組培實驗室的設計

關于組培實驗室的設計第一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三第一節(jié)：商業(yè)性組織培養(yǎng)實驗室和小工廠的設計與主要設備主要內容：實驗室的設計儀器設備和器皿用具第二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三

在進行植物組織培養(yǎng)工作之前，首先應對工作中需要哪些最基本的設備條件有個全面的了解，以便因地制宜地利用現有房屋，或新建、改建實驗室。實驗室的大小取決于工作的目的和規(guī)模。以工廠化生產為目的，實驗室規(guī)模太小，則會限制生產，影響效率。在設計組織培養(yǎng)實驗室時，應按組織培養(yǎng)程序來沒計，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。植物組織培養(yǎng)是在嚴格無菌的條件下進行的。要做到無菌的條件，需要一定的設備、器材和用具，同時還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。一、實驗室設計第三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三組培實驗室設計原則：

保證無菌操作，達到工作方便，防止污染。第四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三組培實驗室組成：標準組織培養(yǎng)室包括:洗滌室（區(qū)）制備室（區(qū)）滅菌室（區(qū)）儲放室（區(qū)）操作室（區(qū)）培養(yǎng)室（區(qū)）觀察室（區(qū)）藥品室（區(qū)）▼可以根據自己的實際條件進行合并第五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三準備室：完成所使用的各種藥品的貯備、稱量、溶解、配制、培養(yǎng)基分裝等。主要設備：藥品柜、防塵櫥（放置培養(yǎng)容器）、冰箱、天平、蒸餾水器、酸度計及常用的培養(yǎng)基配制用玻璃儀器.洗滌、滅菌室：完成各種器具的洗滌、干燥、保存、培養(yǎng)基的滅菌等。主要設備：水池、操作臺、高壓滅菌鍋、干燥滅菌器（如烘箱）等。第六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三臥

式

滅

菌

鍋第七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三無菌操作室（接種室）：

主要用于植物材料的消毒、接種、培養(yǎng)物的轉移、試管苗的繼代、原生質體的制備以及一切需要進行無菌操作的技術程序。主要設備：紫外光源、超凈工作臺、消毒器、酒精燈、接種器械（接種鑷子、剪刀、解剖刀、接種針）等。接種室宜小不宜大，一般7～8平米，要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒。配置拉動門，以減少開關門時的空氣擾動。要求干爽安靜，清潔明亮。在適當位置吊裝1～2盞紫外線滅菌燈，用以照射滅菌。最好安裝一小型空調，使室溫可控，這樣可使門窗緊閉，減少與外界空氣對流。接種室應設有緩沖問，面積1m2為宜。進入無菌操作室前在此更衣換鞋，以減少進出時帶入接種室雜菌。緩沖間最好也安一盞紫外線滅菌燈，用以照射滅菌。第八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三超

靜

工

作

臺第九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三酸

度

計第十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三培養(yǎng)室：培養(yǎng)室是將接種的材料進行培養(yǎng)生長的場所。其大小可根據需要培養(yǎng)架的大小、數目、及其他附屬設備而定。其設計以充分利用空間和節(jié)省能源為原則。高度比培養(yǎng)架略高為宜，周圍墻壁要求有絕熱防火的性能。主要設備：培養(yǎng)架（控溫控光控濕）、搖床、培養(yǎng)箱、紫外光源等。培養(yǎng)材料放在由金屬制成培養(yǎng)架上培養(yǎng)。培養(yǎng)架一般設5層，最低一層離地高約lOcm，其他每層間隔30cm左右，培養(yǎng)架高1．7m左右。其長度根據日光燈長度而設計，如采用40W日光燈，則長I．3m，30W的長lm，寬度一般為60cm。培養(yǎng)室最重要的因子是溫度，一般保持在20—27℃左右，具備產熱裝置，并安裝窗式或立式空調機。由于熱帶植物和寒帶植物等不同種類要求不同溫度，最好不同種類有不同的培養(yǎng)室。室內濕度也要求恒定，相對濕度以保持在70%～80%為好，可安裝加濕器?？刂乒庹諘r間可安裝定時開關鐘，一般需要每天光照10-16h，也有的需要連續(xù)照明?，F代組培實驗室大多設計為采用天然太陽光照作為主要能源，這樣不但可以節(jié)省能源，而且組培苗接受太陽光生長良好，馴化易成活。在陰雨天可用燈光作補充。第十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三細胞學實驗室

