核酸的生物合成PPT

關于核酸的生物合成PPT第一頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一

1、基因——DNA大分子上的各個功能片段，有復制、轉(zhuǎn)錄等功能。

2、分子生物學中心法則及其補充。DNA

RNA

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯復制反轉(zhuǎn)錄RNA翻譯蛋白質(zhì)復制第二頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一

3、基因表達——通過轉(zhuǎn)錄和翻譯、用基因的遺傳信息在細胞內(nèi)合成有功能意義的各種蛋白質(zhì)。由于中心法則的建立，人們對核酸、蛋白質(zhì)的研究更深入了，不僅研究它們的結(jié)構、功能、相互作用以及它們之間一套復雜、精確的調(diào)控機制、調(diào)控基因的表達與不表達；而且在體外可對DNA進行改造，使遺傳性狀改變或有目的地使基因表達產(chǎn)生蛋白質(zhì)等基因工程的應用?，F(xiàn)今，人們把研究蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構、功能以及它們之間相互作用的科學劃分為又一門新的學科，即分子生物學。第三頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一隨著分子生物學的進一步研究，將來對中心法則可能還會作出進一步補充。如RNA在中心法則中只是參與遺傳信息的表達，但在補充法則卻作為遺傳物質(zhì)；最近發(fā)現(xiàn)某些RNA分子具有酶活性。最近，有學者提出：RNA不單是溝通“DNA—蛋白質(zhì)”之間的橋梁。RNA可能是功能比DNA更廣泛的信息分子、可能是生命起源過程中最早出現(xiàn)的生物大分子。第四頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一本篇依中心法則將介紹復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯。同時介紹基因調(diào)控和基因工程這兩個在生命科學中處于理論和應用的最前沿課程。第五頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一

一、DNA復制方式1、DNA復制模式—半保留復制（1）復制——以親代DNA為模板，以四種dNTP

為原料，按堿基配對原則（A=T，G≡C）

合成子代DNA的過程。（2）DNA復制的特點之一：半保留復制第一節(jié)DNA的生物合成第六頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一半保留復制——DNA復制時，親代DNA的兩條鏈都作為模板，各自指導合成互補鏈，形成兩個與親代DNA完全一樣的子代分子，在每個子代DNA分子中均保留了一條親代DNA鏈，DNA這種復制方式被稱為半保留復制。第七頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一第八頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一第九頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一2、半不連續(xù)復制(1)岡崎片段和半不連續(xù)復制由于DNA雙鏈走向相反，而復制方向為5′→3′，模板方向一定為3′→5′，故必有一股新鏈其模板解鏈方向與復制方向一致，可以連續(xù)合成，稱為前導鏈；而另一股鏈其復制方向與解鏈方向相反，不能連續(xù)合成，稱為滯后鏈(或后隨鏈）。不連續(xù)合成的后隨鏈的一個個片段稱為岡崎片段。后隨鏈的復制是由引物酶分段生成RNA引物，然后在各段引物的基礎上分段延長的。第十頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一第十一頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一原核生物——總是從一個固定的起始點開始，在兩條模板上同時向兩個（相反）方向進行，稱雙向復制。真核生物——①雙向復制；②多點復制（有多個復制起始點，同時形成多個復制單位）。單向復制模式和雙向復制模式復制泡二、復制點（DNA復制的起始點和方向）第十二頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一三、DNA聚合反應有關的酶及相關蛋白因子1）引發(fā)酶作用——在模板的復制起始部位催化互補堿基的聚合，形成短片段RNA引物。其本質(zhì)為：RNA聚合酶（是一種不同于DDRP的RNA聚合酶）。2）引發(fā)體——為解鏈酶與其他復制因子結(jié)合辨認起始點時再結(jié)合引物酶形成引發(fā)體。[引發(fā)體≈解鏈酶+其它復制因子+引發(fā)酶]故引發(fā)體的作用是：辯認起始點，結(jié)合在DNA模板上，解開DNA雙鏈，催化RNA引物形成。3）引物為什么是RNA而不是DNA——依賴于DNA模板的DNA聚合酶簡稱DDDP，不能催化兩個游離的dNTP聚合，而RNA聚合酶能催化兩個游離的NTP聚合。1、RNA引物合成酶（引發(fā)酶）第十三頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一2、DNA聚合酶催化5′→3′的聚合反應：在引物上3′-OH未端逐個加入dNMP（由dNTP去除PPi生成），使新鏈不斷延長。反應需：

