蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究方法

關(guān)于蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究方法第一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三一、蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)概念

蛋白質(zhì)組澳大利亞學(xué)者Williams和Wilkins于1994年首先提出protein+genome=proteome一個基因組所表達的全套蛋白質(zhì)一個細胞或一個機體的基因所表達的全部蛋白質(zhì)第二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三蛋白質(zhì)組是：對應(yīng)于基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，不是局限于一個或幾個蛋白質(zhì)。同一基因組在不同細胞、不同組織中的表達情況各不相同。在空間和時間上動態(tài)變化著的整體。第三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三

蛋白質(zhì)組學(xué)

旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達模式與功能模式從整體的角度分析、鑒定細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、表達水平與修飾狀態(tài),了解蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與大分子之間的相互作用與聯(lián)系,揭示蛋白質(zhì)的功能與細胞生命活動的規(guī)律第四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三二、蛋白組學(xué)的研究內(nèi)容蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容主要有兩個方面：

結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)和功能蛋白質(zhì)組學(xué)

結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)(Structuralproteomics)主要是蛋白質(zhì)表達模式的研究，包括蛋白質(zhì)氨基酸序列分析及空間結(jié)構(gòu)的解析、種類分析及數(shù)量確定；

功能蛋白質(zhì)組學(xué)(functionalproteomics)主要是蛋白質(zhì)功能模式的研究，

包括蛋白質(zhì)的功能及蛋白質(zhì)間的相互作用。第五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三蛋白質(zhì)的各級結(jié)構(gòu)第六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三0.50nm0.54nm氫鍵α-碳原子側(cè)鏈反平行俯視側(cè)視第七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三所以，蛋白質(zhì)組學(xué)研究是對不同時間和空間發(fā)揮功能的特定蛋白質(zhì)群體的研究,從蛋白質(zhì)水平上探索蛋白質(zhì)作用模式、功能機理、調(diào)節(jié)控制以及蛋白質(zhì)群體內(nèi)相互作用,為臨床診斷、病理研究、藥物篩選、新藥開發(fā)、新陳代謝途徑研究等提供理論依據(jù)和基礎(chǔ).第八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三三、蛋白質(zhì)組研究的理論基礎(chǔ)從mRNA表達水平并不能預(yù)測蛋白表達水平。用基因表達連續(xù)分析法(SAGE)研究對數(shù)生長期啤酒酵母的80個基因，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)翻譯和轉(zhuǎn)錄豐度有明顯相關(guān)；對某些基因，相同的mRNA豐度翻譯成蛋白的量的差異可達50倍；而相等的蛋白量可由豐度相差40倍的mRNA轉(zhuǎn)錄而來。這說明轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對蛋白的含量有幾乎相同的重要性。第九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三蛋白質(zhì)的動態(tài)修飾和加工并非必須來自基因序列。蛋白質(zhì)在翻譯后可有多種調(diào)節(jié)方式，如糖基化、磷酸化、異戊二烯化、?；饔玫?。此外，許多蛋白質(zhì)只有與其它分子結(jié)合后才有功能，這種修飾是動態(tài)的、可逆的。第十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三蛋白質(zhì)組動態(tài)地反映生物系統(tǒng)所處的狀態(tài)。細胞周期的特定時期、分化的不同階段、對應(yīng)的生長和營養(yǎng)狀況、溫度、應(yīng)激和病理狀態(tài)等其相應(yīng)的蛋白質(zhì)組之間存在差異。對其中蛋白質(zhì)合成、降解、加工、修飾的調(diào)控過程,只有通過蛋白質(zhì)的直接分析才能提示。第十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三蛋白質(zhì)組研究的理論基礎(chǔ)DNAmRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯基因蛋白質(zhì)細胞特異性基因表達生理狀態(tài)溫度應(yīng)激狀態(tài)培養(yǎng)條件藥物作用數(shù)量有限結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定復(fù)雜性多變性直接反應(yīng)生命現(xiàn)象復(fù)雜的調(diào)控第十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三四、蛋白質(zhì)組表達模式的研究方法蛋白質(zhì)組表達模式（expressionprofile）：研究蛋白質(zhì)組的組成成分支撐技術(shù)主要有：雙向凝膠電泳(2Delectrophoresis)、以質(zhì)譜(massspectrograph)為代表的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù),以及生物信息學(xué)(Bioinformatics)分析。第十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三ProteinsampleImageanalysisProteiningelProteinonmembraneProteininsolution2-DPAGEExcisionBlottingElutionPartialdegradationPeptidemixtureMassofproteinN-terminalsequenceMSEdmandegradationPeptidemassfingerprintPeptidesequenceMS/MSdataDatabasesearchingNovelorpreviouslystudiedproteinCharacterizationofpost-translocationmodifications蛋白質(zhì)組的分析流程第十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三（一）蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備通?？刹捎眉毎蚪M織中的全蛋白質(zhì)組分進行蛋白質(zhì)組分析。也可以進行樣品預(yù)分級，即將細胞或組織中的全體蛋白質(zhì)分成不同部分，分別進行研究。樣品預(yù)分級主要作用在于提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量和檢測靈敏度。

