WesternBlot詳解及常見問題

WesternBlot詳解表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)展檢測，對基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合局部的抗體WesternBlot技術(shù)。Contents：原理分類放射自顯影底物化學(xué)發(fā)光ECL底物熒光ECFDAB呈色主要試劑主要程序試驗常見的問題指南參考書推舉針對樣品的常見問題抗體濾紙、膠和膜的問題Marker的相關(guān)疑問染色的選擇參照的疑問緩沖液配方的常見問題條件的摸索方法的介紹結(jié)果分析原理與Southern或NorthernWesternBlot移到固相載體〔例如硝酸纖維素薄膜〕上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持檢測電泳分別的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。分類western顯色的方法主要有以下幾種：放射自顯影底物化學(xué)發(fā)光ECL底物熒光ECFDAB呈色現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和試驗條件的是用第一種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡潔，原理如下〔二抗用HRP標(biāo)記：反響底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HR，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。主要試劑1、丙烯酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺，應(yīng)以溫?zé)?以利于溶解雙丙稀酰胺)的去離子水配制含有29%(w/v)1%(w/v)N，N’-亞甲雙丙烯酰胺儲存液丙稀酰胺29g，N，N-1gH2O100ml。)儲于棕色瓶，4PH不得超過7.0，因可以發(fā)生脫氨基反響是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個月，隔幾個月須重配制。如有沉淀，可以過濾。2、十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去離子水配制，室溫保存。3、分別膠緩沖液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀100ml40C保存。4、濃縮膠緩沖液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris40mlH2O48ml1mol/LHCLpH6.8100ml40C保存。這兩種緩沖液必需使用TrisHCLPHTris.CL。5、TEMEDN，N，N’N’四甲基乙二胺催化過硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時，聚合反響受到抑制。10%(w/v)過硫酸胺溶液。供給兩種丙稀酰胺ml，臨用前配制.6、SDS-加樣緩沖液:pH6.80.5mol/LTris8ml，甘油6.4ml，10%SDS12.8ml，3.2ml，0.05%1.6ml，H2O32ml1:11:2比例與蛋白質(zhì)樣品3min20-25ul100μg。7、Tris-甘氨酸電泳緩沖液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000ml，得0.25mol/LTris-1.92mol/L10倍。81L2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.37gSDS，并參加200ml1L。9、麗春紅染液儲存液：麗春紅S2g30g磺基水楊酸30g100ml用時上10倍即成麗春紅S使用液。使用后應(yīng)予以廢棄。105%(w/v)。11、NaN30.02%疊氮鈉(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。12、Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。14、過氧化物酶標(biāo)記的其次抗體。15、NBT(70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。16、BCIP(100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。17、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。18、100mmol/LNaCl。19、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/LEDTA?！部梢詤⒖捶肿涌寺　持饕绦騑esternBlot的英文資料，讀者可以依據(jù)自己試驗室的實際狀況進(jìn)展調(diào)整：WesternBlotPROTOCOL：1、PreparationofBrainMembraneFractionsforWesternBlot2、WesternBlotting3、WesternBlots4、WesternBlotting5、GeneralWesternBlotProtocol6、WesternBlot&Immunostaining7、WesternBlotAnalysisforTissue8、WesternBlotting9、ECMProtocolsWesternBlot10、WesternBlottingUsingChemilμminscence11、FarWesternBlotting12、Enzyme-AssistedImmunoelectroblotitng13、WesternTroubleShooting14、TooManyBandsonWesternBlotTipsandhintsforthestorageofantibodies5〕試驗常見的問題指南依據(jù)問題的類型主要分成以下幾類〔：參考書推舉A.對初學(xué)者看什么資料比較好？Antibodies〔alaboratorymanualwrotebyEdHarlow，davidlane〕兩本書不錯。