①模板，按A=T，G≡C合成新鏈。②引物，引物3′-OH和下一個dNMP在聚合酶催化下生成3′,5′-磷酸二酯鍵，通過3′,5′-磷酸二酯鍵將單個核苷酸連成長鏈。

③合成方向5′→3′，模板閱讀方向3′→5′。第十四頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一3、DNA連接酶1〉作用：連接DNA鏈3′-OH未端和另一DNA鏈的5′-P未端，使二者生成磷酸二酯鍵。如連接岡崎片段，DNA修復、重組、剪接中起缺口縫合等。2〉注意：連接酶連接的都是堿基互補基礎上的雙鏈中的單鏈缺口，不能連接單獨存在的DNA或RNA單鏈作用。第十五頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一4、解旋、解鏈酶類解開“超螺旋”，解開并理順模板DNA雙鏈，與SSB配合維持（模板部位）單鏈狀態(tài)?！锝怄溍福鹤饔茫航忾_DNA雙鏈。解鏈酶有兩種，一是

rep蛋白（解鏈酶I），沿模板3′→5′

移動。二是解鏈酶II，沿模板5′→3′移動。第十六頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一5、單鏈DNA結(jié)合蛋白（singlestrandedDNA-bindingProtein，SSB或DBP），曾稱螺旋反穩(wěn)定蛋白（HDP）作用：

①與解開的單鏈DNA結(jié)合，維持復制時模板處于單鏈狀態(tài)，防止復性。②對抗核酸酶水解單鏈DNA，保護單鏈完整性。

SSB可結(jié)合跨度為32個核苷酸單位，在DNA

解鏈中不斷結(jié)合，脫離再結(jié)合。第十七頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一6、DNA拓撲異構酶（拓撲酶）作用：松馳超螺旋，克服解鏈中出現(xiàn)的打結(jié)纏繞、連環(huán)現(xiàn)象。拓撲酶廣泛存在于真核細胞及原核細胞，可分為兩型：

〈1〉I型拓撲酶：切斷雙鏈DNA中的一段，待DNA松弛后可將切口接上。不需ATP。

〈2〉II型拓撲酶：有雙重作用水解作用——切斷雙鏈DNA某部位，松弛超螺旋。（不需ATP）接合作用——DNA松弛解纏后，連接斷口，并使

DNA進入負螺旋狀態(tài)（右旋；“負”比“正”有更好的模板作用）。（消耗ATP）第十八頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一DNA的復制過程1、起始1）辯認起始部位：由解鏈酶在DnaB起始蛋白協(xié)助下結(jié)合于復制起始點上。2）解開DNA雙鏈：在起始點進行，解鏈酶解開DNA雙鏈。需ATP（2ATP/bp）。3）拓撲酶（主要為II型）松解超螺旋，防止由于解鏈出現(xiàn)的下游打結(jié)及纏繞現(xiàn)象。第十九頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一4）SSB（單鏈DNA結(jié)合蛋白）結(jié)合于開放的單鏈上，穩(wěn)定和保護單鏈作用5）引發(fā)體中的引發(fā)酶按堿基配對規(guī)律合成RNA引物。（以DNA為模板按5′→3′方向合成。引物約含十幾~幾十個堿基、有3′-OH未端的RNA片段）。6）polIII的亞單位辯認引物。第一個脫氧核苷酸在該酶催化下加到引物3-OH未端上，形成磷酸二酯鍵。第二十頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一第二十一頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一復制叉形成

