第一部分核酸的制備分離純化

第一部分核酸的制備分離純化第一頁，共二十三頁，2022年，8月28日核酸的制備（分離、純化）一、總論二、以質(zhì)粒DNA為例談DNA的分離純化三、以真核生物為代表介紹總RNA的純化四、核酸的進(jìn)一步純化（聚乙二醇、氯化銫梯度離心第二頁，共二十三頁，2022年，8月28日問題：分離核酸的基本依據(jù)、方法？核酸分離主要需要注意的是什么？DNA和RNA分離時的主要差別？第三頁，共二十三頁，2022年，8月28日不同的生物體中，核酸所處的環(huán)境不盡相同：1、核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密程度不同。2、DNA與RNA含量有差別。3、核酸分子量大小有差別。4、…..由于核酸性質(zhì)基本相同，生物體所組成的成分基本相同，因此，對于不同的生物體核酸的分離方法相差不大。第四頁，共二十三頁，2022年，8月28日以上是常見核苷酸結(jié)構(gòu)，中性PH下的離子狀態(tài)的鈉鹽形式。結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，性質(zhì)是分離的基礎(chǔ)。第五頁，共二十三頁，2022年，8月28日核酸的結(jié)構(gòu)特點：分子巨大，有共扼雙鍵、氫鍵、苷鍵、和磷酸二酯鍵，自由氨基、磷酸基。核酸的二級結(jié)構(gòu)：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)；RNA大多為單鏈，鏈的許多區(qū)域或自身發(fā)生回折，回折區(qū)內(nèi)的多核苷酸段呈螺旋結(jié)構(gòu)。第六頁，共二十三頁，2022年，8月28日核酸性質(zhì)—核酸性質(zhì)與其結(jié)構(gòu)和組分是密切相關(guān)的分子量大?。篟NA和DNA的分子量都很大。RNA分子量104-106

或者更大。DNA分子量1.6×106-2.2×109

。性狀和溶解度：DNA多為白色纖維狀固體。RNA為白色粉末。都微溶于水，他們的鈉鹽在水中溶解度較大，都溶于2-甲氧乙醇，但不溶于一般有機溶劑（如：乙醇、乙醚、氯仿、戊醇和三氯醋酸等）。吸收光譜：具有共扼雙鍵的嘌呤和嘧啶，故皆具有獨特的紫外吸收光譜。核酸在240-260nm的紫外波段有強烈的吸收峰。最大吸收值在260nm附近。通過OD260/OD280

的比值可判斷樣品的純度。純DNA的OD260/OD280=1.8，純RNA的OD260/OD280=2.0。核酸中若含雜蛋白或苯酚則比值明顯降低。對于純核酸樣品只要讀出260nm的OD值，即可算出含量，通常：1OD260=50ug/ml（雙螺旋DNA）、1OD260=40ug/ml（單螺旋DNA或RNA）、1OD260=20ug/ml（寡核苷酸）。變性：加熱、強酸堿或射線及一切可破壞核酸分子氫鍵的處理。變性后的核酸理化性質(zhì)、生物功能都會有顯著變化，最重要表現(xiàn)為粘度下降。降解：酸、堿、核酸酶都可使核酸不同程度的降解。第七頁，共二十三頁，2022年，8月28日分離核酸共同要考慮的防止核酸變性與降解：①低溫操作。②分離過程需加入必要的核酸解聚酶的抑制劑（如：乙二胺四乙酸（EDTA）、檸檬酸鹽、皂土、8-羥基喹啉、SDS、苯酚等）脫蛋白：在生物體內(nèi)核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合以核蛋白形式存在，核酸所處的任何生物環(huán)境都含有蛋白質(zhì)，所以在核酸純化過程中需使用脫蛋白劑。（如：氯仿、苯酚、SDS、蛋白酶等使蛋白質(zhì)降解或變性，達(dá)到與核酸分離的目的。DNA和RNA的分離：1、利用DNA和RNA在不同鹽濃度下，溶解度不同進(jìn)行分離（DNA在1-2M時溶解度大，RNA溶解度小。相反，RNA在低鹽濃度0.14M時溶解度大，DNA小。）2、通過使用DNA或RNA酶，達(dá)到DNA和RNA分離的目的。3、根據(jù)分子量不同，進(jìn)行梯度離心，進(jìn)行分離。核酸的收集：多用乙醇、異丙醇第八頁，共二十三頁，2022年，8月28日質(zhì)粒DNA純化細(xì)菌培養(yǎng)