該室用于對培養(yǎng)物的觀察分析與培養(yǎng)物的計數等。主要設備：雙筒實體顯微鏡、顯微鏡、倒置顯微鏡等。小型儀器設備有：分注器、血球計數器、移液槍、過濾滅菌器、電爐等加熱器具、磁力攪拌器、低速臺式離心機等。第十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三顯微鏡顯微鏡第十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三玻璃器皿及用具玻璃器皿培養(yǎng)用的：試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等；顯微鏡下觀察用的：細胞微室、載玻片、培養(yǎng)皿等。微孔過濾器（細胞過濾器）：激素用于滅菌。一般用石棉濾膜第十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三第二節(jié)：培養(yǎng)基及其配制主要內容：培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的種類、配方及其特點培養(yǎng)基的配制

1、培養(yǎng)基母液的配制

2、培養(yǎng)基的配制第十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三一、培養(yǎng)基的成分大量元素微量元素氨基酸和有機附加物植物激素（植物生長調節(jié)劑）維生素類凝固劑第十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三大量元素（以Ms培養(yǎng)基為例）序號化學式化學名稱用量mg/l1KNO3硝酸鉀19002NH4NO3硝酸銨16503KH2PO4磷酸二氫鉀1704MgSO4.7H2O硫酸鎂3705CaCL2.4H2O二氯化鈣440第十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三微量元素（以MS培養(yǎng)基為例）序號化學名稱化學式用量（mg/l)1碘化鉀KI0.832硼酸H3BO36.23硫酸錳MnSO4.4H2O22.34硫酸鋅ZnSO4.7H2O8.65鉬酸鈉Na2MoO4.2H2O0.256硫酸銅CuSO4.5H2O0.0257氯化鉀CoCL2.6H2O0.025第十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三氨基酸和有機附加物（以MS培養(yǎng)基為例）序號化學名稱化學式用量(mg/l)1肌醇C6H12O6.2H2O1002甘氨酸NH2.CH2.COOH23鹽酸硫胺素C12H17CLN4OS.HCL0.14鹽酸吡哆醇C8H11O3N.HCL0.55煙酸NC5H4COOH0.5第十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三植物激素（植物生長調節(jié)劑）1、生長素類：IAA，IBA，2，4-D，NAA等。2、細胞分裂素類：KT，6-BA，ZT等。3、赤霉素類；GA1-GA4，GA7，GA9-GA16，GA24，GA25等4、脫落酸：ABA5、乙烯6、PH值：5.6-5.8

第二十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三培養(yǎng)基的種類、配方及其特點按性質分基本培養(yǎng)基：MS、MT（MurashigeandTucher）White完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基＋其它成分（激素、有機物質等）第二十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三按狀態(tài)分固體培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基。按作用分：誘導培養(yǎng)基；增值培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基。按培養(yǎng)過程分：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基。第二十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三培養(yǎng)基配方及特點參見課本p17~18第二十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三培養(yǎng)基的配制母液（儲備液）的配制與保存培養(yǎng)基配制第二十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三Ms母液（儲備液）的配制與保存

成分

用量(g/l)每升培養(yǎng)基取用量(ml)母液1（大量元素）NH4NO3KNO3

MgSO4.7H2OCaCL2.2H2OKH2PO4母液2（微量元素）KIH3BO3MnSO4.4H20ZnSO4.7H2ONa2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCL2.6H2O８２.５９５.０１８.５４４.０１７.００.０８２０.６２２.２３０.８６０.０２５０.００２５０.００２５２０１０１０１０第二十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三

