第三章 發(fā)酵液預(yù)處理

第三章發(fā)酵液預(yù)處理第一頁，共五十五頁，2022年，8月28日微生物菌體及殘存的固體培養(yǎng)基外，還有未被微生物完全利用的糖類、無機鹽、蛋白質(zhì)，以及微生物的各種代謝產(chǎn)物。發(fā)酵液成分目的

分離菌體和其他懸浮顆粒，除去部分可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液的性質(zhì)，以利于提取和精制后繼各工序的順利進行。第二頁，共五十五頁，2022年，8月28日對于胞外產(chǎn)物，經(jīng)預(yù)處理應(yīng)盡可能使目的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到液相，然后經(jīng)固液分離除去固相；

對于胞內(nèi)產(chǎn)物，則應(yīng)首先收集菌體或細胞，經(jīng)細胞破碎后，目的產(chǎn)物進入液相，隨后再將細胞碎片分離。方法選擇第三頁，共五十五頁，2022年，8月28日一、發(fā)酵液過濾特性的改變①發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，大多為1％一10％，懸浮液

中大部分是水；②懸浮物顆粒小，相對密度與液相相差不大；③固體粒子可壓縮性大；④液相粘度大，大多為非牛頓型流體；⑤性質(zhì)不穩(wěn)定，隨時間變化，如易受空氣氧化、微生

物污染、蛋白酶水解等作用的影響。這些特性使得發(fā)酵液的過濾與分離相當困難。（一）微生物發(fā)酵液的特性第四頁，共五十五頁，2022年，8月28日

（二）改善發(fā)酵液過濾特性的物理化學(xué)方法

通過對發(fā)酵液進行適當?shù)念A(yù)處理，即可改善其流體性能，降低濾餅比阻，提高過濾與分離的速率。

1.降低液體粘度：

根據(jù)流體力學(xué)原理，濾液通過濾餅的速率與液體的粘度成反比，降低液體粘度可有效提高過濾速率。注意加熱溫度與時間，不影響產(chǎn)物活性和細胞的完整性。

有加水稀釋法和加熱法第五頁，共五十五頁，2022年，8月28日

pH值直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，適當調(diào)節(jié)pH值可改善其過濾特性。

氨基酸、蛋白質(zhì)等電點的調(diào)節(jié)；在膜過濾中，發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)易與膜發(fā)生吸附，通過調(diào)整pH值改變易吸附分子的電荷性質(zhì)，即可減少堵塞和污染；細胞、細胞碎片及某些膠體物質(zhì)等在某個pH值下也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于過濾的進行。

主要有等電點沉淀法

2.調(diào)整pH第六頁，共五十五頁，2022年，8月28日

采用凝聚和絮凝技術(shù)能有效改變細胞、細胞碎片及溶解大分子物質(zhì)的分散狀態(tài)，使其聚結(jié)成較大的顆粒，便于提高過濾速率。另外，還能有效地除去雜蛋白和固體雜質(zhì)，提高濾液質(zhì)量。

3.凝聚與絮凝第七頁，共五十五頁，2022年，8月28日助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，它能使濾餅疏松，濾速增大。懸浮液中大量的細微膠體粒子被吸附到助濾劑的表面上，改變了濾餅結(jié)構(gòu)，降低了過濾阻力。4.加入助濾劑

常用的助濾劑硅藻土、纖維素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等。最常用的是硅藻土，使用時，通常細粒用量為500g/m3；中等粒度用量為700g/m3；粗粒用量為700-1000g/m3。

第八頁，共五十五頁，2022年，8月28日

加入反應(yīng)劑和某些可溶性鹽類發(fā)生反應(yīng)生成不溶性沉淀，如CaSO4，AlPO4等。生成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，沉淀本身可作為助濾劑，且能使膠狀物和懸浮物凝固，改善過濾性能；如發(fā)酵液中含有不溶性多糖物質(zhì)，用酶將其轉(zhuǎn)化為單糖，以提高過濾速率。如萬古霉素用淀粉作培養(yǎng)基，發(fā)酵液過濾前加入0.025%的淀粉酶，攪拌30min后，再加2.5%硅藻土助濾劑，可提高過濾效率5倍。

