第九章基因診斷

第九章基因診斷第一頁，共六十九頁，2022年，8月28日第一節(jié) 基因診斷的概念 及常用技術(shù)第二頁，共六十九頁，2022年，8月28日基因診斷—利用分子生物學(xué)技術(shù)，從 DNA/RNA水平檢測基因的存在,分析基因的結(jié)構(gòu)變異和表達狀態(tài)，從而對疾病作出診斷。一、基本概念第三頁，共六十九頁，2022年，8月28日二、基因診斷常用方法㈠ 核酸分子雜交㈡ PCR㈢ DNA序列測定㈣ DNA芯片技術(shù)第四頁，共六十九頁，2022年，8月28日(一) 核酸雜交基本原理-------核酸變性和復(fù)性理論

即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開，而在條件恢復(fù)后又可依堿基配對規(guī)律形成雙鏈結(jié)構(gòu)。因此應(yīng)用已知堿基序列的單鏈核苷酸片段作為探針，就可檢測樣本中是否存在與其互補的同源核苷酸序列。第五頁，共六十九頁，2022年，8月28日probeprobe第六頁，共六十九頁，2022年，8月28日核酸雜交的關(guān)鍵要素probeDNAtargetDNAsignaldetection第七頁，共六十九頁，2022年，8月28日核酸雜交方法分類按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型。固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應(yīng)核酸游離在溶液中。液相雜交所參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。第八頁，共六十九頁，2022年，8月28日固相雜交分類Southern印記雜交Northern印記雜交斑點雜交原位雜交第九頁，共六十九頁，2022年，8月28日Southernblot是最經(jīng)典的基因分析方法，不但能檢出特異的DNA片段，而且能進行定量和測定分子量，可用于基因的酶切圖譜分析、基因突變分析等。第十頁，共六十九頁，2022年，8月28日Northern雜交用于RNA的檢測，能對組織細胞中總RNA或mRNA進行定性和定量分析。第十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日斑點雜交（Dotblot）可用基因組中特定基因及其表達的定性及定量分析，方法簡單、快速靈敏、樣品用量少；其缺點是不能鑒定所測基因的分子量，特異性不高，有一定比例的假陽性。第十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日原位雜交

（Colonyinsituhybridization）可查明染色體中特定基因的位置，用于染色體疾病的診斷；原位雜交的結(jié)果是顯示有關(guān)核酸序列的空間位置情況，因此可檢出含核酸序列的具體細胞，細胞的具體定位，數(shù)目和類型，可檢出基因和基因產(chǎn)物的亞細胞定位。第十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日（二）利用PCR及結(jié)合其他技術(shù)進行基因診斷直接采用PCR進行基因診斷采用PCR產(chǎn)物的限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLPs）進行基因診斷采用PCR結(jié)合等位基因特異性寡核苷酸探針（ASO）斑點雜交進行基因診斷*通過PCR產(chǎn)物的反相點雜交(RBD)進行基因診斷采用PCR產(chǎn)物的單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析進行基因診斷采用PCR技術(shù)對靶核酸進行定量分析第十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日寡核苷酸雜交分析SNP和等位基因特異寡核苷酸雜交（ASO）#第十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日（三）DNA序列測定

DNA序列測定是進行基因突變檢測的最直接、最準確的方法，可以確定突變的部位，突變的性質(zhì)。第十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日（四）DNA芯片技術(shù)