成分用量（ｇ／ｌ）每升培養(yǎng)基用量（ｍｌ）母液3（鐵鹽）FeSO4.7H2ONa2.EDTA.2H2O２.７３２.７８

１０母液4（維生素、氨基酸）肌醇煙酸鹽酸吡哆醇鹽酸硫胺素甘氨酸１０.００.０５０.００１０.０５０.２

１０第二十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三培養(yǎng)基的配制1、在潔凈的不銹鋼鍋里放入750ml蒸餾水，加入所需要的瓊脂和糖，加熱熔化。2、加入儲備液1－４０ｍｌ，儲備液2、３、４各１０ｍｌ，按需要量加入植物激素。3、用蒸餾水定容到1L。4、調ｐH值。ＰＨ一般５.８5、培養(yǎng)基的分裝。6、包扎。7、培養(yǎng)基的高壓滅菌。第二十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三培養(yǎng)基的滅菌高溫高壓蒸汽滅菌：121℃，1.1Kg/c㎡，15-20芬，時間過長，培養(yǎng)基成分易變性失效過濾滅菌：在高溫高壓下易分解的培養(yǎng)基和激素類第二十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三第三節(jié)：外植體的選擇與培養(yǎng)主要內容：外植體的選擇外植體的滅菌外植體的接種和培養(yǎng)外植體的成苗途徑污染的原因及預防措施外植體的褐變及其防止措施培養(yǎng)物的玻璃化現象及其預防措施第二十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三一、外植體的選擇1、外植體（Explant）：是指植物離體培養(yǎng)中的各種接種材料。包括植物體的各個器官、組織、細胞和原生質體等。2、外植體選擇的要求選擇優(yōu)良的種質：材料的選擇要有目的,具有一定的代表性,提高成功率,增加實用性。選擇健壯的植株：選取發(fā)育正常的器官或組織，再生能力強，組培易成功。第三十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三選擇合適的大小：根據不同的植物而異，太大容易污染，太小，多形成愈傷組織甚至難于成活。一般在0.5-1.0cm之間。選擇最適的時期：一般按植物生長的最適時期選取材料第三十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三外植體的類型1、莖尖（園藝植物組織培養(yǎng)中應用最多，繁殖率高，不易發(fā)生遺傳變異，但取材有限）2、莖段（采用嫩莖的切段促進腋芽萌發(fā)，取材容易）3、葉（幼嫩葉片組織通過愈傷組織或不定芽分化產生植株，取材容易，操作方便，但易發(fā)生變異）；4、花球和花蕾5、種子、根、塊根、塊莖、花瓣等。第三十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三二、外植體的滅菌

外植體的消毒是組培成功與否的第一關鍵步驟。外植體的預處理：對外植體進行修整,去掉不要的部分,在流水下沖洗干凈.外植體的表面滅菌：

原則：充分滅菌，但不傷外植體；不同的外植體，滅菌的要求也不一樣第三十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三常用滅菌藥劑的使用和效果消毒劑使用濃/%清除難易消毒時/min滅菌效果次氯酸鈉2易5-30很好次氯酸鈣9-10易5-30很好漂白粉飽和溶液易5-30很好升汞0.1-1較難2-10最好酒精70-75易0.2-2好過氧化氫10-12最易5-15好溴水1-2易2-10很好硝酸銀1較難5-30好抗菌素4-50mg/L中30-60較好第三十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三常用的滅菌方法(1)莖尖、莖段及葉片等的消毒：用清潔劑清洗---75%酒精浸泡10-20min---無菌水洗2-3次或Naclo或升汞溶液泡10-15min---無菌水洗3-4次（2）果實和種子的消毒：自來水沖洗10-30min---70%酒精漂洗---2%Naclo液浸10min---無菌水2-3次---取出種子培養(yǎng)（3）根及地下部器官的消互毒：自來水沖洗---純酒精漂洗---升汞浸5-10min或2%Naclo液浸10-15min---無菌水洗3次（4）花藥的消毒：自來水沖洗70%酒精浸泡數秒鐘---無菌水洗2-3次---漂白粉上清液浸10min---無菌水洗2-3次第三十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三消毒注意事項表面消毒劑對植物組織是有害的，應正確選擇消毒劑的濃度和處理時間，以減少組織的死亡。在表面消毒后，必須用無菌水漂洗材料3次以上以除去殘留殺菌劑，但若用酒精消毒，則不必漂洗。與消毒劑接觸過的切面在轉移到無菌基質前需將其切除，因為消毒劑會阻礙植物細胞對基質中營養(yǎng)物質的吸收。若外植體污染嚴重則應先用流水漂洗1小時以上或先種子培養(yǎng)得到無菌種苗，然后用其各個部分建立組織培養(yǎng)。HgCl2效果最好，但對人的危害最大，用后要用水沖洗至少5次。第三十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三三、外植體的接種和培養(yǎng)第三十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三（一）外植體的接種------無菌操作是將表面滅菌的植物材料切碎或分離出器官、組織、細胞，轉放到無菌培養(yǎng)基上的全部過程。整過接種過程均需無菌操作。第三十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三外植體接種全過程