復制叉——無論原核或真核細胞，復制開始由于DNA雙鏈解開，在兩股單鏈上同時進行復制，在電鏡下均看到伸展成叉狀的復制現(xiàn)象。在引物生成后，復制叉的形狀已基本具備。復制的速度：細菌復制速度很快，2500bp/s，20分鐘可繁殖一代。真核生物復制速度慢些，但因其有多個復制始點，故總速度與原核差不多。第二十二頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一第二十三頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一2、復制的延長

由DNA聚合酶（原核polIII；真核DNA聚合酶）催化dNTP以DNA為模板，按堿基配對原則逐個加到新鏈中，鏈得以延長，新鏈合成方向5′→3′。第二十四頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一復制的速度：細菌復制速度很快，2500bp/s，20分鐘可繁殖一代。真核生物復制速度慢些，但因其有多個復制始點，故總速度與原核差不多。第二十五頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一Eukaryotic真核生物DNAreplicationProkaryote原核生物DNAreplication第二十六頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一（2）前導鏈和滯后鏈的合成

DNA雙鏈走向相反，模板方向為3′→5′，而復制方向5′→3′。

1）前導鏈：一股新鏈其模板解鏈方向與復制方向一致，可以連續(xù)合成，稱為Leadingstrand前導鏈；2）滯后鏈：另一股鏈其復制方向與解鏈方向相反，不能連續(xù)合成，稱為Laggingstrand滯后鏈。第二十七頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一3、復制的終止1）引物水解。由一種RNase將領頭鏈及岡崎片段的引物水解除去。2）修補空缺（引物水解后留下的空缺）。

①由DNA聚合酶催化（原核polI;真核DNA聚合酶β）；②修補方向也是5′→3′。3）連接。由DNA連接酶催化。①連接岡崎片段；②連接領頭鏈的主體與引物空缺修補小片段。第二十八頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一1、原核細胞DNA的復制（1）復制所需的條件（或稱“復制體系”）：1）底物：dNTP2）聚合酶：DNA聚合酶3）模板：模板DNA的雙鏈（即解開為單鏈狀態(tài)的兩條DNA母鏈）4）引物：DNA聚合酶不能催化兩個游離的dNTP互相聚合，需一引物。引物即為小分子RNA（含3′-OH的寡核苷酸）。5）其他酶和蛋白質(zhì)因子。如解旋酶、解鏈酶、DNA

連接酶等。三、原核生物中DNA的復制第二十九頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一（2）原核生物的DNA聚合酶為三種：

polIpolIIpolIII

含量最多最少活性見課本見課本見課本功用校讀、修復復制復制最主要的酶填補空缺核酸外切酶活性5′→3′+—+3′→5′+++第三十頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一※核酸外切酶活性。

〈1〉5′→3′外切酶活性：從5′端把核苷酸從核酸鏈上水解下來，polI、III具有。

〈2〉3′→5′外切酶活性：從3′端把核苷酸從核酸鏈上水解下來，polI、II、III

均具有。第三十一頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一

※核酸外切酶活性的作用是：

①即時校讀——DNA復制出現(xiàn)堿基配對錯誤時，DNA聚合酶利用外切酶活性（主要為3′→5′外切酶）清除錯配堿基，并利用5′→3′聚合酶活性補回正確配對堿基，這種功能稱之。主要由polI完成。

②切除引物、切除突變的片段——均為polI5′→3′外切酶的作用。第三十二頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一※復制的保真性（fidelity）