應(yīng)用DNA芯片，可以檢測基因的結(jié)構(gòu)及其突變多態(tài)性，對基因表達的情況進行分析。第十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日二基因診斷的特點高特異性高靈敏度獲得穩(wěn)定的結(jié)果早期快速適用性強，應(yīng)用范圍廣第十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日第二節(jié)遺傳病的基因診斷第十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日一、概述人類的遺傳病達數(shù)千種地中海貧血在意大利等國家發(fā)病率達10％鐮狀細胞貧血在美國黑人中發(fā)病率達14％我國常見的遺傳性疾病有地中海貧血、異常血紅蛋白病和血友病。有效治療難；通過基因診斷進行攜帶者篩查，產(chǎn)前早期診斷，降低發(fā)病率。第二十頁，共六十九頁，2022年，8月28日二、鐮狀細胞貧血血紅蛋白病（異常血紅蛋白?。┘t細胞呈鐮刀狀，壽命短，引起溶血性貧血。患者多在成年以前死亡第二十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日×MstⅡ酶切位點(CCTNAGG)5′3′正?；?′3′突變基因1.15kb1.35kb（一）鐮狀紅細胞貧血分子機制5 6 7--Pro Glu Glu—--CCT

GAG

GAG--5 6 7--Pro Ala Glu—--CCT

GTG

GAG--第二十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日（二）鐮狀細胞貧血的基因診斷方法限制性內(nèi)切酶/Southernblot 采集制備血液DNA→內(nèi)切酶MstⅡ消化→電泳→轉(zhuǎn)膜→32P標記的β珠蛋白cDNA雜交→放射自顯影第二十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析第二十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日PCR/限制性內(nèi)切酶設(shè)計引物→PCR擴增→產(chǎn)物進行限制性內(nèi)切酶酶切→電泳→EB染色→直接觀察例：引物1：5’-GGGCTGGGCATAAAAGTCA-3’引物2：5’-AATAGACCAATAGGCAGAG-3’ 擴增產(chǎn)物294bp鐮狀細胞貧血的基因診斷方法第二十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日引物1CCT

GAG

GAGCCT

GTG

GAG引物1引物2引物2294bp103bp191bpMstⅡ酶切位點(CCTNAGG)第二十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日+﹣103bp191bp294bp正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細胞貧血患者PCR產(chǎn)物的限制性酶切分析第二十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日RT-PCR/序列分析

采集制備血液RNA→RT-PCR→產(chǎn)物測序→推測氨基酸序列→進行診斷鐮狀細胞貧血的基因診斷方法第二十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日二、β－地中海貧血

(β－Thalassaemia,簡寫βthal或βT)β珠蛋白基因突變導(dǎo)致該多肽鏈的合成大為減少（β＋）或完全缺失（β0）β珠蛋白合成速率降低，導(dǎo)致β鏈和α鏈合成的不平衡→多余的珠蛋白鏈沉積在紅細胞膜上→改變了膜的通透性和硬度→導(dǎo)致溶血性貧血。高危人群地中海人、中東人、印度人、中國人；中國人群中又一廣東、廣西、四川、貴州等省發(fā)病率最高。缺乏有效治療措施。第二十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日（一）β地貧病的分子基礎(chǔ)β珠蛋白基因全長2053bp，含2個內(nèi)含子（IVS－I和IVS-II），3個外顯子。目前發(fā)現(xiàn)突變有百余種，中國人群發(fā)現(xiàn)約20種；一般對特定種族來說，90%的β地貧基因僅由4～6種突變組成。第三十頁，共六十九頁，2022年，8月28日（二）β地中海貧血的基因診斷PCR/ASO斑點雜交法 合成2對PCR引物（擴增區(qū)段700bp和580bp，分別包含14種和1種可能突變）→合成等位特異寡核苷酸(ASO)探針（4～6對，分別標記） →制備DNA樣品 →PCR擴增 →斑點印跡雜交RFLP分析法第三十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日三α地中海貧血的基因診斷ac左側(cè)缺失4.2kb右側(cè)缺失3.7kbbbbaα2α1α1α2N端α1C端正?；蛐蛄蠵CR擴增法——定性分析左側(cè)缺失型基因序列右側(cè)缺失型基因序列ac擴增0.4kbab無擴增片段ab擴增1.2kb第三十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日+﹣0.4kb1.2kb正常人右側(cè)缺失患者地中海貧血患者基因組的PCR分析左側(cè)缺失患者第三十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日四、杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）