不影響目的產(chǎn)物，可消除發(fā)酵液中某些雜質(zhì)對過濾的影響，提高過濾速率。

5.加入反應(yīng)劑：第九頁，共五十五頁，2022年，8月28日（三）凝聚與絮凝凝聚和絮凝技術(shù)能有效地改變細胞、菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，使聚集起來，增大體積，以便于過濾，常用于菌體細小而且粘度大的發(fā)酵液的預(yù)處理中。

通常發(fā)酵液中細胞或菌體帶有負電荷，由于靜電引力的作用使溶液中帶相反電荷的粒子（即正離子）被吸附在其周圍，在界面上形成了雙電層。但是這些正離子還受到使它們均勻分布開去的熱運動的影響，具有離開膠粒表面的趨勢，在這兩種相反作用的影響下，雙電層就分裂成兩部分。第十頁，共五十五頁，2022年，8月28日

在相距膠核表面約一個離子半徑的Stern平面以內(nèi)，正離子被緊密束縛在膠核表面，稱為吸附層或緊密層；在stern平面以外，剩余的正離子則在溶液中擴散開去，距離越遠，濃度越小，最后達到主體溶液的平均濃度，稱為擴散層。這樣就形成了擴散雙電層的結(jié)構(gòu)模型，如圖所示。第十一頁，共五十五頁，2022年，8月28日擴散雙電層的結(jié)構(gòu)模型圖第十二頁，共五十五頁，2022年，8月28日

當膠粒在溶液中作相對運動時，總有一薄層液體隨著它一起滑移，這一薄層，厚度比吸附層稍大，滑移面（剪切面）在圖14－l中用波紋線表示。

第十三頁，共五十五頁，2022年，8月28日

這三種電位中只有ζ電位能實際測得，所以可以認為是控制膠粒間電排斥作用的電位，用來表征雙電層的特征。

ζ＝4πqδ/D

D—水的介電常數(shù)；q—膠體的電動電荷密度，即滑移面上的電荷密度；δ—擴散層的有效厚度，即為吸附層和擴散層界面處

電位φd降低到其值為1/e處的距離，第十四頁，共五十五頁，2022年，8月28日ζ電位與擴散層厚度δ和電動電荷密度q成正比，而擴散層厚度又與溶液中離子強度有關(guān)，當雙電層的排斥力不足以抗衡膠粒間的范德華引力時，由于熱運動的結(jié)果導(dǎo)致膠粒的互相碰撞而聚集起來。在發(fā)酵液中加入具有高價陽離子的電解質(zhì)，能降低ζ電位和脫除膠粒表面的水化膜，就能導(dǎo)致膠粒間的凝聚作用。第十五頁，共五十五頁，2022年，8月28日凝聚：指在電解質(zhì)作用下，由于膠粒之間雙電層電排

斥作用降低，電位下降，而使膠體體系不穩(wěn)

定的現(xiàn)象。

凝聚值：使膠粒發(fā)生凝聚作用的最小電解質(zhì)濃度。

反離子的價數(shù)越高，該值就越小，即凝聚能

力越強。

1、凝聚第十六頁，共五十五頁，2022年，8月28日硫酸鋁Al2(SO4)3?18H2O（明礬）；氯化鋁AlCl3?6H2O;三氯化鐵FeCl3;硫酸亞鐵FeSO4·7H2O；石灰；ZnSO4；MgCO3陽離子對帶負電荷的膠粒凝聚能力的次序Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+常用的凝聚劑電解質(zhì)有：第十七頁，共五十五頁，2022年，8月28日2、絮凝絮凝：指在某些高分子絮凝劑存在下，基于橋架作用，

使膠粒形成較大絮凝團的過程。絮凝劑：是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對

分子質(zhì)量可高達數(shù)萬至一千萬以上，它們具有長鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上含有許多活性官能