從LB瓊脂扳上挑取一個單菌落。接種到含有適當(dāng)抗生素的20ml液體LB中。37℃搖床培養(yǎng)過夜（OD＝0.6）。

將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入500ml含抗生素的液體LB培養(yǎng)基中。37℃300rpm約3～4hr（OD=0.4）。

加入2.5ml氯霉素（34mg/ml溶于乙醇），使終濃度為170ug/ml。

300rpm37℃

繼續(xù)培養(yǎng)

12～16hr。

離心

4℃4000rpm15min。

棄上清。

將細(xì)菌沉淀重懸于100ml預(yù)冷的STE中。

離心

4℃4000rpm15min。

棄上清，收集細(xì)菌細(xì)胞。

LB培養(yǎng)基

Trypone10g

Yeastextract5g

NaCl10g

加水至1L

STE：0.1mol/LNaCl

10mmol/LTris.CL（PH8）1mmol/LEDTA（PH8）

第九頁，共二十三頁，2022年，8月28日1、酚提取法：將收獲的細(xì)胞重懸在20ml含20％蔗糖的TES中。

加入新鮮配制的溶菌酶到終濃度為1mg/ml（枯草桿菌和大腸桿菌）或5mg/ml（蘇蕓金桿菌）。37℃保溫30—90分鐘，原生質(zhì)游離出來。向原生質(zhì)溶液中加8％SDS20ml和5MNaCl10ml。

68℃保溫5min。將溶液儲于4℃冰箱，8hr以上或過夜。取出后，立即在4℃離心18000rpm,30min。取上清。向上清中加入等體積的重蒸酚（PH6—7），輕搖。置冰箱15min，離心取水相。重復(fù)一次。再用等體積的氯仿—異戊醇（24：1）抽提1—2次。離心取水相。加入等體積的乙醚抽提1—2次。向水相加兩倍體積95％冷乙醇。－20℃過夜或－70℃半小時。離心15000rpm,20min,沉淀DNA。

75％的乙醇洗滌一次，室溫或真空干燥。沉淀溶于PH8的TE緩沖液中。第十頁，共二十三頁，2022年，8月28日2、堿裂解法

將細(xì)菌沉淀重懸于10mlSlution1中。

加入1ml新配制的溶菌酶。

加入20ml新配制Slution2，充分混勻。

放置5—10min(0℃)。

加入15ml預(yù)冷的Slution3

混勻

置冰上10min離心，4℃，10000rpm/min,15min取上清并加入0.6倍體積的異丙醇充分混勻

室溫放置10分鐘

離心，室溫5000rpm,15min棄上清，用70％乙醇洗滌棄乙醇，干燥。

用3mlTE(PH8)溶解核酸沉淀可用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心或聚乙二醇沉淀繼續(xù)純化

SlutionI

50mmol/L葡萄糖

25mmol/LTris·Cl(PH8)

10mmol/LEDTA(PH8)

Slution20.2mol/LNaOH(用時用

10mol/L儲存液稀釋)

1％SDS

Slution35mol/L乙酸鉀60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml

第十一頁，共二十三頁，2022年，8月28日3、煮沸裂解法：

將細(xì)菌沉淀物重懸于預(yù)冷的10mlSTET中

加入1ml(10mg/ml,溶于10mmol/LTris,PH8)新配制的溶菌酶

室溫下放置10分鐘明火加熱至沸騰，并不停搖晃

立即將其浸入沸水中40秒

再將其浸入冰水中5分鐘離心，4℃15000rpm,30min

取上清，用乙醇或異丙醇沉淀

可繼續(xù)用氯化銫－溴化乙錠梯度離心純化

STET

0.1mol/LNaCl10mmol/LTris.Cl(PH8)

1mmol/LEDTA(PH8)

5％TritonX—100

第十二頁，共二十三頁，2022年，8月28日4、SDS裂解法：

將細(xì)菌沉淀物重懸于10ml，預(yù)冷的10％蔗糖，50mmol/LTris.Cl(PH8)溶液中加入新配制的溶菌酶溶液加入8ml0.25mol/LEDTA(PH8)溶液，搖勻。置冰上10分鐘加4ml10%SDS,馬上用玻璃棒迅速混勻內(nèi)容物。立即加入6ml5mol/LNaCl(使終濃度為1M〕混勻。置冰上>1hr離心15000rpm,30min取上清

