目的基因的獲得酵母雙雜交

關(guān)于目的基因的獲得酵母雙雜交第一頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二

酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進(jìn)行的，研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能通過報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測(cè)得到。一、酵母雙雜交系統(tǒng)簡(jiǎn)介

它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。

該技術(shù)既可用來研究哺乳動(dòng)物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用，也可用來研究高等植物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用。第二頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二經(jīng)典文獻(xiàn)出處FieldsS,SongO.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.

Nature,1989,340(6230):245-246二、酵母雙雜交系統(tǒng)的建立第三頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二

該系統(tǒng)的建立是基于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識(shí)。真核生物基因轉(zhuǎn)錄需要反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與，真核生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子含有兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：轉(zhuǎn)錄激活因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)(DNAbindingdomain)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)(activationdomain)1989年美國(guó)紐約州立大學(xué)的Fields和Song首先描述了酵母雙雜交系統(tǒng)(yeasttwo-hybridsystem)。第四頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二

這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響，單獨(dú)存在時(shí)沒有轉(zhuǎn)錄激活的功能，只有兩者通過共價(jià)或非共價(jià)鍵連接建立起來的空間結(jié)構(gòu)方可表現(xiàn)出一個(gè)完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子的功能。第五頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二目前酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)采用的系統(tǒng)有LexA系統(tǒng)和Gal4系統(tǒng)兩種。在LexA系統(tǒng)中，DNA結(jié)合域由一個(gè)完整的原核蛋白LexA構(gòu)成，轉(zhuǎn)錄激活域則由一個(gè)88個(gè)氨基酸的酸性的大腸桿菌多肽B42構(gòu)成，它在酵母中可以活化基因的轉(zhuǎn)錄;在Gal4系統(tǒng)中，BD和AD分別由Gal4蛋白上不同的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(1-147aa與768-881aa)構(gòu)成。第六頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二

兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中的BD由位于N-末端的1～147位多肽構(gòu)成，能識(shí)別位于Gal4基因的上游激活序列(upstreamactivationsequence，UAS)。此外，在其N-端還具有一段核定位序列。

AD由位于C-末端的768～881位多肽構(gòu)成。

Gal4的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域位于不同肽鏈上，只要它們?cè)诳臻g上充分接近，則能恢復(fù)Gal4作為轉(zhuǎn)錄因子的活性。Gal4為酵母半乳糖苷酶基因gal1的轉(zhuǎn)錄激活因子，天然的Gal4分子是由一條由881個(gè)氨基酸殘基組成的多肽鏈。第七頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二

Fields和Song將兩個(gè)融合蛋白分別構(gòu)建在穿梭質(zhì)粒上，一個(gè)是將Gal4的DNA-BD與酵母蛋白SNF1融合；另一個(gè)是將Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。其中，SNF1是一種絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一個(gè)結(jié)合蛋白，這兩種蛋白是已知可以相互作用的。第八頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二

當(dāng)兩種穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化含有Gal4結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因LacZ的酵母菌株后，通過SNFl與SNF4的相互作用，Gal4的DNA-BD與Gal4的AD靠近,形成一個(gè)大的復(fù)合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。