第十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三樣品預(yù)分級的主要方法蛋白質(zhì)溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白質(zhì)定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白質(zhì)細胞器定位：線粒體、高爾基體、葉綠體等第十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三三

種

常

用

的

植

物

蛋

白

提

取

方

法第十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三（二）蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離雙向凝膠電泳(two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)，是目前蛋白質(zhì)組研究中最有效的分析鑒定技術(shù)之一。由兩相組成：

第一相：等電聚焦凝膠電泳根據(jù)蛋白質(zhì)電荷差異

第二相：SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)蛋白質(zhì)分子量差異第十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三二維雙向電泳(2Delectrophoresis)

基本原理第一向在高壓電場下對蛋白質(zhì)進行等電聚焦(IEF),再在第一向垂直方向上進行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)。IEF-focusedproteinsSDS-chargedproteinsinIPGstripSDS-chargedproteinsresolvedaccordingtosizesinSDSgel第十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三2-DE原理示意圖

第二十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三2-DE分析的基本步驟蛋白質(zhì)溶解變性還原去除蛋白質(zhì)雜志利用不同pK固定化電解質(zhì)可配置不同pH范圍的凝膠或利用商業(yè)化軟件設(shè)計

第一相電泳：IPG－IFE平衡第二相電泳：SDS－PAGE考馬斯亮藍染色、銀染色、銅染色樣品制備IPG膠制備雙相電泳染色第二十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三2-DE的操作SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS

SDSpolyacrylamidegelelectrophoresisSDS帶負電荷，破壞蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵，使之形成單個亞基。SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物為雪茄形的長橢圓棒，消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異。SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移率只是蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)有關(guān)。第二十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三

制膠：試劑分離膠（ml）濃縮膠（ml）1.5MTris-HCl（pH8.9）2.50——30%單體3.501.0010%SDS0.100.10蒸餾水3.846.340.5MTris-HCl（pH6.8）——2.5010%過硫酸銨AP0.050.05四甲基乙二胺TEMED0.010.01第二十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三

樣品處理：Loadingbuffer40%甘油溴酚蘭SDSβ-巰基乙醇0.5MTris-HCl（pH6.8）50ul樣品50ul(2×)LoadingbufferMix950C/5min第二十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三電泳槽上電極緩沖液下電極緩沖液樣品槽上樣器陰極陽極電泳方向聚丙烯酰胺凝膠板第二十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三第二十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三蛋白質(zhì)點的染色凝膠上的蛋白質(zhì)點染色常用方法有銀染法、考馬斯亮藍染色法,另外還采用以下染色試劑:麗春紅S、氨基黑、印度墨、35S硫脲銀、膠態(tài)金、咪唑鋅等.銀染法廣泛用于雙向凝膠電泳分離后蛋白質(zhì)點的染色,該法靈敏度為4ng,但對質(zhì)譜測定有干擾,必須先脫銀.考馬斯亮藍染色法可用于膠上或膜上蛋白質(zhì)點染色,該法操作方便、重現(xiàn)性好,同銀染法一樣,質(zhì)譜測定時也必須先脫色.第二十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三2-DE圖像分析技術(shù)通過2-DE得到的蛋白質(zhì)分離圖譜，需要經(jīng)過攝像或掃描轉(zhuǎn)換為以像素為基礎(chǔ)的、具有不同灰度強弱和一定邊界方向的斑點電腦信號。2-DE獲得的蛋白質(zhì)圖譜第二十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三圖像采集斑點檢測背景消減獲得蛋白質(zhì)相關(guān)信息圖像內(nèi)及圖像間的比較2-DE圖像分析軟件包操作過程：第二十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三2-DE技術(shù)的優(yōu)缺點

