實(shí)驗(yàn)七平板菌落計(jì)數(shù)與接種

實(shí)驗(yàn)七平板菌落計(jì)數(shù)與接種第1頁(yè)/共23頁(yè)平板菌落計(jì)數(shù)與接種一、目的要求二、實(shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)材料四、實(shí)驗(yàn)過(guò)程五、實(shí)驗(yàn)任務(wù)六、思考題微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)七——第2頁(yè)/共23頁(yè)一、目的要求學(xué)習(xí)平板菌落計(jì)數(shù)的基本原理和方法練習(xí)微生物接種和培養(yǎng)的基本技術(shù)，掌握無(wú)菌操作技術(shù)第3頁(yè)/共23頁(yè)二、實(shí)驗(yàn)原理

將待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后，其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見(jiàn)的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。為了清楚地闡述平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已趨向使用菌落形成單位(cfu)，而不以絕對(duì)菌落數(shù)來(lái)表示樣品的活菌含量。第4頁(yè)/共23頁(yè)三、實(shí)驗(yàn)材料樣品：取土試劑和儀器：

無(wú)菌水、無(wú)菌培養(yǎng)皿、無(wú)菌吸管、記號(hào)筆、接種環(huán)、接種針、酒精燈、標(biāo)簽紙、水浴鍋2人/組：稀釋平板計(jì)數(shù)用：6只平皿、2根三角玻棒、2支裝9ml無(wú)菌水的試管、4根無(wú)菌吸管、牛肉膏培養(yǎng)基；接種用：2支液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、2支半固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、2支黃豆餅粉固體斜面培養(yǎng)基。第5頁(yè)/共23頁(yè)四、實(shí)驗(yàn)過(guò)程（一）平板菌落計(jì)數(shù)（二）微生物的接種第6頁(yè)/共23頁(yè)（一）稀釋平板菌落計(jì)數(shù)1、編號(hào)與稀釋:每組取無(wú)菌平皿6只，一個(gè)稀釋度做3只。標(biāo)明10－3

和10－4各3只。2、制備土壤稀釋液：稱取土壤1g，制備10－2

土壤稀釋液，再取4只無(wú)菌試管稀釋制備10－3

、10－4菌液。3、倒平皿與平板涂布：取已熔化的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，倒入平皿中，冷卻凝固。分別吸取0.1ml上述制備的10－3或10－4菌液玻棒涂布，室溫靜置5－10min，使菌液吸附進(jìn)培養(yǎng)基，倒置于370C恒溫培養(yǎng)24h。

第7頁(yè)/共23頁(yè)4、觀察細(xì)菌菌落形態(tài)以及計(jì)數(shù)菌落：培養(yǎng)24h后，取出培養(yǎng)皿數(shù)菌落數(shù)，算出同一稀釋度三個(gè)平板上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進(jìn)行計(jì)算：每ml中菌落形成單位（cfu）＝同一稀釋度三次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10

5、計(jì)算出每g土壤中細(xì)菌的數(shù)量：即用某一培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)菌的菌落數(shù)乘以該培養(yǎng)皿接種液的稀釋倍數(shù)即得。第8頁(yè)/共23頁(yè)圖－1菌液逐級(jí)稀釋過(guò)程示意圖第9頁(yè)/共23頁(yè)第10頁(yè)/共23頁(yè)第11頁(yè)/共23頁(yè)接種方法：常用的有斜面接種法、平板接種法、液體接種法、試管深層固體培養(yǎng)基的穿刺接種法。接種工具：常用的有接種針、接種環(huán)、接種鉤、接種圈、接種鏟或接種鋤、玻璃涂棒等。（二）微生物的接種第12頁(yè)/共23頁(yè)第13頁(yè)/共23頁(yè)（1）斜面接種法（1支試管/人）使用黃豆餅粉斜面培養(yǎng)基，用接種環(huán)從平皿上挑取放線菌或霉菌單菌落。左手平托兩支試管，拇指按住試管底部。外側(cè)使是菌種試管，內(nèi)側(cè)是待接的空白斜面。（兩支試管的斜面同時(shí)向上），右手將棉塞旋松，以便在接種時(shí)容易拔出。右手拿接種環(huán)，在火焰上先將環(huán)端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部位也過(guò)火滅菌。將兩支試管的上端并齊，靠近火焰，用右手小指和掌心將兩支試管的棉塞一并夾住拔出，棉塞仍?shī)A在手中，然后讓試管口緩緩過(guò)火焰。第14頁(yè)/共23頁(yè)將已灼燒過(guò)的接種環(huán)伸入外側(cè)的菌種試管內(nèi)。先冷卻，而后再用環(huán)沾取一定量的菌苔，將沾有菌苔的接種環(huán)抽出試管。迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入另一支待接斜面試管的底部，輕輕向上劃線（直線或曲線）。接好種的斜面試管口再次過(guò)火焰，棉塞底部過(guò)火焰后立即塞入試管內(nèi)。將沾有菌苔的接種環(huán)在火焰上燒紅滅菌。先在內(nèi)焰中燒灼，使其干燥后，再在外焰中燒紅，以免菌苔驟熱，使菌體爆濺，造成污染。放下環(huán)后，再將棉塞旋緊，在試管斜面上距試管口2～3cm處貼上標(biāo)簽。280C恒溫培養(yǎng)。第15頁(yè)/共23頁(yè)試管拔塞后過(guò)火滅菌和取菌第16頁(yè)/共23頁(yè)斜面劃線法（a）和不同細(xì)菌直線接種長(zhǎng)出的菌苔形態(tài)（b）第17頁(yè)/共23頁(yè)（2）液體接種法（1支試管/人）使用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。用接種環(huán)從平皿上挑取細(xì)菌單菌落，接入液體培養(yǎng)基。放下環(huán)后，再將棉塞旋緊，在試管斜面上距試管口2～3cm處貼上標(biāo)簽。370C恒溫培養(yǎng)。（在培養(yǎng)量比較大的情況下，液體接種宜采用移液管接種，同時(shí)要求無(wú)菌操作。）第18頁(yè)/共23頁(yè)（3）穿刺接種（1支試管/人）使用牛肉膏蛋白胨半固體培養(yǎng)基。用接種針從平皿上挑取細(xì)菌單菌落，接入半固體培養(yǎng)基。用接種針經(jīng)火焰滅菌后，沾取少量菌種，垂直地穿入試管固體培養(yǎng)基中心至底部，然后沿著原接種線將針拔出，要做到手穩(wěn)、動(dòng)作輕巧迅速，最后塞上棉塞。再將接種針上殘留的菌體在火焰上燒掉。在試管斜面上距試管口2～3cm處貼上標(biāo)簽。370C恒溫培養(yǎng)。第19頁(yè)/共23頁(yè)圖4－8穿刺接種：（a）水平穿刺接種；（b）垂直穿刺接種第20頁(yè)/共23頁(yè)五、實(shí)驗(yàn)任務(wù)1、2人一組:

6只平皿稀釋平板計(jì)數(shù)，做2個(gè)稀釋度。24h觀察并計(jì)數(shù)。2、每人：

做1支斜面接種（接放線菌或霉菌），1支液體接種（接細(xì)菌），1支半固體穿刺接種（接細(xì)菌）。第21頁(yè)/共23頁(yè)六、思考題