Gal4的DNA-BD可識(shí)別位于Gal4效應(yīng)基因的UAS，并可與之結(jié)合；

Gal4的AD則可與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中其他成分結(jié)合，激活UAS下游報(bào)告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄。第九頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二三、酵母雙雜交系統(tǒng)的原理ADYADYXDNA-BDGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergenetranscriptionGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneXDNA-BD第十頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個(gè)在結(jié)構(gòu)上可以分開的、功能上也相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成。1.結(jié)構(gòu)域（Domain）合作第十一頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二例如：啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4:DNAbindingdomainActivedomainNC1-147aa768-881aa上游激活序列（UAS）轉(zhuǎn)錄激活GAL4效應(yīng)基因結(jié)合結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)錄表達(dá)只要DNAbindingdomain（DNA-BD）與Activedomain（AD）靠近就能激活轉(zhuǎn)錄。第十二頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二2.拆開DomainDNAbindingdomainActivedomain上游激活序列（UAS）轉(zhuǎn)錄激活GAL4效應(yīng)基因結(jié)合用重組DNA技術(shù)把GAL4的兩個(gè)Domain分開，就喪失了激活效應(yīng)基因的能力。不能轉(zhuǎn)錄第十三頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二3.重組Domain用重組DNA技術(shù)把這兩個(gè)Domain分別與兩個(gè)不同的多肽連接。Activedomain蛋白A蛋白BDNAbindingdomain在體內(nèi)，蛋白A與蛋白B是否能結(jié)合。4.觀察報(bào)告基因表達(dá)第十四頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二GAL4的BDdomain與ADDomain也不能靠近，所以仍然不能啟動(dòng)效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。（1）如果蛋白A與蛋白B不能相互結(jié)合（2）如果蛋白A與蛋白B能相互結(jié)合上游激活序列（UAS）轉(zhuǎn)錄激活GAL4效應(yīng)基因蛋白ADNAbindingdomain轉(zhuǎn)錄激活domain蛋白B激活轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄表達(dá)第十五頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二X基因和Y基因產(chǎn)物的相互結(jié)合，導(dǎo)致reportergene表達(dá)。Reportergene表達(dá)就說明X基因產(chǎn)物與Y基因產(chǎn)物能結(jié)合。雙雜交原理第十六頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二第十七頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二酵母細(xì)胞作為報(bào)道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點(diǎn):

易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒具有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報(bào)告基因酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動(dòng)物的蛋白相互結(jié)合報(bào)道株經(jīng)改造的、含報(bào)告基因的重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞第十八頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二

基因組中GAL4基因是缺失型的基因組中引入額外的報(bào)告基因LEU、TRP、HIS改造后的酵母細(xì)胞的特點(diǎn)：通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽(yáng)性菌落第十九頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二

表達(dá)“誘餌”和“獵物”蛋白；檢驗(yàn)這兩種蛋白表達(dá)后能否激活酵母中的報(bào)告基因。做法：首先構(gòu)建能表達(dá)“誘餌”和“獵物”蛋白的表達(dá)載體。該載體中可加入進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)型篩選的基因。四、酵母雙雜交系統(tǒng)的基本策略第二十頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二五、酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)

高敏感性。原因：①采用高拷貝和強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體，使融合蛋白過量表達(dá)；②激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，之后又與啟動(dòng)子結(jié)合，此三元復(fù)合體使融合蛋白各組分間結(jié)合更趨于穩(wěn)定；③通過mRNA使信號(hào)放大；④檢測(cè)的結(jié)果是基因表達(dá)產(chǎn)物的累積效應(yīng)，可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)間的微弱或暫時(shí)的相互作用。第二十一頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二五、酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)2.真實(shí)性。檢測(cè)在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，作用條件與作用力無需模擬，在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。3.簡(jiǎn)潔性。融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。4.廣泛性。采用不同組織器官細(xì)胞類型和分化時(shí)期的材料構(gòu)建cDNA文庫(kù)，能分析不同亞細(xì)胞部位和功能的蛋白質(zhì)，適用于部分細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白。第二十二頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二

分析已知蛋白之間的相互作用對(duì)蛋白質(zhì)功能域的分析，如可將待測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行點(diǎn)突變或缺失突變?cè)龠M(jìn)行雙雜交。用已知功能蛋白質(zhì)篩選雙雜交cDNA文庫(kù)，研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。分析新基因的生物學(xué)功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫(kù)，再根據(jù)篩的已知基因推測(cè)新基因功能。繪制蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)圖譜在藥物設(shè)計(jì)中的應(yīng)用六、酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用現(xiàn)狀第二十三頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二1.利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的新功能

將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫(kù)中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽(yáng)性酵母菌株中可以分離得到AD-文庫(kù)載體，并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的cDNA片段，并對(duì)該片段的編碼序列在GENEBANK中進(jìn)行比較，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。第二十四頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二