酒精擦拭手外植體消毒浸泡5min器械消毒酒精燈灼燒酒精擦拭培養(yǎng)皿第三十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三酒精擦拭旋轉灼燒取外植體接種蓋好瓶塞修剪外植體第四十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三第四十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三第四十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三（二）外植體的培養(yǎng)1、光照2、溫度3、濕度4、氧氣第四十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三愈傷組織途徑：外植體的成苗途徑試管苗外植體愈傷組織根、芽芽芽根如安祖花的組織培養(yǎng)就屬此類途徑第四十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三器官發(fā)生途徑：外植體經誘導后直接形成根和芽，進而形成完整的植物體。如莖尖培養(yǎng)。第四十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三胚胎發(fā)育途徑：外植體胚狀體（原胚期、球形胚期、心形胚期、魚雷形胚期、子葉期）試管苗第四十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三50年代末期，Steward等人從胡蘿卜的韌皮部用液體培養(yǎng)基通過游離細胞的分化，獲得了胚狀體。據統(tǒng)計，在植物組織培養(yǎng)中具有胚狀體分化能力的種子植物已達117種，分屬43科，75屬。培養(yǎng)基的激素成分和氮源影響胚狀體的發(fā)生。有的植物可在無激素培養(yǎng)基上誘導出胚狀體，如煙草、曼陀蘿、水稻、小麥花藥培養(yǎng)；有的植物需要生長素與細胞分裂素的一定比例誘導胚狀體，如油茶、酸棗、桃等。在植物組織組織培養(yǎng)中，誘導胚狀體與誘導芽相比較，具有顯著的優(yōu)點，一是數量多，二是速度快，三是成苗率高。由于胚狀體具有這些優(yōu)點，所以在育種工作及園藝工作中，可用胚狀體作為特定的優(yōu)良基因型個體的無性繁殖手段，同時在研究胚胎發(fā)育中也有很重要的理論意義。第四十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三五、污染的原因及其預防措施1、污染：植物組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導致培養(yǎng)失敗的現象2、污染的原因一是病原菌污染（細菌、真菌）二是外植體、培養(yǎng)基、培養(yǎng)器皿帶菌三是操作人員未遵守操作規(guī)程。真菌污染第四十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三第四十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三第五十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三污染的預防措施

組織培養(yǎng)中降低污染率是工廠化生產中不可忽視的技術環(huán)節(jié)。預防措施有：防止材料帶菌------選擇取材時間、材料與培養(yǎng)、外植體滅菌等措施；防止用具帶菌------器皿與金屬器械滅菌；操作室要處于無菌狀態(tài)------工作室、培養(yǎng)室滅菌等；操作人員要按照操作程序進行。在培養(yǎng)基中加入抗菌素分散接種第五十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三假設污染率為95%：100塊材料，接種于100支試管，即1塊/支。 得率為：P=（1-95%）100=5塊無菌材料200塊材料，接種于100支試管，即2塊/支。

P1（2污）=95%95%=90.25% P2（1污1得或1得1污）=295%5%=9.5% P3（2得）=5%5%=0.25%若得到1支試管的無菌材料，至少要接種：

1/0.25%=400支，即接種800塊材料，能得2塊無菌材料。若按3塊/支接種，需做8000支試管培養(yǎng)基，接入2.4萬塊材料，才能有1支試管的（得3塊）無菌材料。第五十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三六、外植體的褐變及其防止措施第五十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三褐變

褐變是指外植體在培養(yǎng)過程中體內的多酚氧化酶被激后活，使細胞內的酚類物質氧化成棕褐色醌類物質，這種致死性的褐化物不但向外擴散致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，而且還會抑制其他酶的活性，嚴重影響外植體的脫分化和器官分化，最后變褐而死亡的現象第五十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三影響褐變的因素植物種類：一般木本植物，單寧、色素含量高的植物易發(fā)生褐變?；蛐停和庵搀w的生理狀態(tài)：一般幼齡材料，幼嫩器官和組織，春季取外植體，褐變發(fā)生較輕。培養(yǎng)基的成分：培養(yǎng)基中6－BA或KT能促進褐變發(fā)生，而生長素類如IAA可減輕褐變發(fā)生。材料轉移時間：第五十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三褐變的防止措施選擇適宜的外植體及最佳培養(yǎng)基：適當降低培養(yǎng)基無機鹽濃度，降低PH值，降低細胞分裂素水平等，可顯著減輕培養(yǎng)物褐變連續(xù)轉移加抗氧化劑：如硫代硫酸鈉、抗壞血酸；加活性碳加多胺類物質，如精胺、亞精胺第五十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三七、培養(yǎng)物的玻璃化現象及其預防措施

第五十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期三玻璃化現象及其產生原因

培養(yǎng)物增殖培養(yǎng)時，若細胞分裂素濃度過高或細胞分裂素與生長素相對含量高，培養(yǎng)基中離子種類，比例不適，瓊脂濃度低，不良培養(yǎng)環(huán)境如溫度過低