1、概念——DNA復制時DNA聚合酶依賴模板，保證遺傳信息傳代延續(xù)中子鏈與母鏈配對準確無誤，稱之。

2、保真機理

〈1〉遵守嚴格的堿基配對規(guī)律。聚合時，磷酸二酯鍵的形成應在氫鍵的準確搭配之后發(fā)生。

〈2〉聚合酶在復制延長中對堿基的選擇功能。如母鏈為T，酶能選擇A而不是其他。

〈3〉復制中出錯時有即時校讀功能（有錯即改）。第三十三頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一第三十四頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一原核生物DNA的復制過程：辯認起始部位：由解鏈酶在識別蛋白協(xié)助下結(jié)合于復制起始點上。解開DNA雙鏈：在起始點進行。解鏈酶解開DNA雙鏈。需ATP解開雙鏈并非解鏈酶單獨作用（2ATP/bp），可能構成引發(fā)體后再進行解鏈。

DNA旋轉(zhuǎn)酶或拓撲酶（主要為II型）松解超螺旋，防止由于解鏈出現(xiàn)的下游打結(jié)及纏繞現(xiàn)象。第三十五頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一單鏈結(jié)合蛋白SSB結(jié)合于開放的單鏈上，穩(wěn)定和保護單鏈作用引發(fā)體中的引發(fā)酶按堿基配對規(guī)律合成RNA引物。[以DNA為模板按5′→3′方向合成。引物約含十幾~幾十個堿基、有3′-OH未端]。polIII的亞單位辯認引物。第一個脫氧核苷酸在該酶催化下加到引物3-OH未端上，形成磷酸二酯鍵。第三十六頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一第三十七頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一四、真核生物中的DNA復制真核生物的DNA聚合酶為五種：1）DNA聚合酶αandδ主要復制

染色體DNA,DNA聚合酶α主要為滯后鏈的合成；DNA聚合酶δ主要為前導鏈的合成2）DNA聚合酶βandε主要為修復DNA,3）DNA聚合酶γ主要線粒體DNA復制和修復.第三十八頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一★端粒與端粒酶端粒：是真核細胞染色體末端一種膨大的、DNA富含GC重復序列的粒體結(jié)構。端粒酶：是一種由RNA和蛋白質(zhì)組成的能催化DNA合成的酶。這種合成以本身的RNA為模板。模板AGGGTTAC新鏈5’CCCAAUG(RNA片斷)端粒酶端粒DNApolymerase第三十九頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一3）在真核細胞，DNA復制的同時，各種染色體蛋白（組蛋白及非組蛋白）同時合成。一但DNA復制結(jié)束，即可裝配為核蛋白并組成染色體。第四十頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一五、反轉(zhuǎn)錄作用（RNA指導的DNA合成）DNARNA轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄RNA轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄主要從病毒中發(fā)現(xiàn)RNA指導的DNA聚合酶、其催化底物為dNTP，催化生成與RNA（作為模板）堿基序列互補的DNA；遺傳信息從RNA流向DNA。第四十一頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一〈一〉DNA突變突變的概念：由于理化因素使DNA組成改變，即DNA分子上的堿基改變，如未能完全修復而引起可遺傳的變異稱之。又稱基因突變。突變的原因有：自發(fā)突變和誘變：自發(fā)突變即遺傳過程“自發(fā)”地發(fā)生；誘變即用人工手段（理化因素：如紫外線、離子輻射、羥胺、亞硝酸鹽、氮芥類等。），使DNA發(fā)生突變。第二節(jié)DNA的損傷與修復第四十二頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一第四十三頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一（二〉突變的結(jié)果包括：

①致死性；②生物體內(nèi)某些功能喪失；

③只改變基因而對表現(xiàn)型無影響；

④產(chǎn)生了利于物種生存或有利于人類的結(jié)果。第四十四頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一〈三〉突變的類型：1、點突變：DNA分子上一個堿基的變異。又分為轉(zhuǎn)換和顛換：轉(zhuǎn)換即同型堿基的轉(zhuǎn)換；顛換即異型堿基（嘌呤與嘧啶）的轉(zhuǎn)換。2、缺失：一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA上消失。3、插入:一個堿基或一段核苷酸鏈插入到另一個DNA