團，

包括帶電荷的陰離子或陽離子基團以及

不帶電荷的非離子型基團。

第十八頁，共五十五頁，2022年，8月28日它們通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，強烈地吸附在膠粒的表面。當一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上，產(chǎn)生橋架聯(lián)結(jié)時，就形成了較大的絮團，這就是絮凝作用。第十九頁，共五十五頁，2022年，8月28日工業(yè)上使用的絮凝劑可分為三類：1）有機高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物；2）無機高分子聚合物，如聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等；3）天然有機高分子絮凝劑，如聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等。目前最常見的高分子聚合物絮凝劑有機合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）類衍生物根據(jù)活性基團在水中解離情況不同，可分為三類：非離子型、陰離子型（含有羧基）陽離子型（含有胺基）第二十頁，共五十五頁，2022年，8月28日1）有機高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物；2）無機高分子聚合物，如聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等；3）天然有機高分子絮凝劑，如聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等。工業(yè)上使用的絮凝劑第二十一頁，共五十五頁，2022年，8月28日有機合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）類衍生物根據(jù)活性基團在水中解離情況不同，可分為三類：目前最常見的高分子聚合物絮凝劑非離子型

陰離子型（含有羧基）

陽離子型（含有胺基）第二十二頁，共五十五頁，2022年，8月28日用量少，一般以mg/L計量；絮凝體粗大，分離效果好；絮凝速度快；種類多，適用范圍廣。聚丙烯酰胺類絮凝劑的優(yōu)點存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，用于食品和醫(yī)藥工業(yè)時應(yīng)謹慎。聚丙烯酰胺類絮凝劑的缺點第二十三頁，共五十五頁，2022年，8月28日醫(yī)藥和食品工業(yè)：聚丙烯酸類陰離子絮凝劑（無毒），聚苯乙烯類衍生物，無機高分子聚合物絮凝劑（聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等），天然有機高分子絮凝劑（多聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等）。聚丙烯酰胺類絮凝劑的應(yīng)用第二十四頁，共五十五頁，2022年，8月28日

絮凝的效果與絮凝劑的加量、相對分子質(zhì)量和類型、溶液的pH、攪拌轉(zhuǎn)速和時間等因素有關(guān)。在絮凝過程中，常需加入一定量助凝劑以增加絮凝效果。較多的絮凝劑有助于增加橋架數(shù)量，但過多的添加量反而會引起吸附飽和，絮凝劑爭奪膠粒而使絮凝團的粒徑變小，絮凝效果下降。第二十五頁，共五十五頁，2022年，8月28日第二十六頁，共五十五頁，2022年，8月28日對于帶負電荷的菌體或蛋白質(zhì)來說，采用陽離子型高分子絮凝劑同時具有降低膠粒雙電層電位和產(chǎn)生吸附橋架的雙重機理；對于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，要采用凝聚和絮凝雙重機理才能提高過濾效果，這種包括凝聚和絮凝機理的過程，稱為混凝。3、混凝第二十七頁，共五十五頁，2022年，8月28日二、發(fā)酵液的相對純化

發(fā)酵液中雜質(zhì)很多，其中有些雜質(zhì)不僅直接影響產(chǎn)品質(zhì)量利收得率，同時對后繼提取和精制有很大影響。發(fā)酵液中的雜質(zhì)（1）高價無機離子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）在采用離子交換提煉時，會影響樹脂對生化物質(zhì)的交換容量。第二十八頁，共五十五頁，2022年，8月28日在采用離子交換和吸附法提取時會降低其交換容量和吸附能力，在有機溶劑法或雙水相萃取時，易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，使兩相分離不清。在常規(guī)過濾或膜過濾時，易使過濾介質(zhì)堵塞或受污染，影響過濾效率。

因此，在預(yù)處理時，應(yīng)盡量除去這些物質(zhì)。（2）雜蛋白第二十九頁，共五十五頁，2022年，8月28日1.Ca2+：草酸、草酸鈉→形成草酸鈣沉淀

