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差別聚合酶鏈反應(yīng)定量檢測艾滋病患者外周血前病毒DNA水平差別聚合酶鏈反應(yīng)定量檢測艾滋病患者外周血前病毒DNA水平中華皮膚科雜志1998年第3期第31卷論著作者：范雪莉徐文嚴(yán)范江李子仁閆小君陳若延關(guān)鍵詞：聚合酶鏈反應(yīng)；差別；艾滋?。磺安《尽菊磕康臑榱嗽u價艾滋病的治療效果、篩選有效治療藥物，了解患者體內(nèi)病情變化，常常需要對治療前后患者體內(nèi)病毒水平進行客觀的定量。方法采用差別聚合酶鏈反應(yīng)，共同擴增待測靶基因HIV-1gag和參照模板B-globin基因，建立起檢測HIV-1復(fù)制水平的定量方法，并對8例艾滋病患者外周血前病毒DNA含量進行定量。結(jié)果8例患者的前病毒DNA水平介于0.508?2.210拷貝數(shù)/pgDNA之間，其復(fù)制和整合水平存在差異。結(jié)論該方法具有快速、可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點，非常適合于典型的臨床標(biāo)本的檢測，為艾滋病療效判定提供客觀依據(jù)。DifferentialPolymeraseChainReactionforQuantitationofHIVDNAinPeripheralBloodMononuclearCellofAIDSPatientsFanXueli,XuWenyan,FanJiang,etal.InstituteofDermatology,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Nanjing210042【Abstract】ObjectiveInordertoevaluatethetherapeuticeffect,toscreeneffectivedrugsforAIDS,andtofindoutthechangesofpatient'scondition,itisnecessarytodevelopanobjectivemethodtoquantitatethelevelsofviralloadofthepatientsbeforeandaftertreatment.MethodDifferentialPCR(D-PCR)wasusedtoco-amplifythetargetHIV-1gaggeneandreferencetemplateB-globingene,soastodeterminethelevelofHIVreplicationquantitatively.ThelevelsofHIVDNAintheperipheralbloodmononuclearcellsof8patientswithAIDSweredeterminedquantitatively.ResultsThelevelsoftheprovirusofthe8patientsrangedfrom0.508-2.210copies/pgDNA,thereweredifferencesinthelevelsofreplicationandintegration.ConclusionItistheauthors'opinionthatthismethodiseasytocontrolwithanadvantageofreliability,quicknessandreproducibility,Itissuitabletomeasureclinicalspecimens,andprovidesanobjectiveevidencefortheevaluationofresponsestotherapeuticintervention.Keywords】PCR,differentialAIDSProvirus在探索控制艾滋病的藥物及各種防治途徑的過程中，為了解病情變化，評價治療效果，常常需要對治療前后患者體內(nèi)病毒水平或核酸復(fù)制狀態(tài)進行客觀地定量。常用的方法包括Southern、Northern印跡和點印跡雜交，但這些方法由于敏感性低而不能檢出基因劑量的微小差別［1］。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)克服了上述缺點，可以分析極微量的DNA，并可同時擴增多種序列，并發(fā)展成為一種理想的核酸定量方法。