手性色譜分析

關于手性色譜分析2023/3/22第一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22手性的概念：一種鏡像反射的對稱性MirrorImageMirrorImage第二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22手性分子：組成相同但空間結構上互成鏡像的分子，稱之為對映異構體。分子結構中含有不對稱碳原子是最常見的手性結構。根據(jù)對偏振光的作用不同可分為R、S體，兩者的等量混合物稱之為消旋體。

第三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22手性異構體在藥理學效應上的差異Pfeiffer規(guī)則：對映異構體之間的生物活性存在著差異；不同的對映體之間活性的差異是不同的；當手性藥物的有效劑量越低，即藥效強度越高時，則對映體之間的藥理作用的差別越大。外消旋體和其兩種單一對映體是不同的3種實體！第四頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22對映體與生物大分子的三點作用手性分子的a、b、c三個基團與受體分子的活性作用點、、結合，是高活性對映體（優(yōu)映體）。手性分子的a、b、c三個基團中只有a和b與受體分子的活性作用點和結合，是低活性對映體（劣映體）。第五頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22

在未研究清楚兩種單一對映體之間的生物學差異時，以消旋體給藥往往會影響藥物質量，甚至會嚴重損害人體健康?！胺磻！?Thalidomide)作為人工合成藥，當時投入使用時是兩種對映體的混合物。

第六頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22

反應停：五十年恩怨第七頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22手性藥物的現(xiàn)狀臨床藥物1850種天然和半合成藥物523種化學合成藥物1327種非手性6種手性517種非手性799種手性528種以單個對映體給藥509種以外消旋體給藥8種以單個對映體給藥61種以外消旋體給藥467種第八頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22發(fā)展趨勢：

劣映體本身或其代謝物產生毒副作用，不再使用外消旋體。外消旋體轉換成單一對映體，不僅提高質量，還延長藥物壽命。

如：氧氟沙星的左旋異構體活性更強，左旋氧氟沙星臨床使用劑量是消旋體的一半。第九頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22手性拆分（Chiralresolution）對映體除了偏振光的偏轉方向不同外，其它理化性質完全相同，因而分離難度大。手性色譜拆分方法：創(chuàng)造（或引入）手性環(huán)境，構造非對映異構體，使藥物對映體間呈現(xiàn)理化特性的差異，從而實現(xiàn)藥物對映體的色譜分離。.第十頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22含多個手性碳原子化合物，分子中所含手性碳越多，對映異構體的數(shù)目越多。對映體對映體非對映異構體第十一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22手性高效液相色譜法（ChiralHPLC)

手性衍生化試劑法（CDR）（分析物）手性固定相法（CSP）（固定相）手性流動相添加法（CMP）（流動相）第十二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22手性試劑衍生化法（CDR）原理：光學活性藥物與有高光學純度的手性試劑于柱前衍生化，在藥物對映體中引入另外一個手性，形成非對映異構體，再以HPLC分析。第十三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22手性反應注意事項手性試劑為高光學純度試劑，光學穩(wěn)定性好：異硫氰酸酯（ITC）、異氰酸酯（IC）類：氨基酸羧酸衍生物：胺類、醇類胺類：羧基化合物。手性待測物必須具備反應活性基團，如胺基（-NH2），醇基（-OH），羧基（-COOH），以保證與CDR反應完全；生成的非對映體光學穩(wěn)定，柱效要高，能有效檢測。第十四頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22異硫氰酸酯（ITC）、異氰酸酯（IC）類常用試劑有苯乙基異氰酸酯（PEIC）、2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖異硫氰酸酯（GITC）。與大多數(shù)醇類和胺類化合物反應，形成相應氨基甲酸酯或脲的非對映異構體。廣泛應用于氨基酸及其衍生物、麻黃堿類、腎上腺素類、腎上腺素拮抗劑、兒茶胺類等藥物的分離分析。第十五頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22GITC衍生化分離胺類對映異構體反應原理

在三乙胺存在條件下進行，于乙腈、二氯甲烷或DMF中進行。第十六頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22色譜分離和前處理條件優(yōu)化流動相組成和流動相pH對拆分的影響（1）降低甲醇含量改善分離度，保留時間增加；（2）未衍生化的羧酸基對pH值比較敏感。衍生化時間及GITC用量的優(yōu)化

