTCCGAATT連接兩個(gè)DNA片段DNA連接酶作用示意圖：歸納總結(jié)3.DNA連接酶和DNA聚合酶的比較比較項(xiàng)目DNA連接酶DNA聚合酶相同點(diǎn)作用實(shí)質(zhì)不同點(diǎn)模板作用對(duì)象作用結(jié)果 都能催化形成____________不需要________________作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的核苷酸鏈上，形成磷酸二酯鍵在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵需要DNA的一條鏈4.DNA連接酶、DNA聚合酶、限制酶、解旋酶的比較種類作用作用部位DNA連接酶DNA聚合酶限制酶DNA酶解旋酶連接兩個(gè)DNA片段形成磷酸二酯鍵將單個(gè)的脫氧核苷酸連接的已有的核苷酸鏈上形成磷酸二酯鍵①識(shí)別特定脫氧核苷酸序列②有特定的切割位點(diǎn)破壞磷酸二酯鍵催化DNA水解為脫氧核苷酸破壞磷酸二酯鍵解開(kāi)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞氫鍵下圖為DNA分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化，圖中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用的正確順序是：（）A.①②③④B.①④②③C.①②④③D.①④③②B學(xué)以致用據(jù)圖所示,有關(guān)工具酶功能的敘述不正確的是A.限制性核酸內(nèi)切酶可以切斷a處,DNA連接酶可以連接a處B.DNA聚合酶可以連接a處C.解旋酶可以使b處解開(kāi)D.連接c處的酶可以為DNA連接酶D1.最常用的載體——質(zhì)粒:一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。03基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”有多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)DNA分子復(fù)制的起點(diǎn)保證插入目的基因大量復(fù)制特殊的標(biāo)記基因作用：鑒別和篩選含有目的基因的受體細(xì)胞抗生素的抗性基因、綠色熒光基因等作為標(biāo)記基因。2.載體需具備的條件擬核質(zhì)粒大腸桿菌氨芐青霉素抗性基因目的基因復(fù)制起點(diǎn)（1）能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保存并自我復(fù)制。（2）有一個(gè)至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便插入（攜帶）目的基因。（3）具有某些標(biāo)記基因，以便鑒定和篩選出含目的基因的受體細(xì)胞。（4）對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)害。3.其他載體擬核質(zhì)粒大腸桿菌氨芐青霉素抗性基因目的基因復(fù)制起點(diǎn)在基因工程中使用的載體除質(zhì)粒外，還有噬菌體、動(dòng)植物病毒等。它們的來(lái)源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別。在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)人工改造的。農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上多種限制酶，已知其中HindⅢ、BamHⅠ和BglⅡ識(shí)別的序列和切點(diǎn)分別是-A↓ACGTT-和-G↓GATCC-和-A↓GATCT-，請(qǐng)回答下列問(wèn)題。小試牛刀（2）在DNA連接酶的作用下，用限制酶HindⅢ、BamHⅠ切割后形成的黏性末端能否連接起來(lái)？為什么？不能，因?yàn)樗鼈冃纬绅ば阅┒瞬煌＃?）請(qǐng)嘗試寫(xiě)出限制酶作用后形成的黏性末端。(3)若改用限制酶BamHⅠ和BglⅡ切割后，用DNA連接酶能否起來(lái)呢？能（4）DNA連接酶是將兩個(gè)黏性末端的堿基連接嗎？不是。不能。（3）若用限制酶BamHⅠ和BglⅡ切割后，在DNA連接酶作用下形成重組DNA能否再被這兩種酶所識(shí)別和切割？（提示兩種酶識(shí)別序列和切割位點(diǎn)-G↓GATCC-和-A↓GATCT-）是恢復(fù)兩個(gè)DNA片段之間的磷酸二酯鍵。（1）能不能使用SmaⅠ限制酶切割用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒？為什么？圖1、2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：不能，SmaⅠ會(huì)破壞質(zhì)粒上抗性基因和目的基因能力提升（2）某科學(xué)工作者用EcoRⅠ切割目的基因和載體，發(fā)現(xiàn)很難得到需的的重組質(zhì)粒，請(qǐng)你幫助他分析原因？載體-載體連接物目的基因-載體連接物（重組DNA）

目的基因-目的基因連接物出現(xiàn)目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化、任意連接。（3）如果是你是科學(xué)家，能給出什么建議？說(shuō)出你的理由。避免目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化和反向連接，從而保證目的基因和質(zhì)粒的定向連接。BamHⅠ和HindⅢ選擇限制酶的方法：②應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶①不能選擇位于目的基因和標(biāo)記基因內(nèi)部的限制酶如SamⅠ因?yàn)樵撁钙茐哪康幕蚝蜆?biāo)記基因③為了避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和任意連接，使用不同的限制酶（形成的不同黏性末端）如圖甲選擇BamHⅠ和HindⅢ(要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶）小結(jié)若要利用某目的基因(見(jiàn)圖甲)和P1噬菌體載體(見(jiàn)圖乙)構(gòu)建重組DNA(見(jiàn)圖丙)，限制性