我們在普通PCR的基礎(chǔ)上，在同一反應(yīng)體系中共同擴增HIV-1靶基因和參照模板，建立起差別PCR(DifferentialPCR,D-PCR)方法用以檢測艾滋病患者外周血單一核細胞(PBMC)中前病毒DNA水平。材料和方法（一）標(biāo)本：患者外周血標(biāo)本共8份采集于北京等作者單位：210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所［范雪莉（現(xiàn)在第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院皮膚科）、徐文嚴(yán)、范江、李子仁、陳若延］；全軍基因診斷技術(shù)應(yīng)用研究所（閆小君）地，其中7例為艾滋病患者，1例為HIV-1感染者，均經(jīng)初篩試驗和確證試驗證實其抗HIV-1抗體陽性。所有標(biāo)本均在P3實驗室處理提取DNA后運輸。（二） PBMC中DNA的提?。篜BMC的分離:抽取艾滋病患者（或HIV-1感染者）外周靜脈血5ml并用肝素抗凝，等體積生理鹽水稀釋后，將10ml淋巴細胞分層液緩慢加入血液層下方，2500r/min離心20分鐘后吸取中間層白細胞并用生理鹽水洗滌2次，離心后調(diào)整細胞濃度為106/ml。PBMCDNA的提?。喝?X106個細胞于1.5mlEppendorf管，用U-SDS裂解緩沖液（含尿素、十二烷基磺酸鈉等）和PBS裂解細胞，再經(jīng)酚、氯仿、異戊醇抽提蛋白、乙醇沉淀核酸后真空干燥，將沉淀溶于100》lTE緩沖液中，紫外分光光度計中測定DNA含量，表示為|Jg/pI,DNA樣品的濃度=A260X核酸稀釋倍數(shù)X50/1000。（三） 引物的設(shè)計：靶基因的擴增選擇HIV-1的高度保守區(qū)域gag基因，引物的序列為JF1：TGAGAGAACCAAGGGGAAGTGACAT和JF2：TAGTCTTACAATCTGGGTTCGCAT擴增片段的長度為314bp。參照基因選用單拷貝順序的人類B-珠蛋白（B-globin）基因，弓I物的序列為Po1：CAACTTCATCCACGTTCACC和Po2：GAAGAGCCAAGGACAGGTAC，擴增片段的長度為268bp［2］。（四） 差別PCR反應(yīng)：在0.5ml高壓滅菌的Eppendorf管內(nèi)加入10XPCR緩沖液、25mmol/LMgCl2、2.5mmol/LdNTPs各2.5pI,引物JF1、JF2和Po1、Po2的終濃度為0.4pmol/L，再加入模板5pI,然后用三蒸水將總體積補至25pI；表面覆蓋30pl石蠟油，97°C預(yù)變性5分鐘后，加入TaqDNA聚合酶1U,混勻、離心，進行熱循環(huán)，程序為：72C，45秒；94C，30秒；55C，45秒，共40個周期，最后在72C延伸5分鐘。PCR產(chǎn)物部分經(jīng)1.7%瓊脂糖凝膠電泳證實存在陽性條帶后，其余部分取10pl用于8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行兩種條帶的分離，70V電壓條件下恒壓電泳4?6小時。最后將凝膠置于EB染色液（0.5pg/pI）或銀染色液中進行染色，方法見有關(guān)文獻［3］；再于紫外或可見光源下觀察結(jié)果并照相，負片用于密度掃描。（五） 靶基因拷貝數(shù)的計算［4］：參照文獻按公式計算擴增管中靶基因拷貝數(shù)=靶基因擴增產(chǎn)物量/B-Globin基因擴增產(chǎn)物量。擴增產(chǎn)物量指每一條帶經(jīng)LKBXL-222-020可見光激光密度掃描儀（瑞典）于室溫下掃描時直接讀出的各峰面積的積分相對值，可直接代入公式計算。最后結(jié)果即每一標(biāo)本中的精確拷貝數(shù)為：管中靶基因拷貝數(shù)（拷貝數(shù)/pl）寧樣品DNA濃度（pg/pl）；單位為：拷貝數(shù)/pgDNAo結(jié)果我們首先用B-Globin基因和HIV-1gag基因的引物分別對艾滋病患者的DNA標(biāo)本進行擴增，得到較為清晰的、泳動速度有差別的兩種特異性條帶，分別為268bp和314bp,表明兩對引物擴增患者標(biāo)本的PCR反應(yīng)體系均正常，反應(yīng)條件良好。