分子上，缺失和插入均引起移碼突變（轉(zhuǎn)錄后密碼子改變）。4、倒位：DNA鏈內(nèi)部重組。其中一段方向反置，如從5′→3′變?yōu)?′→5′或一大段DNA分子在DNA分子內(nèi)遷移。第四十五頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一GAAGTAGCTGAGGTAGCT為點轉(zhuǎn)換突變GACCTAGCTGACTTAGCT為為點顛換突變GACGTAGCTGATAGCT為為缺失突變GACGTAGCTGACGCATAGCT為插入突變GACGTAGCTGACGATGCT為倒位突變第四十六頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一復制過程中發(fā)生DNA突變稱為DNA損傷，大多屬于自發(fā)突變。體內(nèi)靠校讀和修復機制消除已發(fā)生的缺陷。1、校讀：核內(nèi)polI有核酸外切酶活性，隨時把錯誤配對的核苷酸切除，并利用其DNA聚合酶活性補回正確的核苷酸。這種由polI監(jiān)視和糾正復制錯誤的功能稱校讀。二、損傷的修復第四十七頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一2、修復：如錯誤配對屢屢發(fā)生或涉及范圍大，則需一些機制來修復，包括：（1）、光修復：需光能激活的修復酶修復。如該酶可使因紫外線照射而形成的二聚體TT分解為原來的單體狀態(tài)。（2）、切除修復：需特異核酸內(nèi)切酶、polI、DNA連接酶的共同作用。這是人類DNA損傷的主要修復方式。第四十八頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一第四十九頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一第五十頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一第五十一頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一3、重組修復：適于損傷面積較大時。4、SOS修復：緊急修復，出現(xiàn)的錯誤多且廣泛。由于修復不完全，可引起較長期廣泛的突變。第五十二頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一第五十三頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一轉(zhuǎn)錄（DNA指導下的RNA合成）1、轉(zhuǎn)錄—生物體以DNA為模板，按堿基互補規(guī)律合成RNA的過程。把DNA的堿基序列抄錄成RNA的堿基序列。2、轉(zhuǎn)錄所需的條件：

〈1〉原料：NTP〈2〉模板：DNA雙鏈中的一股

〈3〉酶：RNA聚合酶，全稱為“依賴DNA的RNA聚合酶”（DNA-dependentRNApolymeraseDDRP），也稱轉(zhuǎn)錄酶。第三節(jié)RNA的生物合成一、概述第五十四頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一〈一〉原核生物的RNA聚合酶（以E.coli的酶研究比較透徹）

1、該酶由5個亞基組成：即α2ββ′б，其中б亞基易脫落。

2、核心酶：即α2ββ′，具有催化聚合功能，不能辯認起始點，但參與轉(zhuǎn)錄的延長。一、RNA聚合酶第五十五頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一

3、全酶；即α2ββ′б，既辯認轉(zhuǎn)錄起始點，又有催化聚合功能，參與轉(zhuǎn)錄起始。

4、各亞基的功能：

α亞基——決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄

β亞基——與轉(zhuǎn)錄全過程有關

β′亞基——結(jié)合DNA模板

б亞基——辯認起始點。σ亞基本身并無催化功能;它的作用是識別DNA分子上的起始信號。

第五十六頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一有三種類型：RNApolI、RNApolII、RNApolIII。

RNApolI轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為rRNA的前體（45S-rRNA）；

RNApolII轉(zhuǎn)錄mRNAD的前體（hnRNA）；

RNApolIII轉(zhuǎn)錄5S-rRNA，tRNA，snRNA（核RNA)前體。由于hnRNA為mRNA前體，而mRNA在各種RNA中壽命最短，最不穩(wěn)定，需經(jīng)常合成，故酶II被認為是最重要的酶。（二）真核RNA聚合酶第五十七頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一

1、啟動子是DNA分子可以與RNA聚合酶特異結(jié)合的部位，也就是使轉(zhuǎn)錄開始的部位。在基因表達的調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄的起始是個關鍵。常常某個基因是否應當表達決定于在特定的啟動子起始過程。

