實(shí)驗(yàn)免疫熒光技術(shù)

實(shí)驗(yàn)免疫熒光技術(shù)第1頁/共13頁實(shí)驗(yàn)六免疫熒光技術(shù)第2頁/共13頁熒光色素

許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：

1、異硫氰酸熒光素（FITC）：為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長為490495nm，最大發(fā)射光波長520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，是應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。

2、四乙基羅丹明

3、四甲基異硫氰酸羅丹明等第3頁/共13頁第4頁/共13頁實(shí)驗(yàn)原理利用熒光標(biāo)記第二抗體檢測未知Ag或未知Ab的方法。以檢測人血清中抗核抗體（ANA）為例。小鼠肝細(xì)胞作為抗原片，將病人血清加到抗原片上。如果血清中含有ANA，就會(huì)與細(xì)胞核成分發(fā)生特異性結(jié)合，再加入熒光素標(biāo)記的抗人IgG又可與ANA結(jié)合，在熒光顯微鏡下細(xì)胞核部位呈現(xiàn)熒光。第5頁/共13頁實(shí)驗(yàn)原理以檢測血清中ANA(抗核抗體)為例。

+ANA（1：5血清）+抗人IgG-FITC

鼠肝細(xì)胞一抗二抗

有熒光：+

熒光顯微鏡下觀察

無熒光：--

第6頁/共13頁實(shí)驗(yàn)方法1、抗原片的制備（肝印片）：小鼠斷頸處死剖腹取肝NS洗滌濾紙吸水肝臟剖面后，輕壓于載玻片上（壓2處）留下薄層肝細(xì)胞冷風(fēng)吹干95%乙醇固定5min再吹干。2、標(biāo)記：設(shè)待測孔、對(duì)照空白，分別用白蠟筆畫圈。3、加樣：待測孔（+）：加入100ul待測或?qū)φ昭蹇瞻讓?duì)照：加入100ulPBS4、用流水沖洗血清，置PBS液中(1,2,3缸)浸洗，每次5min，吹干。（整個(gè)清洗過程，動(dòng)作一定要輕柔）5、滴加稀釋的二抗：即抗人IgG-FITC，每圈100ul，置37度濕盒中30min。6、再置PBS液中(1,2,3缸)浸洗，每次5min，吹干。7、熒光顯微鏡下觀察，低倍鏡找視野，高倍鏡看結(jié)果。置37度濕盒中30min第7頁/共13頁實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞核發(fā)黃綠色熒光為“+”，陽性待檢血清作進(jìn)一步稀釋后可測定效價(jià)。不發(fā)熒光為“-”。根據(jù)細(xì)胞核著染熒光的圖像，可區(qū)分為：

均質(zhì)性：細(xì)胞核呈均勻一致的熒光。周邊性：核周呈現(xiàn)熒光。斑點(diǎn)型（顆粒型）：核內(nèi)呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀熒光。核仁型：核仁部分呈現(xiàn)熒光?；旌闲停簝煞N以上核染色。

第8頁/共13頁第9頁/共13頁第10頁/共13頁第11頁/共13頁注意事項(xiàng)抗原片要新鮮，厚薄一致，要盡量薄、