針對樣品的常見問題做線粒體膜UCP2蛋白的WesternBlot〔以下簡寫成WesternBlo，提取線粒體后凍存〔未加蛋白酶抑制劑，用的博士德的一抗，開頭還有點(diǎn)痕跡，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加120μgsantaclozPMSF行嗎？WesternBlotPMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。細(xì)胞水平要做WesternBlotWesternBlot？5*106就足夠了。同一樣品能同時提RNAWesternBlot有無影響?解答：能，沒有問題，我們做過。同一蛋白樣品能同時進(jìn)展兩種因子的WesternBlot檢測嗎？解答：固然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。假設(shè)目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要留意什么？解答：假設(shè)是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫順得多，這時最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉(zhuǎn)膜時常常會覺察只有一局部蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠覺察有的孔全部的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么方法可以解決？5－10％甲醇。想分別的蛋白是分子量260kd的，SDS-電泳的分別膠濃度多大適宜？積層膠的濃WesternBlot嗎？解答：260kd6％，StackingGel3.5％。假設(shè)上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？假設(shè)需要加大上樣量使原來弱的條帶能看清楚。解答：可以濃縮樣品，也可以依據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一局部小分子蛋白。一般地，超載301.5mm的comb。蛋白變性后可以存放多久？80℃，一兩年沒有問題。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了)。105KD7.5%，但我所查資料卻要求分別11％的配方，不知為何？解答：上述您提到的兩種凝膠均可以使用，由于105ＫＤ的蛋白在上述兩種膠的線性區(qū)分范圍內(nèi)，但需留意條帶位置。接下來我預(yù)備承受DAB體系，不知承受這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？似乎有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的生成，是嗎？解答：不能使用脫脂奶粉，由于脫脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替應(yīng)當(dāng)好一點(diǎn)．還有一問題，一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？解答：WesternBlot30－100微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和撫育時間都有關(guān)系，也與顯色時間長短有關(guān)。開頭摸條件時，為了拿到陽性結(jié)果，各個步驟都可以量多一點(diǎn)時間長一點(diǎn)，固然背景也就出來了。要拿到好的結(jié)果，假設(shè)抗體好的話比較簡潔，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了，固然有的不適合WesternBlot的怎樣做也不行。所以拿到好的結(jié)果不簡潔。做組織樣品的western的時候，處理樣品有什么訣竅嗎？還有，您用過大牛血清做封閉BSA好一點(diǎn)？解答：必需進(jìn)展研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋〔參加ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制劑cocktai5%脫脂奶粉較常用。假設(shè)一抗為多克隆抗體，使用ＢＳＡ也是不錯的選擇。200KDwestern要留意什么呢？200kd蛋白的WesternBlot時要留意，分別膠最好選擇>7%的；剝膠時要留神；轉(zhuǎn)移時間需要相應(yīng)延長；要做分子量參照〔否則消滅雜帶不知道如何分析。有什么方法可以提高上樣量？解答：可以濃縮樣品；增大上樣體積來增大上樣量。42kd心機(jī)，有沒有直接用低溫高速離心機(jī)就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？〔而不是只需要提取膜蛋白，可以用Ripabuffer和胞漿蛋白，用這個做WesternBlot就可以了。假設(shè)是非要只提取膜蛋白就要用到超速離心機(jī)。42kd不算大，也不算小，所以，可以依據(jù)一般的轉(zhuǎn)移方法實施。蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求？WesternBlot則上樣量要均等，假設(shè)只是要定性，則沒有太大的關(guān)系，盡量多上就行了，但是不要超過0.3μg/mm2。一抗，二抗的比例是否重要？解答：比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，可以去掉局部非特異的本底?？贵wWesternBlot，其二抗有何要求？解答：對二抗無要求，要看你試驗條件來選擇，一般推舉用HRP標(biāo)記的二抗。同一公司的另外抗體用這個稀釋度做出來效果很好，所以沒做預(yù)試，怕費(fèi)時間，用什么樣的稀釋度比較好呢？我用的ELL+plus試劑盒顯色。轉(zhuǎn)膜過夜，一抗孵育也是過夜的，假設(shè)封閉也過夜的話就要四天才看的到結(jié)果了。解答：不同抗體，即使是同一公司的抗體，其最正確的抗體稀釋度也是不一樣的，需要你試驗摸索。我覺得轉(zhuǎn)膜過夜似乎沒有必要吧，轉(zhuǎn)膜的目的也就是將蛋白轉(zhuǎn)到膜上就行啦，何必鋪張時間呢。至于具體的轉(zhuǎn)膜時間，還要看你的目的蛋白分子量的大?。