酚：氯仿和氯仿各抽提一次取水相，并加兩倍體積乙醇，混勻。放置室溫下1－2小時離心，4℃5000rpm20min。棄上清，用70％乙醇洗滌離心，4℃5000rpm20min，取沉淀。用3mlTE(PH8)溶解DNA可用氯化銫－溴化乙錠梯度離心繼續(xù)純化第十三頁，共二十三頁，2022年，8月28日DNA繼續(xù)純化聚乙二醇沉淀法純化DNA：取3ml溶于TE中的核酸溶液，加入3ml預(yù)冷5mol/LLiCl溶液，充分混勻。離心，4℃10000rpm10min

取上清并加入等體積的異丙醇，混勻。離心，室溫，10000rpm10min棄上清，用70％乙醇洗滌沉淀保留沉淀并用500ul含胰RNA酶（20ug/ml）的TE（PH8〕溶解沉淀。室溫放置半小時加入500ul含13％（W/V）聚乙二醇的1.6mol/LNaCl，充分混勻。離心，4℃12000rpm5min去上清，保留沉加入400ulTE(PH8)溶解沉淀用酚、酚：氯仿、氯仿各抽提一次取水相并加入100ul10ml/L乙酸銨混勻，并加入兩倍體積乙醇室溫放置10min離心，4℃12000rpm5min回收沉淀加入200ul4℃的70％乙醇，混勻。棄上清，等乙醇蒸發(fā)殆盡500ulTE（PH8〕溶解沉淀儲存DNA于－20℃或－70℃第十四頁，共二十三頁，2022年，8月28日DNA繼續(xù)純化1、氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)DNA（連續(xù)梯度離心法〕精確測量DNA溶液的體積按1g/ml的用量加入固體CsCl加熱至30℃并溫和混勻。每10mlDNA溶液加入0.8ml溴化乙錠溶液（10mg/ml溶于水〕立即將其于DNA－氯化銫溶液混勻離心，室溫8000rpm5min將下層清亮紅色溶液轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)碾x心管中用輕石蠟油加滿，并封口。離心，20℃45000rpm>16hr結(jié)果第十五頁，共二十三頁，2022年，8月28日DNA繼續(xù)純化收集閉環(huán)DNA從DNA中除去溴化乙錠2、不連續(xù)梯度離心：此方法是將不同濃度的CsCl溶液分層加到離心管中，

這樣可加速CsCl梯度的形成，使離心時間減少到6hr。

第十六頁，共二十三頁，2022年，8月28日從經(jīng)過純化的質(zhì)粒DNA中去除溴化乙錠方法1：有機溶劑抽提將DNA溶液放入試管中加等體積的飽和1－丁醇或異戊醇振蕩混勻兩相離心，室溫1500rpm3min取水相反復(fù)抽提4－6次直到粉紅色從水相中和有機相中消失。第十七頁，共二十三頁，2022年，8月28日從經(jīng)過純化的質(zhì)粒DNA中去除溴化乙錠方法2：離子交換層析

如圖所示，用吸管裝一支DowexAG50樹脂的柱子（裝柱前需將樹脂進(jìn)行平衡）。平衡方法如下：1、適量DowexAG50樹脂溶于100ml1mol/LNaOH中，攪拌5分鐘，待樹脂沉淀后，吸出上清棄去。2、加100ml1mol/LHCl，繼續(xù)攪拌5分鐘，樹脂沉淀后，吸出上清棄去。3、用水重復(fù)步驟兩次（每次100ml），然后用TEN緩沖液（100ml）重復(fù)步驟2一次。TEN緩沖液：（0.1mol/LTris.Cl(pH8.0)，0.01mol/LEDTA(pH8.0)，1mol/LNaCl）4、于4℃將樹脂儲存于含0.2%疊氮鈉的TEN緩沖液中。

吸去樹脂上的緩沖液，用2倍體積的TE（Ph8.0）洗柱，將含有溴化乙錠和氯化銫的DNA直接加到樹脂上。收集流出物，當(dāng)所有DNA溶液進(jìn)入柱子后，用1.2倍柱體積洗脫，同時繼續(xù)收集流出物。