但草酸價格較貴，加入硫酸鉛，在60℃下反應(yīng)生成草酸鉛。后者在90－95℃下用硫酸分解，經(jīng)過濾、冷卻、結(jié)晶后可以回收草酸。草酸鎂的溶解度較大。故加入草酸不能除盡鎂離子。要除去鎂離子，

可以加入三聚磷酸鈉，它和鎂離子形成可溶性絡(luò)合物Na5P3O10＋Mg＋＋＝MgNa3P3O10＋2Na十2.Mg2+：三聚磷酸鈉→形成三聚磷酸鈉鎂（可溶性絡(luò)合物）3.Fe2+——黃血鹽，→普魯士蘭沉淀（一）高價無機離子的去除方法第三十頁，共五十五頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)一般以膠體狀態(tài)存在于發(fā)酵液中。在酸性溶液中帶正電荷；在堿性溶液中帶負電荷。在某一pH下，凈電荷為零，溶解度最小，稱為等電點。（二）雜蛋白的去除方法第三十一頁，共五十五頁，2022年，8月28日在酸性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陰離子，如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀；在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陽離子，如Ag+、Cu++、Zn++、Fe+++和Pb++等形成沉淀。由于羧基的電離度比氨基大，故蛋白質(zhì)的酸性性質(zhì)通常強于堿性，因而很多蛋白質(zhì)的等電點都在酸性范圍內(nèi)（pH4.0－5.5）。但單靠調(diào)節(jié)pH至等電點的辦法不能將大部分蛋白質(zhì)除去。1.酸堿調(diào)節(jié)，使蛋白質(zhì)與鹽或離子形成沉淀第三十二頁，共五十五頁，2022年，8月28日加熱，大幅度調(diào)節(jié)pH值，加酒精、丙酮等有機溶劑或表面活性劑等。不足之處:加熱法只適合于對熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端pH值也會導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且要消耗大量酸堿；有機溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場合

2.變性法

第三十三頁，共五十五頁，2022年，8月28日加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質(zhì)而除去。在四環(huán)素類抗生素中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀的膠狀沉淀來吸附蛋白質(zhì)；在枯草桿菌發(fā)酵液中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。3.吸附法第三十四頁，共五十五頁，2022年，8月28日三、固液分離工程及設(shè)備范圍：培養(yǎng)基、發(fā)酵液、某些中間產(chǎn)品和半成品。

其中發(fā)酵液由于種類多、粘度大和成分復(fù)雜，分離最為困難。方法：分離篩、重力沉降、浮選分離、離心分離

和過濾等，其中用于發(fā)酵液固液分離的主

要是離心分離和過濾分離。第三十五頁，共五十五頁，2022年，8月28日重力沉降

浮選通氣，產(chǎn)生氣泡，使固體附著在氣泡表面除去。

用于固液比重差小、直徑5～30μm顆粒的分離，污水處理旋液分離懸浮液以較高速度沿切線方向進入旋風(fēng)分離器，輕相由分離器中央排出，重相由分離器下部排出，但不適合直徑<5μm顆粒去除（可用絲網(wǎng)分離器）。介質(zhì)過濾

霉菌和放線菌為絲狀菌，體形較大，發(fā)酵液采用過濾方法；細菌和酵母菌為單細胞，體形較小，其發(fā)酵液采用高速離心

分離，

如對發(fā)酵液進行預(yù)處理，也可用過濾進行固液分離。離心

工業(yè)上常用第三十六頁，共五十五頁，2022年，8月28日1.原理：利用轉(zhuǎn)鼓高速轉(zhuǎn)動所產(chǎn)生的離心力，來實現(xiàn)懸浮液、乳濁液的分離或濃縮。2.優(yōu)點：分離速率快、分離效率高、液相澄清度好等。3.缺點：設(shè)備投資高、能耗大。此外，連續(xù)排料時，固相干度不如過濾設(shè)備。4.種類：種類多，按其作用原理不同，可分為過濾式