晦D(zhuǎn)膜的設(shè)備，是半干式，還是濕式。一抗固然可以過夜，假設(shè)你想所短WesternBlot時間的話，可以增高一抗的孵37度，兩小時就足夠了；你可以參照抗體說明書。至于一抗和二抗1：15001：20230是在封閉；一抗和二抗后至少是5x5min，跑一張好膜不簡潔，多盡點(diǎn)心吧，這樣不會鋪張你的時間，只會節(jié)約你的時間！WesternBlot可以用同一種抗體嗎？解答：免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原打算簇〔又稱表位，有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，自然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western，而假設(shè)〔限于單抗〕WesternBlot中抗體的重復(fù)應(yīng)用問題2－3次。2－3天內(nèi)使用，4度保存，避開反復(fù)凍融。濾紙、膠和膜的問題NC膜\PVDF膜\尼龍膜怎樣鑒別？解答：尼龍膜是較抱負(fù)的核酸固相支持物，有多種類型；硝酸纖維素膜是目前應(yīng)用最廣的一種固相支持物，價格最廉價；PVDF膜介于二者之間。DNARNA480－600μg/cm210bpDNARNA80－100μg/cm2200bp的核酸片段結(jié)合力量不強(qiáng)；PVDFDNARNA125－300μg/cm2。荷結(jié)合；硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結(jié)合DNA，結(jié)合不結(jié)實；PVDF膜結(jié)合結(jié)實，耐高溫，特別適合于蛋白印跡。就韌性而言：尼龍膜較強(qiáng)；硝酸纖維素膜較脆，易裂開；PVDF膜較強(qiáng)。就重復(fù)性而言：尼龍膜可反復(fù)用于分子雜交，雜交后，探針分子可經(jīng)堿變性被洗脫下來；硝酸纖維素膜不能重復(fù)使用；PVDF膜可以重復(fù)使用。WesternBlot時，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？解答：PVDFPVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更簡潔跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加甲醇也是這個目的。檢測磷酸化的JNK和非磷酸化的JNK可以在同一張膜上嗎？解答：可以。AA.轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端〔即點(diǎn)樣空的一側(cè)〕的轉(zhuǎn)膜好象不是很好，為什么？解答：這是正常的，大分子的蛋白轉(zhuǎn)移的慢，你延長轉(zhuǎn)移時間和電流，大分子一端就會好的多，但是小分子的就有可能會變淡。BB.我想問您裂解細(xì)胞用三去污裂解法，還是用上樣緩沖液？解答：用上樣緩沖液，這樣有幾個好處，可以提取總蛋白，同時又可以讓磷酸化酶失活。CC.tanksystem有什么講究？〔一般tankSystem用衡壓好點(diǎn)，如28V1－16hr。DD.HSPWESTENWESTEN卻不能？WesternBlotIHC。EE.膜一般要如何處理？解答：一般用甲醇泡泡就可以了。FF.6×8轉(zhuǎn)印膜，要加多少一抗？解答：一抗的稀釋度是有說明的，依據(jù)你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育體積一3－5ml。GG.上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能到達(dá)最正確效果。解答：無要求。HH.跑電泳的時候配的膠總是“縮”是什么緣由呢？是有的成分不對嗎？解答：沒什么問題，就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時拿保鮮膜包起來，在里面加點(diǎn)水?！?0%聚丙酰胺〕有問題，你可以重配制一份觀看；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑，避開找問題麻煩。脫色液中甲醇的含量太高也會造成膠縮。II.膜、濾紙、膠大小有何講究？解答：假設(shè)是用的是半干轉(zhuǎn)，挨次為：陰極－》濾紙－》膠－》膜－》濾紙。濾紙的長寬分1－2mm1－2mm。確定禁忌：上下兩層濾紙由于過大而相互接觸，這樣會短路，電流不會通過膠和濾紙。JJ.蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分別小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？解答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd66kd可以一起轉(zhuǎn)，12％SDS-，濕轉(zhuǎn)36V，3－5hrs170kd用，10hrs－16hrs。KK.不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？解答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中參加20%甲醇〔是指終濃度〕(優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩沖液，可以參考《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》)，由于甲醇可降低蛋白質(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合力量，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時間；轉(zhuǎn)移緩沖液參加終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜〔0.2微米；使用戊二醛交聯(lián)；低濃度膠，如低至6％。太大時還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉(zhuǎn)移電壓／電流；增加轉(zhuǎn)移時間。LL.如何選擇最適宜的蛋白雜交膜？