（1）反應時間：10min~30min（2）用量：過量兩倍

第十七頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22手性拆分結果色譜條件：C18色譜柱，流動相：甲醇∶1%三乙基乙二氨四乙酸TEAA緩沖（pH=5.5），檢測波長254nm；1ml/min。前處理：藥物溶于含三乙胺乙腈水溶液，取50μl該溶液，加入50μl含2g/LGITC的乙腈溶液，混合均勻后室溫下放置10min~30min，進樣分析。第十八頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22拉貝洛爾的GITC衍生化第十九頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22第二十頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22不同結構的藥物衍生化策略胺基類手性藥物：運用異硫氰酸酯（ITC）、異氰酸酯（IC）類、手性酰氯、磺酰氯類試劑，將其衍生化為酰胺、氨基甲酸酯、脲、硫脲和磺酰胺。羧基類手性藥物：運用手性胺類衍生化試劑，將其衍生化為酯和酰胺。醇類手性藥物：運用手性酰氯、磺酰氯類試劑，將其衍生化成酯。烯類手性藥物：衍生化成水性鉑復合物。第二十一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22手性固定相法（CSP）原理：將手性試劑化學鍵合到固定相上與藥物對映體反應形成暫時的非對映體對復合物，這種固定相稱作CSP。在CSP表面所形成的非對映體對，可根據(jù)其穩(wěn)定常數(shù)不同而獲得分離。（三點結合模型）第二十二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22●對映體和手性固定相之間，至少需要三個同時發(fā)生的分子間相互作用力起作用，而其中至少有一個必須是立體化學相互作用。●手性選擇劑與對映體中的一種進入一個與立體相關的三點相互作用的穩(wěn)定狀態(tài)，而另一對映體則只能兩點作用形成不穩(wěn)定狀態(tài)?！襁@種穩(wěn)定性相差越大，則相互分離的可能性就越大?！叭c相互作用”Y為S性手性選擇劑，X為外消旋體第二十三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22手性固定相吸附型電荷轉移型蛋白質類環(huán)糊精類多糖衍生物反相、防有機溶劑正相、防水正、反相均可第二十四頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22蛋白質類手性固定相

將蛋白質固定到硅膠上，利用蛋白質分子結構中的L-氨基酸提供手性作用位點與手性藥物對映體產生不同的氫鍵作用、靜電作用、疏水作用、離子對作用等達到手性拆分。常用流動相為磷酸鹽緩沖液（pH4~7），流動相中可加入不超過5%有機溶劑。第二十五頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22分類白蛋白柱（HSA、BSA）糖蛋白柱：α1-酸糖蛋白柱（α1-

AGP

）酶類第二十六頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22α1-酸糖蛋白柱拆分西酞普蘭對映異構體色譜柱為Chiral-AGP柱（150mm×4.0mm，5μm）柱溫為25℃；流動相為50mmol/L醋酸銨緩沖液（乙酸調pH至4.1），流速0.8ml/min；檢測波長為240nm。第二十七頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22纖維素的單體D-葡萄糖以β-1,4-糖苷鍵相連而成的線型聚合物，將羥基衍生化成酯以增強手性識別能力。由于水和鹵代烴都能溶解纖維素及其衍生物，故流動相大都為正相色譜系統(tǒng)，使用極性較小的非鹵代烴有機溶劑。多糖及其衍生物類手性固定相第二十八頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22纖維素固定相手性識別作用手性中心附近帶有羰基的外消旋化合物與纖維素衍生物通過偶極－偶極作用，帶有羧基、羥基或氨基的外消旋化合物通過氫鍵發(fā)生手性識別作用。

第二十九頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22直鏈淀粉是D-葡萄糖以α-1,4-糖苷鍵相連而成的線型聚合物，和纖維素的手性識別能力的不同，主要在于其葡萄糖單元的構象差異。第三十頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22最常用的多糖型手性色譜柱（Daicel，大賽璐

）

淀粉柱：ChiralpakAD、ChiralpakAS、纖維素柱：ChiralcelOD、ChiralcelOJ第三十一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22CHIRALPAKAD系列直鏈淀粉-三[3,5-二甲苯基氨基甲酸酯]衍生物；用于分離胺類、酯類化合物CHIRALPAKAS系列直鏈淀粉-三[(S)-α-甲苯基氨基甲酸酯]衍生物；適合于分離β-內酰胺類、環(huán)氧化物、酸類、雜環(huán)類化合物化合物。CHIRALCELOD系列纖維素-三[3,5-二甲苯基氨基甲酸酯]衍生物；適用于分離β-受體阻滯劑、具有相同功能的化合物、類固醇類化合物，如：阿普羅爾、美托洛爾、氧烯洛爾。（芳氧丙醇胺類）CHIRALCELOJ系列纖維素-三[4-甲基苯甲酸酯]衍生物；被用于分離布洛芬、氯胺酮等藥物，以及在手性中心含有一個大的取代基的化合物第三十二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22ChiralcelOD固定相分離美托洛爾對映體第三十三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22Chiralcel?OD-H手性色譜柱（4.6mm×250mm），流動相為正己烷－異丙醇－二乙胺（65∶35∶0.1）；流速為0.5ml/min；紫外檢測波長為259nm；柱溫為25℃；進樣體積為20μl。