優(yōu)點：可以同時直觀顯示數(shù)千個蛋白質(zhì)點；缺點：

極酸、極堿性蛋白質(zhì)，疏水性蛋白質(zhì)，極大蛋白質(zhì)、極小蛋白質(zhì)以及低豐度蛋白質(zhì)用此種技術(shù)難于有效分離；

膠內(nèi)酶解過程費時、費力，難于與質(zhì)譜聯(lián)用實現(xiàn)自動化；丙烯酰胺有神經(jīng)毒作用。第三十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三新型非凝膠技術(shù)液相色譜法(liquidchromatography，LC)毛細管電泳(capillaryelectrophoresis，CE)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）蛋白質(zhì)混合物直接通過液相色譜分離以代替2-DE的分離，然后進入MS系統(tǒng)獲得肽段分子量，再通過串聯(lián)MS技術(shù)，得到部分序列信息，最后通過計算機聯(lián)網(wǎng)查詢、鑒定蛋白質(zhì)。多維色譜技術(shù)（LC/LC-MS/MS）多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)第三十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三（三）蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定傳統(tǒng)方法：蛋白質(zhì)微量測序氨基酸組成分析新型蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)

——質(zhì)譜（MS）法基本原理：樣品分子離子化后，根據(jù)離子間質(zhì)荷比（m/z）的差異來分離并確定樣品的分子量。

第三十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三主要質(zhì)譜類型基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOFMS）電噴霧質(zhì)譜（electrosprayionizationmassspectrometry，ESI-MS）質(zhì)譜分析目前是經(jīng)2D分離的蛋白質(zhì)鑒定的核心技術(shù)第三十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三第三十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三第三十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三（四）蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)2D-PAGE分離的蛋白質(zhì)經(jīng)過識別與鑒定后，用圖像掃描儀數(shù)字化2D-PAGE膠上分離的蛋白質(zhì)，在蛋白圖形工作站上，應(yīng)用軟件，對數(shù)字化的蛋白點的分布部位，斑點面積和灰階、背景過濾、2-DE匹配與比較，建立參考圖譜；對蛋白質(zhì)鑒定的數(shù)據(jù)庫的搜索是蛋白質(zhì)組信息學(xué)的一大特點；第三十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三當(dāng)用2D-PAGE分離一個蛋白質(zhì)組后,應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)測定能夠刻劃蛋白質(zhì)屬性的各種屬性參數(shù)(attributeparameter),同時把已有數(shù)據(jù)庫(如OWL或dbEST)中的每一個序列轉(zhuǎn)換成相應(yīng)屬性參數(shù),形成屬性化的數(shù)據(jù)庫。然后以此屬性參數(shù),形成屬性化的蛋白質(zhì)或核酸數(shù)據(jù)庫。若搜索不到,那可能是新的蛋白質(zhì),就須采用傳統(tǒng)的生化鑒定。第三十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（一）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫（二）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（三）蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫（四）DIP數(shù)據(jù)庫瑞士的SWISS-PROT擁有目前世界上最大、種類最多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫目前應(yīng)用最普遍的數(shù)據(jù)庫是NRDB和dbEST數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫是蛋白質(zhì)組研究水平的標志和基礎(chǔ)第三十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的應(yīng)用（一）序列比較序列兩兩對比多序列對比（二）臨床診斷（三）腫瘤治療藥物的開發(fā)

第三十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三第四十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三五、蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法（一）蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究（二）蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)－核酸間相互作用研究第四十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的形式

1、蛋白質(zhì)亞基的聚合

2、交叉聚合

3、分子識別

4、分子的自我裝配

5、多酶復(fù)合體第四十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期三蛋白質(zhì)之間的相互作用力