2、啟動子處的核苷酸順序具有特異的形狀以便與RNA聚合酶結(jié)合。

3、在RNA合成開始位點的上游大約10bp和35bp處有兩個共同的順序，稱為-10和-35序列。這兩個序列的共同順序如下：-35區(qū)“AATGTGTGGAAT”；-10區(qū)“TTGACATATATT”。大多數(shù)啟動子均有共同順序只有少數(shù)幾個核苷酸的差別。

4、啟動子中的－10和-35序列是RNA聚合酶所結(jié)合和作用必需的順序。

二、啟動子第五十八頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一第五十九頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一三、終止子

-10序列又稱為Pribnow盒(原核生物)。在真核生物中相應的序列位于-35bp處，稱為TATA盒，又稱為Goldberg-Hognessbox，是RNA聚合酶Ⅱ的結(jié)合部位。第六十頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一五、轉(zhuǎn)錄與復制的異同相同：①模板：DNA

②原料：三磷酸核苷酸

③遵守堿基配對規(guī)律

④模板閱讀方向：3′→5′；新鏈合成方向：5′→3′

⑤酶：依賴DNA的聚合酶

⑥產(chǎn)物：多核苷酸鏈第六十一頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一不同：

復制

轉(zhuǎn)錄模板DNA雙鏈DNA模板鏈原料dNTPNTP

配對A←→T，G←→CA→U，T→A，

G←→C

酶DDDPDDRP

產(chǎn)物子代DNA（半保留）RNA（mRNAtRNA、

rRNA等）引物小段RNA不需要引物第六十二頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一可分為起始、延長、終止三個階段

1、轉(zhuǎn)錄過程以DDRP全酶辯認并結(jié)合DNA模板而開始。

2、隨著酶的向前移動（→5′），轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA

不斷延長。

3、當轉(zhuǎn)錄酶到達終止信號處，酶與DNA模板分離、產(chǎn)物RNA脫落、轉(zhuǎn)錄即告結(jié)束。

4、真核生物的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物還需有“轉(zhuǎn)錄后加工”的過程。三、RNA的轉(zhuǎn)錄過程第六十三頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一第六十四頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一1、RNA聚合酶全酶辨認、結(jié)合到模板的啟動區(qū)在真核細胞還有一些特異調(diào)控DNA稱順式調(diào)控元件，還有一些辯認DNA的蛋白質(zhì)稱反式調(diào)控因子共同參與轉(zhuǎn)錄起始過程。（一）轉(zhuǎn)錄的起始第六十五頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一2、解開DNA雙鏈，形成“轉(zhuǎn)錄空泡”。

1）較早認為RNA聚合酶與DNA結(jié)合后，“擠入”雙螺旋結(jié)構之內(nèi)，使DNA解鏈，不需其他輔助因子。目前認為拓撲酶II也參與作用，形成負超螺旋，有利于轉(zhuǎn)錄。

2）解鏈的范圍不大（10—20bp）——形成轉(zhuǎn)錄空泡。第六十六頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一第六十七頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一3、起動復合物形成，轉(zhuǎn)錄開始：不需引物，RNA聚合酶在起始部位催化兩個核苷酸形成磷酸二酯鍵。第一個核苷酸常為GTP，GTP與隨后的NTP生成

PPPGPN′-OH，仍保留三磷酸鳥苷狀態(tài)。因此常把[RNA聚合酶全酶-DNA-PPPGPN′

-OH]稱為轉(zhuǎn)錄的起始復合物。4、б因子從全酶脫落，可重復利用。第六十八頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一第六十九頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一