然后將質(zhì)粒pBH10DNA（含HIV-1全基因）按一定比例稀釋至經(jīng)U-SDS裂解緩沖液提取的正常人PBMCDNA中，加入兩對引物在同一反應(yīng)管中共同擴增，電泳后得到兩條能夠區(qū)分的條帶，但由于兩者分子量接近，因此在瓊脂糖凝膠電泳中分離時間較長。對8例艾滋病患者標(biāo)本用D-PCR方法進行HIV-1gag和B-Globin基因的共同擴增后，經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳后可觀察到兩條區(qū)分非常清晰的條帶；負片密度掃描后得到一具有兩個互不融合及交叉的波峰的清晰圖象。掃描所得到的各自波峰的面積即為每一條帶的強度值，按前述方法計算得出的每一標(biāo)本的拷貝數(shù)介于0.508?2.210/pgDNA（見附表），表明每一患者的HIV-1DNA整合水平不同。附表8例艾滋病患者外周血單一核細胞中前病毒DNA水平病例號DNA濃度（pg/pl）密度強度比拷貝數(shù)/pgDNA10.6000.7201.19920.6500.1251.92330.5520.4470.89840.4450.9012.02450.4400.8892.21060.5700.3060.53070.4850.2790.50880.5500.5130.932討論常規(guī)PCR存在其固有缺點，即只能給出陽性或陰性結(jié)果、鑒別目的DNA存在與否，不能反映基因量的變化,因此有許多作者采用同一管內(nèi)擴增內(nèi)參照模板，以校正PCR反應(yīng)中管與管之間的差異［5］。我們采用差別PCR方法對HIV-1感染者PBMC中前病毒DNA進行定量，選用單拷貝順序的細胞基因B-Globin基因與靶基因在同一管中共同擴增。對8例艾滋病患者PBMCDNA標(biāo)本分別進行B-Globin和HIV-1gag基因擴增，均得到陽性擴增條帶，證明DNA標(biāo)本穩(wěn)定；進一步將兩種引物在同一反應(yīng)管中雙重擴增，得到兩條區(qū)分清晰的條帶，表明反應(yīng)體系良好，而且由于用兩對引物同時擴增位于不同位置的同一條模板，這樣任何影響PCR反應(yīng)的因素應(yīng)同時影響到兩種模板的擴增。國外曾有許多作者采用類似的方法來進行基因水平的定量，如Lee等［6］［HT5曾選擇HLA-DQa基因作為內(nèi)參照模板也取得較為理想的結(jié)果。該方法的最大優(yōu)點是簡便易行，并且一次可將多份標(biāo)本同時檢測，非常適合于大樣本的藥物篩選。我們采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳使兩種條帶清楚地區(qū)分，然后用密度掃描儀對負片直接進行掃描讀數(shù)，得出良好結(jié)果。盡管每份標(biāo)本間拷貝數(shù)差別較大，但它并不反映該方法的誤差，因為實際上不同的患者之間病毒整合及復(fù)制水平是完全不同的，對同一（批）患者治療前后對比觀察是定量研究的意義所在。當(dāng)然，本方法也存在其局限性，如只能求出相對量等。為克服這種差別PCR的缺陷，我們認為有必要在此基礎(chǔ)上研制出更為客觀的競爭性定量PCR方法來對患者體內(nèi)病毒水平進行定量研究，這一點將對艾滋病治療特別是我國中草藥的篩選有著極大的推動作用。志謝本研究得到北京協(xié)和醫(yī)院傳染科王愛霞教授、北京第二傳染病院徐蓮芝主任的大力幫助參考文獻LewisDE,MinshallM,WrayNP,etal.ConfocalmicroscopicdetectionofHIV-1RNAproducingcells.JInfectDis,1990,162:1373-1378.BauerHM,TingY,GreerCE,etal.GenitalhumanpapillomavirusinfectioninfemaleuniversitystudentsasdeterminedbyaPCR-basedmethod.JAMA,1991,265:472-477.WidjojoatmodjoMN,FluitAC,ToblerLH,etal.RapididentificationofbacteriabyPCR-single-strandconformationpolymorphism.JClinMicrobiol,1994,32:3002-3007.薛開先,王亞平,陳森清,等.差別PCR技術(shù)及檢測卵巢癌C-erb-B2癌基因擴增的研究.癌變.畸變.突變,1995,7:31-33.FanJ,BassHZ,