性以及分子大小等等因素，我們要量體裁衣，從雜交膜的材質(zhì)、孔徑和規(guī)格上都要做出合理的選擇。境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會與硝酸纖維素膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起，性結(jié)合，從而得到了廣泛的應(yīng)用。在非離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來。依據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，要選擇不同孔徑的硝酸纖維素膜。由于隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結(jié)合就越結(jié)實。但是膜孔徑假設(shè)小于0.1mm，蛋白的轉(zhuǎn)移就0.45μm0.2μm兩種規(guī)格的硝酸纖維素膜。大于20kD0.45μm20kD0.2μm的膜了，假設(shè)用0.45μm的膜就會發(fā)生“Blowthroμgh”的現(xiàn)象。從膜的質(zhì)地上來看，最重要的指標(biāo)就是單位面積上有些硝酸纖維素膜通常會還有大量的醋酸纖維素，因而降低了蛋白的結(jié)合量。S&S公司承受100%80-150μg/cm2100%的純度，因而也大大削減了非特異性的結(jié)合，降低雜交背景，無需高嚴(yán)謹(jǐn)度的洗脫步驟。其次，膜的強(qiáng)度和韌性也是需要考慮的因素。常規(guī)的硝酸纖維素膜比較脆，漂洗一兩次就會破損，不能反復(fù)使用。PVDF轉(zhuǎn)移膜：PVDF是一種高強(qiáng)度、耐腐蝕的物質(zhì)，通常是用來制造水管的。PVDF膜可以結(jié)合蛋白質(zhì)，而且可以分別小片段的蛋白質(zhì)，最初是將它用于蛋白質(zhì)的序列測定，由于硝EdmanPDVFPDVF膜結(jié)合蛋白的效率沒有硝酸纖維素膜高，但由于它的穩(wěn)定、耐腐蝕使它成為蛋白測序抱負(fù)的用品，始終沿用至今。PVDF膜與硝酸纖維素膜一樣，可以進(jìn)展各種染色和化學(xué)發(fā)光檢測，也有很廣的適用范圍。這種PVDF膜，靈敏度、區(qū)分率和蛋白親和力在精細(xì)工藝下比常規(guī)的膜都要高，格外適合于低分子量蛋白的檢測。但PVDF膜在使用之前必需用純甲醇進(jìn)展浸泡飽1-5秒鐘。離子交換型轉(zhuǎn)移膜：硝酸纖維素和PVDF膜是靠疏水作用結(jié)合蛋白的，還有一類膜是依據(jù)離子交換的方式結(jié)合生物大分子的。由DEAE〔二乙氨乙基〕修飾的纖維素制成的DEAEDEAE可以有效的結(jié)合陰離子基團(tuán)，包括那些高于其等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)。在pH10以下，DEAE基團(tuán)都能帶電荷，在低離子強(qiáng)度的轉(zhuǎn)移液中結(jié)合蛋白分子。其最適的pH5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶0.45μmDEAEWesternBlotting外，還可以用于核酸結(jié)合爭論。還有一種離子交換型膜是羧甲基〔CM〕修飾的纖維素膜，它可以結(jié)合蛋白和多肽分子，以pH4-7CM膜上洗脫下來，用于氨基酸系列分析或微測序。Marker的相關(guān)疑問MM.我用的是可視marker〔BIO_RA，但是電泳總跑不全88％，10％，12％，都是這樣。marker是買的。解答：一般來說，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或削減電泳時間試試看。固然梯度膠也是不錯的選擇。NN.用的是RochemolecularBiochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd組成的markerWesternBlot時還能夠看到marker80VSDS-10V45minWesternBlot時沒有進(jìn)展marker30KD的條帶消滅。再就70KD130KD兩個目的蛋白同時在一塊膠上進(jìn)展分析，用培育基樣品進(jìn)展分析，沒C端的V5Anti-V5-HR來結(jié)果，我很茫然。感謝您過賜予教導(dǎo)！10kdmarkerWesternBlotmarker，固然也僅能觀察其中最多PrestainedMarker放久了效果就會變差，電泳是條帶不清楚，集中。醇。2WesternBlot時沒有進(jìn)展麗春紅染色，但盡管用了此方法也僅能看到marker30KD30kd-50kd的轉(zhuǎn)移地比較好。370KD130KD兩個目的蛋白同時在一塊膠上進(jìn)展分析，用培育基樣品進(jìn)展分析，沒有用間接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶聯(lián)抗體〔Anti-V5-HR1.5hrs。染色的選擇OO.WesternBlot哪種染色好？15考馬雖然與氨基黑有一樣的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測后簡潔從蛋白質(zhì)中除去，以便進(jìn)展隨后的氨基酸分析。缺點(diǎn)是：溶劑系統(tǒng)的甲醇會引起硝化纖維素膜的皺縮或破壞。不能用語正電賀的膜。靈敏度低。膠體金，靈敏度高，檢測范圍可到pg級，但染色比穩(wěn)定。1、2之間，可用于任何一種膜。參照的疑問PP.是否WesternBlotACTIN內(nèi)參？解答：對于發(fā)表文章的試驗最好加內(nèi)參，試驗嚴(yán)謹(jǐn)。QQ.BANDSCAN分析結(jié)果行嗎？解答：分析一般的結(jié)果沒問題。RR.WesternBlot內(nèi)參選擇什么適宜？解答：可以選用組蛋白，組蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)是很穩(wěn)定的，有很多都可以當(dāng)成內(nèi)參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。SS.0.8mA/cm21小時左右？解答：不是的，半干法推舉用恒流，一般依據(jù)目的蛋白的大小來確定電流和時間。TT.做半定量人卵巢癌細(xì)胞系的WesternBlotB-actin，GAPDH，那個好？beta-actin就可以。緩沖液配