離心機和沉降式離心機兩大類。（一）離心分離第三十七頁，共五十五頁，2022年，8月28日5.離心機種類：a.碟片式離心機第三十八頁，共五十五頁，2022年，8月28日b.管式離心機第三十九頁，共五十五頁，2022年，8月28日C.傾析式離心機第四十頁，共五十五頁，2022年，8月28日（二)過濾微生物發(fā)酵液中含有大量菌體、細胞或細胞碎片以及殘余的固體培養(yǎng)基成分。過濾就是將懸浮在發(fā)酵液中的固體顆粒與液體進行分離的過程。在過濾操作中，要求濾速快、濾液澄清，并且有高的收率。1.原理：懸浮液通過過濾介質(zhì)時，固態(tài)顆粒與溶液分離。2.類型：澄清過濾濾餅過濾第四十一頁，共五十五頁，2022年，8月28日

過濾介質(zhì)為硅藻土、砂、顆?；钚蕴?、玻璃珠、塑料顆粒等。當懸浮液通過濾層時，固體顆粒被阻攔或吸附在濾層的顆粒上，使濾液得以澄清。適合于固體含量少于0.1g/100mL、顆粒直徑在5-100um的懸浮液的過濾分離，如河水、麥芽汁、酒類和飲料等的澄清。（1）澄清過濾：第四十二頁，共五十五頁，2022年，8月28日過濾介質(zhì)為濾布，包括天然或合成纖維織布、金屬織布、玻璃纖維紙、合成纖維等無紡布。當懸浮液通過濾布時，固體顆粒被濾布阻攔而逐漸形成濾餅（濾渣）。當濾餅至一定厚度時即起過濾作用，此時即可獲得澄清的濾液，這種方法叫做濾餅過濾。在濾餅過濾中，懸浮液本身形成的濾餅起著主要的過濾作用，適合于固體含量大于0.1g/100mL的懸浮液的過濾分離。

（2）濾餅過濾：第四十三頁，共五十五頁，2022年，8月28日

廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基制備的過濾及霉菌、放線菌、酵母菌和細菌等多種發(fā)酵液的固液分離。適合

于固體含量1-10%的懸浮液的分離。優(yōu)點：過濾面積大，結(jié)構(gòu)簡單，價格低，動力消耗少，對不同過濾特性的發(fā)酵液適應(yīng)性強。缺點：不能連續(xù)操作，設(shè)備笨重，勞動強度大，衛(wèi)生

條件差，非過濾的輔助時間較長。

3.常用過濾設(shè)備（1）板框壓濾機第四十四頁，共五十五頁，2022年，8月28日單元組成板布板布板操作注意點盡量使工作時間和輔助時間接近；降低濾液粘度第四十五頁，共五十五頁，2022年，8月28日第四十六頁，共五十五頁，2022年，8月28日(2)真空轉(zhuǎn)鼓過濾機第四十七頁，共五十五頁，2022年，8月28日（3）硅藻土過濾機硅藻土：較純二氧化硅礦石?；瘜W(xué)性能穩(wěn)定，具有極大的吸附和滲透能力，是良好的介質(zhì)和助濾劑。使用方法：

a.作為深層過濾介質(zhì)，以過濾含少量(＜0．1％)懸

浮固形物的液體。硅藻土不規(guī)則粒子間形成許多曲折的毛細孔道，篩分和吸附作用除去懸浮液中的固體粒子。

第四十八頁，共五十五頁，2022年，8月28日b.在支持介質(zhì)(濾布)的表面上預(yù)涂硅藻土薄層(預(yù)涂層)，

以保護支持介質(zhì)的毛細孔道在較長時間內(nèi)不被懸浮液

中的固體粒子所堵塞，從而提高和穩(wěn)定過濾速率。c.將適當?shù)墓柙逋练稚⒃诖^濾的懸浮液中，使形成的濾餅具有多孔隙性，降低濾餅的可壓縮性，以提高過濾速率和延長過濾