利用酶聯(lián)免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技術(shù)都是利用抗原和抗體間的免疫反應(yīng)，可研究抗原和抗體之間的相互作用，但它們都是基于體外非細(xì)胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。而在細(xì)胞體內(nèi)的抗原和抗體的聚積反應(yīng)則可以通過酵母雙雜交進(jìn)行檢測(cè)。2.利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用第二十五頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二3.利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥物對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用的影響

對(duì)于能夠引發(fā)疾病反應(yīng)的蛋白相互作用可采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達(dá)到治療疾病的目的。第二十六頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二4.利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖（GenomeProteinLinkageMap）

基因組中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過基因組的測(cè)序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和EST序列。利用酵母雙雜交技術(shù)，將所有已知基因和EST序列為誘餌，在表達(dá)文庫(kù)中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。對(duì)于認(rèn)識(shí)一些重要的生命活動(dòng)：如信號(hào)傳導(dǎo)、代謝途徑等有重要意義。第二十七頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二七、酵母雙雜交系統(tǒng)中常見問題的解決和改進(jìn)措施（一）假陽(yáng)性較多（二）轉(zhuǎn)化效率偏低（三）陰性干擾第二十八頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二假陽(yáng)性定義：在待研究的兩個(gè)蛋白間沒有發(fā)生相互作用的情況下，報(bào)告基因仍被激活。（一）假陽(yáng)性較多

①BD融合誘餌蛋白的單獨(dú)激活作用。這種融合蛋白的激活作用被外來蛋白激活。②如AD融合靶蛋白有DNA的特異性結(jié)合，則可單獨(dú)激活報(bào)告基因的表達(dá)。③AD融合蛋白直接與轉(zhuǎn)錄因子作用激活報(bào)告基因；④AD融合靶蛋白與BD相互作用或者AD與BD融合蛋白之間的相互作用，尤其是后者帶來許多假陽(yáng)性。原因：第二十九頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二排除假陽(yáng)性的措施

①作嚴(yán)格的對(duì)照試驗(yàn)。應(yīng)對(duì)誘餌和靶蛋白分別作單獨(dú)激活報(bào)告基因的鑒定。②采用多個(gè)報(bào)告基因，且每個(gè)報(bào)告基因的上游調(diào)控區(qū)各不相同。目前試劑公司已采用。③報(bào)告基因整合到染色體上，可使基因表達(dá)水平穩(wěn)定。④優(yōu)化3-AT(3-aminotriazole，3-氨基三唑

)濃度。適當(dāng)增加濃度可減少假陽(yáng)性。第三十頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二進(jìn)一步分析：①這種相互作用是否會(huì)在細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生。②有些蛋白依賴于泛素的蛋白酶降解途徑成員，它們具有普遍的蛋白間的相互作用。③一些實(shí)際沒有相互作用的蛋白但有相同的模體蛋白也可發(fā)生相互作用。排除假陽(yáng)性的措施第三十一頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二原因：由于酵母轉(zhuǎn)化效率較細(xì)菌低4個(gè)數(shù)量級(jí)，因此轉(zhuǎn)化成為雙雜交技術(shù)的重要瓶頸。解決辦法：引進(jìn)酵母接合型

a接合型和接合型（兩者之間可形成二倍體，但自身不能）（二）轉(zhuǎn)化效率偏低第三十二頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二接合型酵母細(xì)胞cDNA文庫(kù)誘鉺蛋白基因多克隆位點(diǎn)DNA-BD載體AD載體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化a接合型酵母細(xì)胞篩選平板生長(zhǎng)菌苔篩選平板生長(zhǎng)菌苔同一個(gè)三重篩選平板克?。ㄕT餌與靶蛋白相互作用）鑒定β-半乳糖苷酶部分已商品化第三十三頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二（三）陰性干擾融合蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)胞有毒性，該怎么辦？應(yīng)選擇敏感性較低的菌株或拷貝數(shù)低的載體蛋白間的相互作用較弱，應(yīng)選擇高敏感的菌株或多拷貝載體。蛋白在酵母中不能穩(wěn)定地表達(dá)，或者不能正確地折疊，或雜交蛋白不能轉(zhuǎn)入胞核。兩個(gè)蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用，但報(bào)告基因不表達(dá)或表達(dá)程度甚低以至于檢測(cè)不出來。原因：第三十四頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二

酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法，有多方面的應(yīng)用，但仍存在一些局限性。八、酵母雙雜交系統(tǒng)使用注意事項(xiàng)第三十五頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二酵母雙雜交系統(tǒng)局限性某些誘餌蛋白具有自身激活性質(zhì)。---------雙雜交前刪除該部分，但應(yīng)避免刪除相互作用的結(jié)構(gòu)域某些蛋白在酵母中不穩(wěn)定表達(dá)或不能準(zhǔn)確定位到胞核內(nèi)。在細(xì)胞表面發(fā)生的相互作用可采用噬菌體顯示系統(tǒng)。

雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等，這些反應(yīng)在核內(nèi)無法進(jìn)行。

第三十六頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二酵母雙雜交系統(tǒng)局限性有時(shí)DNA-BD或AD融合部分不包括相互作用位點(diǎn)，或破壞了融合蛋白的正確折疊。4.哺乳動(dòng)物蛋白之間相互作用有時(shí)要求正確的折疊和翻譯后修飾，而酵母細(xì)胞不能提供這樣的環(huán)境。這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究陽(yáng)性克隆必須進(jìn)行體外翻譯和表達(dá)，用抗原表位特異性的抗體進(jìn)行共定位研究。雙雜交系統(tǒng)的得到的陽(yáng)性結(jié)果一定要通過其它的實(shí)驗(yàn)手段來驗(yàn)證。第三十七頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二

在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上，又發(fā)展：酵母單雜交--用于核酸和文庫(kù)蛋白之間的研究酵母三雜交--三種不同蛋白之間的互作研究酵母的反向雜交--兩種蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)和位點(diǎn)。反向雙雜交系統(tǒng)和三雜交技術(shù)第三十八頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二(一)酵母單雜交系統(tǒng)(one-hybridsystem)1993年，由Wang和Reed等相繼創(chuàng)立發(fā)展出一種研究蛋白質(zhì)和DNA相互作用的實(shí)驗(yàn)體系。WangMM,ReedRR.MolecularcloningoftheolfactoryneuronaltranscriptionfactorOlf-1bygeneticselectioninyeast.Nature，1993，364(6433):121-126.文獻(xiàn)出處第三十九頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二酵母單雜交系統(tǒng)原理在酵母單雜交系統(tǒng)中，省略了在酵母雙雜交系統(tǒng)中采用的BD-X蛋白質(zhì)雜交體，而用特異的DNA序列取代DNAGal4結(jié)合位點(diǎn)。該DNA序列在相關(guān)生物系統(tǒng)中是重要的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。靶DNA序列特異的結(jié)合蛋白(BDPX)與Gal4P的激活結(jié)構(gòu)域可融合形成融合體，BDPX與其特異DNA結(jié)合位點(diǎn)之間通過相互作用可激活作為表型選擇性標(biāo)志的報(bào)告基因的表達(dá)。第四十頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二酵母單雜交系統(tǒng)原理理論上，酵母單雜交系統(tǒng)可利用靶DNA序列，捕獲具有與該元件特異結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。該系統(tǒng)不僅適用于識(shí)別轉(zhuǎn)錄因子，也適用于研究參與轉(zhuǎn)錄抑制和DNA復(fù)制過程的蛋白質(zhì)。第四十一頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二酵母單雜交系統(tǒng)應(yīng)用①確定已知DNA-蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。②分離編碼結(jié)合于目的順式調(diào)控元件或其他短DNA結(jié)合位點(diǎn)蛋白的新基因。③定位已經(jīng)證實(shí)的具有相互作用的DNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及準(zhǔn)確定位與DNA結(jié)合的核苷酸序列。