柱子流干后，將收集的流出物用2倍體積的水稀釋。

用6倍體積的乙醇，于4℃下，沉淀DNA15分鐘。

4℃，1200轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，收集DNA沉淀。

用4℃的70%乙醇洗沉淀，按上步重新離心，取沉淀。

用適量TE（pH8.0）溶解DNA。第十八頁，共二十三頁，2022年，8月28日RNA純化中很重要的一個任務(wù)是：嚴(yán)格控制RNA酶的活性??！因為，所有的組織、人的手指、試劑、容器等中均存在或被污染RNA酶，所以，在對RNA純化前，需做大量的準(zhǔn)備工作。常使用的RNA酶的抑制劑：（1）

焦碳酸二乙酯（DEPC）：它是RNA酶的化學(xué)修飾試劑。它和RNA酶的活性基團—組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活。（2）

異硫氰酸胍（GITC）：目前認(rèn)為是制備RNA最有效的抑制劑。它除了對RNA酶有強烈的變性作用外，還具有使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，核酸從核蛋白中解離的作用。（3）

釩氧核苷酸復(fù)合物：是氧化釩離子和任何核苷形成的復(fù)合物?？膳cRNA酶結(jié)合，而抑制酶活。（4）

RNA酶抑制蛋白：是一種對RNA酶有抑制作用的蛋白質(zhì)。其它如肝素、DTT、SDS等都是RNA酶的抑制劑，在RNA提純中經(jīng)常使用第十九頁，共二十三頁，2022年，8月28日動物組織總RNA的制備

一、

試劑：變性液（儲存于棕色瓶中）：配制體積：52.8ml終濃度

儲存液

異硫氰酸胍

4M—

25g檸檬酸鈉

25mM0.75M(pH7.0)1.76ml十二烷基氨酸鈉

0.5%10%(warmto65℃)2.64mlDEPC-ddH2O—

—

29.3ml以上混合液可放置室溫下3個月。用前加入0.36mlβ巰基乙醇。加入β巰基乙醇后，室溫下可使用1個月。

其于常規(guī)試劑配制不列舉。

第二十頁，共二十三頁，2022年，8月28日方法：殺死小鼠，放血。迅速取出所需組織（按所需而定）用DEPC-ddH2O清洗一下，立即仍到液氮中。

取4-5ml變性液入一洗凈的研缽中備用從液氮中取出凍好的組織放入一不銹鋼研缽中，倒入一些液氮，將其碾碎。（在此過程中，需保證組織不解凍）也可在有變性液存在下用組織勻漿機進(jìn)行破碎。將已碾成粉末的組織轉(zhuǎn)移至放有變性液的研缽中，迅速研磨并不斷加入液氮，反復(fù)如此，直至組織完全碾碎。取數(shù)個已滅菌的新EP管中，各加入0.5ml變性液和組織勻漿每EP管中加入50ul3.0MNaAc(pH4.7)混勻（輕彈）。每EP管中加入500ul水飽和酚，加氯仿-異戊醇（49：1），100ul。旋渦混合器振動1分鐘。冰浴15分鐘。12000轉(zhuǎn)/分，4℃20分鐘。轉(zhuǎn)移上層水相至另一EP管中。

加等體積預(yù)冷的異丙醇0/N（-20℃）。離心，12000轉(zhuǎn)/分，20分鐘。棄上清，沉淀溶于200ul變性液中。加入10.8ul3MNaAc(pH4.5)

加等體積水飽和酚及1/5體積的氯仿-異戊醇混合物旋渦混合1分鐘，冰浴20分鐘。離心12000轉(zhuǎn)/分，4℃20分鐘。轉(zhuǎn)移水相至另一EP管中，加等體積異丙醇。-20℃1小時。離心12000轉(zhuǎn)/分，4℃20分鐘棄上清，沉淀加120ul變性液Vortex溶解加等體積冷異丙醇，-20℃1小時。離心12000轉(zhuǎn)/分，4℃20分鐘棄上清，沉淀用75%乙醇懸浮離心12000轉(zhuǎn)/分，4℃10分鐘棄上清，室溫或真空干燥。用DEPC-ddH2O溶解RNA（檢查RNA制備質(zhì)量，測OD260/OD280用1-2ul樣品電泳觀察。）第二十一頁，共二十三頁，2022年，8月28日在含有甲醛的凝膠中，進(jìn)行RNA電泳是目前常用的方法。

甲醛凝膠電泳緩沖液：20*硼酸緩沖液（pH8.3）5*MOPS緩沖液