1、核心酶沿著模板滑動，催化四種NTP按堿基配對原則生成長的核苷酸鏈，方向5′→3′。核心酶經(jīng)過后，DNA雙鏈復合為雙螺旋，RNA鏈與模板分離。

2、因同一DNA上可多位點同時轉(zhuǎn)錄；又因DNA—DNA較DNA—RNA結(jié)構穩(wěn)定，故RNA易被排斥分離，在電鏡下，同一DNA模板上，長短不一的RNA鏈散開成羽毛狀圖形。

3、同時將轉(zhuǎn)錄過程形成的“酶-DNA-RNA”復合物稱為轉(zhuǎn)錄復合物。

4、對于較長的mRNA，可一邊轉(zhuǎn)錄、一邊與核糖體結(jié)合而開始“翻譯”過程。（二）轉(zhuǎn)錄的延長第七十頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一

DDRP（核心酶）在模板的“轉(zhuǎn)錄終止點”停頓，酶—模板分離，RNA脫落。1、依賴ρ因子幫助：

ρ因子幫助RNA聚合酶辯認終點并停止轉(zhuǎn)錄。ρ因子與RNA結(jié)合（主要與PolyC親和力最大）→RNA-DNA雜化雙鏈的短鏈變性→利于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從轉(zhuǎn)錄復合物中釋放。ρ因子有ATP酶與解鏈酶活性。

2、不依賴ρ因子

RNA產(chǎn)物形成特殊結(jié)構來終止轉(zhuǎn)錄。在近轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物常出現(xiàn)多個“UUUU…..”結(jié)構，在此結(jié)構之前，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成“發(fā)夾樣”或“柄鼓泡”樣結(jié)構，這種二級結(jié)構是阻止轉(zhuǎn)錄繼續(xù)向下游推進的關鍵。（三）轉(zhuǎn)錄終止第七十一頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一第七十二頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一第七十三頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一四、轉(zhuǎn)錄過程的抑制劑第七十四頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一無論原核或真核生物，初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都經(jīng)過一定程度的修飾和加工才表現(xiàn)功能。真核生物轉(zhuǎn)錄后加工修飾更復雜，故主要介紹真核生物。（一）mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工1、首尾修飾（1）5′端帶帽：即GPPPmG。其功能：一種翻譯起始因子可和帽子結(jié)構結(jié)合，故與翻譯過程有關。（2）3′端接尾；即PolyA，一般100~200bp。其功能：維持mRNA作為翻譯模板活性，增加mRNA穩(wěn)定性。五、轉(zhuǎn)錄后的加工第七十五頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一

2、內(nèi)部剪接（1）斷裂基因（Splitgene）、外顯子（exon）和內(nèi)含子（intron）

〈a〉斷裂基因——真核生物的結(jié)構基因常由若干個編碼區(qū)及非編碼區(qū)間隔連續(xù)鑲嵌而成，稱之

〈b〉外顯子——基因中（包括hnRNA）能編碼AA的片段。

〈c〉內(nèi)含子——基因中（包括hnRNA）非編碼AA的片段。原核生物結(jié)構基因是連續(xù)的編碼序列，無斷裂基因。第七十六頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一（2）mRNA的剪接：即剪去內(nèi)含子，拼接外顯子斷裂基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄形成hnRNA，hnRNA剪去內(nèi)含子，拼接外顯子，成為成熟的mRNA（二）tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工

tRNA為DDRPIII的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

1、剪接：去除插入的堿基。

2、生成各種稀有堿基：即除A、C、G、U以外的堿基，如DHU、ψ、I等。

〈1〉甲基化：A→Am,G→Gm〈2〉還原反應：U→DHU〈3〉核苷內(nèi)轉(zhuǎn)位反應：尿嘧啶核苷→假尿苷ψ（C5—C1′）

〈4〉脫NH3：A→I3、3′端加入CCA-OH未端，完成氨基酸臂的第七十七頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一（三）rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工

rRNA的基因（rDNA）屬豐富基因族的DNA序列，有高度重復序列，這些序列可被不能轉(zhuǎn)錄為mRNA的間隔區(qū)分隔組成?！匆弧祌RNA的加工：

rRNA在胞核內(nèi)經(jīng)轉(zhuǎn)錄形成45S-rRNA，后者經(jīng)加工剪接形成18S-rRNA和經(jīng)拼接形成5.8s及28s-rRNA。三種rRNA一起和核糖體蛋白構成核糖體，進入胞質(zhì)。