----研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用第四十二頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二(二)反向酵母雙雜交系統(tǒng)

（reverseyeasttwo-hybridsystem）1996年，Vidal等人建立了反向酵母雙雜交系統(tǒng)VidalM,BrachmannRK,FattaeyA,HarlowE,BoekeJD.Reversetwo-hybridandone-hybridsystemstodetectdissociationofprotein-proteinandDNA-proteininteractions.ProcNatlAcadSciUSA，1996，93(19):10315-10320.第四十三頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二(二)反向酵母雙雜交系統(tǒng)

（reverseyeasttwo-hybridsystem）該系統(tǒng)是一項(xiàng)鑒定阻斷蛋白間相互作用的技術(shù)，核心在于構(gòu)建一種反向篩選的報(bào)告基因。在這系統(tǒng)中，野生型BD-X/AD-Y間的相互作用激活一種毒性標(biāo)志作為報(bào)告基因，對(duì)酵母宿主是毒性或致死性的，即所謂的陰性篩選。在此情況下BD-X/AD-Y作用的解離賦予酵母一種選擇生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。利用這種方法能方便地鑒定作用缺陷等位基因、解離肽或相關(guān)的小分子物質(zhì)。第四十四頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二

反向雙雜交系統(tǒng)基本原理示意圖第四十五頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二

反向雙雜交系統(tǒng)基本原理示意圖

雙雜交產(chǎn)生的相互作用激活Tet阻遏蛋白，從而抑制陽(yáng)性篩選標(biāo)志His3的表達(dá)，此時(shí)野生型相互作用使宿主細(xì)胞表現(xiàn)為組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。第四十六頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二反向酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用用于篩選缺陷等位基因的研究：在穩(wěn)定、全長(zhǎng)及能夠形成正確蛋白質(zhì)折疊的條件下，已有了幾種遺傳學(xué)策略來篩選作用缺陷性等位基因。在反式作用解離分子方面的應(yīng)用

在蛋白質(zhì)組研究方面的應(yīng)用：利用反向雙雜交系統(tǒng)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行預(yù)清除，則可能大大減輕以后的假陽(yáng)性鑒定工作。反向雙雜交系統(tǒng)作為正向雙雜交系統(tǒng)的補(bǔ)充，提出了創(chuàng)建整個(gè)有機(jī)體蛋白質(zhì)連鎖圖譜的設(shè)想。第四十七頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二酵母雙雜交GAL4系統(tǒng)篩選cDNA文庫(kù)實(shí)驗(yàn)流程第四十八頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二GAL系統(tǒng)所用酵母菌株注：菌株AH109可利用所帶的HIS3、ADE2、MEL1

三個(gè)報(bào)道基進(jìn)行篩庫(kù)。菌株Y187可利用所帶的IacZ

報(bào)道基因來驗(yàn)證兩個(gè)已知蛋白間的相互作用。菌株CG-1945可被用于用環(huán)己酰亞胺來分離BD-bait和AD-library質(zhì)粒。第四十九頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二酵母菌株的表型第五十頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二GAL系統(tǒng)所用各種質(zhì)粒第五十一頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二誘餌載體第五十二頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二誘餌載體序列第五十三頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二獵物載體第五十四頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二獵物載體序列第五十五頁(yè)，共六十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)流程構(gòu)建于AD載體的cDNA文庫(kù)的擴(kuò)增構(gòu)建于AD載體的cDNA文庫(kù)的純化pGBKT7/bait小規(guī)模轉(zhuǎn)化酵母菌AH109釣餌蛋白自身激活報(bào)道基因的活性檢測(cè)—pGBKT7/bait與pACT2小規(guī)模共轉(zhuǎn)化酵母文庫(kù)質(zhì)粒大規(guī)模轉(zhuǎn)化已攜