第三十四頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22環(huán)糊精類（包容色譜）

D-葡萄糖單元通過α-1,4-糖苷鍵連接的環(huán)狀分子結構，其疏水性內腔的包容作用和腔外上的羥基與藥物對映體的氫鍵作用是手性識別的基礎。有α、β、γ三種類型，其中β環(huán)糊精及其衍生物應用范圍最為廣泛。第三十五頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22環(huán)糊精手性固定相改性環(huán)糊精鍵合固定相機械強度差、不能在高壓下使用，用氨基、氨基甲酸酯等改性，形成疏水相互作用或π-π相互作用、偶極－偶極疊合作用，擴大了手性拆分的能力，又稱多模式手性固定相（multimodalCSP，MMCSP）。

第三十六頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22手性流動相添加法（CMPA）將手性試劑加到流動相中，利用下面兩種方式實現(xiàn)拆分：①流動相中手性試劑與對映體形成非對映體配合物，在固定相中的保留時間和分配不同而得到拆分；②手性試劑吸附在柱上形成動態(tài)的手性固定相，對映異構體與之作用不同而得到拆分。第三十七頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22環(huán)糊精手性固定相與流動相流動相添加環(huán)糊精法拆分時，與流動相中環(huán)糊精包合越好的對映體，隨流動相較快地被洗脫；環(huán)糊精固定相拆分時，與固定相中環(huán)糊精包合越好的對映體易被固定相所保留，較慢地被洗脫。以環(huán)糊精流動相分離對映體的洗脫順序與環(huán)糊精固定相拆分的順序剛好相反。第三十八頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22

影響分離的因素

有機溶劑：用量越少，保留時間越長，但是過高，則環(huán)糊精溶解度降低，顯著影響對映體的分離度。pH值

酸度增大，有利于堿性藥物的分離，對于酸性藥物影響無規(guī)律性。第三十九頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22分子結構（１）在其手性原子上均具有兩個環(huán)狀取代基或環(huán)內含有手性碳原子，而不能拆分的化合物在其手性碳原子上只含有一個環(huán)狀取代基。（２）空間效應對手性識別的影響更為顯著。（３）環(huán)糊精濃度增加有利于手性分離，但β-環(huán)糊精溶解度受限制。第四十頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22手性流動相HPLC法拆分萘普生對映體

優(yōu)化的流動相添加劑：(a)

L-脯氨酸、(b)

β-環(huán)糊精（β-CD）、(e)羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）(c、d)甲基-β-環(huán)糊精（Me-β-CD）

第四十一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22

流動相體系：乙醇∶水相（不同手性添加劑，1%三乙胺水溶液，pH為4.4）；HP-β-CD比甲基-β-CD拆分效果好第四十二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22色譜分離和前處理條件優(yōu)化有機相對拆分的影響（1）相比于乙腈，乙醇可以使保留時間縮短；（2）隨著乙醇體積分數(shù)的逐漸增大，其容量因子呈逐步減小的趨勢，分離因子和分離度也減小。

流動相中HP-β-CD濃度的優(yōu)化

（1）隨著HP-β-CD濃度的提高，容量因子迅速降低、分離因子增大。（2）過高時分離因子變化不大，使該條件下的流動相變渾濁。第四十三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22流動相pH值的優(yōu)化三乙胺含量的優(yōu)化柱溫的優(yōu)化最佳色譜分離條件為：25mol/LHP-β-CD、15%乙醇、體積分數(shù)0.5%三乙胺、pH3.5、柱溫25℃。第四十四頁，共五十頁，編輯于2023年，星期一2023/3/22手性離子對色譜法反離子(R)-B在流動相中處于未電離的形式，樣品為酸性外消旋體(R)-HA和(S)-HA，流動相中就能形成低極性不解離的非對映異構體的“離子對”，可以在正相色譜柱上進行分離。用于氨基醇類和胺類藥