〈二〉rRNA的自我剪接與ribozyme(核酶)

研究發(fā)現(xiàn)一些低等真核生物細胞核的rRNA，其剪接不需任何蛋白質(zhì)參與，故認為RNA分子具有酶的活性，從而提出核酶的概念。

1、核酶（ribozyme）：具有催化作用的RNA。主要參與RNA的自我剪接過程

2、核酶二級結(jié)構——槌頭狀結(jié)構，包括有底物部位（含G、U序列）和催化部位（有三個莖及1或2個環(huán)）。第七十八頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一一、概念：

基因工程是在體外將分離純化或人工合成的DNA與載體DNA結(jié)合，成為重組DNA，用以轉(zhuǎn)化宿主（細菌或其他細胞），然后篩選出能表達重組DNA的活細胞，加以純化、傳代、擴增，成為克隆的技術。因此基因工程也稱為基因克隆或重組DNA技術?？寺?Clone)——親代細胞通過無性繁殖而產(chǎn)生一組單一細胞的過程稱之。[克隆也表示從單一親代細胞通過無性繁殖而產(chǎn)生的一組單一的細胞。]第二節(jié)基因工程操作技術第七十九頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一已用限制性內(nèi)切酶切開的質(zhì)粒DNA給體DNA片段給體DNA重組質(zhì)粒染色體DNA細菌細菌的轉(zhuǎn)化與含重組質(zhì)粒的細菌的篩出已轉(zhuǎn)化的細菌細菌繁殖含該重組質(zhì)粒的細菌克隆株基因工程技術示意圖第八十頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一〈一〉分——載體和目的基因的分離

1、常用載體：質(zhì)粒、λ噬菌體、M13噬菌體等。此外還有逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA、昆蟲病毒DNA。對載體的要求：

〈1〉能獨立復制，但需宿主的酶體系進行基因表達。

〈2〉有篩選標記：如抗藥性基因。

〈3〉分子量不大，盡可能有多種內(nèi)切酶的單一位點。

〈4〉可通過破碎細菌，用密度梯度離心法分離。（5）容易進入受體細胞二、基因工程的五大步驟

——（分、切、接、轉(zhuǎn)、篩）第八十一頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一EcoRI0HindIII29BamHI375

SalI650

AvaI1425

PvuII2066

PstI3609耐氨芐青霉素基因耐四環(huán)素基因第八十二頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一

2、目的基因的來源：

〈1〉直接從染色體DNA分離，多用于原核生物。

〈2〉人工合成。

〈3〉從mRNA合成cDNA，需反轉(zhuǎn)錄酶。

第八十三頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一〈4〉基因文庫：是含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組DNA克隆群體。包括

G—文庫（總DNA文庫）、

C—文庫（cDNA文庫）?；蛭膸熘苽溥^程：全部DNA分離提純，經(jīng)過酶切形成DNA片段，重組入同一個載體，成為重組體，再轉(zhuǎn)化到細菌保存起來。第八十四頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一基因文庫包括：（1）G文庫——用基因組的總DNA來制備的稱之。（2）C文庫——用細胞全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，以之來建庫。應用“探針”可把目的基因釣出。第八十五頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一〈二〉切——限制性內(nèi)切酶的應用

1、作用——識別核酸分子某些堿基序列并加以切開。不同的限制酶其酶切點不同。酶辯認的堿基序列一般為4~6個，而且這些堿基序列大多有回文結(jié)構。

2、回文結(jié)構——即堿基排列順序在順讀和反讀都是一樣的。第八十六頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期一

3、酶作用的切口