1.DMD是常見的性連鎖隱性遺傳病，2.主要特征是進行性肌萎縮和腸肌假性肥大，XP21.21—21.3區(qū)抗肌萎縮蛋白基因突變形式不同。DMD多在5歲發(fā)病，10歲左右癱瘓，在20歲左右由于心力和呼吸衰竭而死亡，其發(fā)病率為活產(chǎn)男嬰的1/3500。

第三十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日（一）DMD分子基礎(chǔ)：抗肌萎縮蛋白基因長約2900kb，含79個外顯子?？辜∥s蛋白基因突變分為基因缺失型和非基因缺失型。（1）DNA片段缺失（60%的病例→導(dǎo)致閱讀框移碼→移碼實變→致DMD，整碼缺失→BMD）。缺失的2個熱點區(qū)①該基因5’端處②45~55外顯子范圍內(nèi)。（2）非基因缺失型部分重復(fù)（病例的5%）第三十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日（1）基因組探針法 用XP21區(qū)分離得到的不同探針如（P20）來進行相應(yīng)內(nèi)切酶酶譜分析、檢出率取決于探針數(shù)和酶切位點數(shù)目。（2）cDNA探針法 抗肌萎縮蛋白基因系列cDNA探針分析患者基因缺失、外顯子拼接改變和基因內(nèi)部分重復(fù)。（3）多重PCR法 如有人設(shè)計多對引物進行多重PCR擴增該基因的9個易發(fā)缺失“熱點區(qū)”DNA片段，可檢出80%有基因缺失的DMD患者。（4）多態(tài)性分析法 基因內(nèi)及其旁側(cè)探針進行RFLP連鎖分析。（5）RT—PCR擴增該基因外顯子（全長2.4MB、外顯子起來全長c14kb、用多對引物）可檢出：外顯子拼接異常。聯(lián)用測序：可定位基因缺失的起始和終止。第三十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日1、苯丙酮尿癥是一種常見的隱性遺傳性氨基酸代謝病。2、主要特征：（1）苯丙氨酸酪氨酸→多巴→兒茶酚胺苯丙酮酸酪胺黑色素

（2）患兒出生后須及早得到低phe飲食治療，否則發(fā)生不可逆大腦損害和嚴重智力發(fā)育障礙。

苯丙氨酸羥化酶↓（肝）五、苯丙酮尿癥（PKU）第三十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日（一）PKU分子基礎(chǔ)（1）迄今約3/4的導(dǎo)致中國人PKU的突變基因已被查清，它們分屬11種PAH基因點突變。體外研究表明，這些突變導(dǎo)致PAH活力↓或喪失。（2）PAH第11外顯子的第399密碼GTA（val）→GTT（val）中性突變：①不改變?nèi)魏蜗拗泼缸R別位點，故又稱“序列多態(tài)性”。②這一“序列多態(tài)性”在PKU患者和正常人中存在著連鎖不平衡性，故可作為一種“遺傳標記”應(yīng)用于產(chǎn)前診斷。第三十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日①PCR/ASO探針法和PCR-RFLP連鎖分析法。②PCR/SSCP③直接測序法—若待診斷的PKU家系的基因突變類型尚屬“未知”或無RFLP信息。（二）PKU的DNA診斷第三十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日先合成ASO如： 正常探針： TCCATTAACAGTAAGAATTT 突變探針： TCCATTAACAATAAGAATTT利用PCR/ASO探針法診斷苯丙酮尿癥第四十頁，共六十九頁，2022年，8月28日利用PCR/ASO探針法診斷苯丙酮尿癥▽◎△▲ ○◎△健康男性 ▽男性攜帶者

▲男性患者○健康女性 ◎女性攜帶者 ●女性患者●▽正常探針突變探針第四十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日第三節(jié)腫瘤的基因診斷第四十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日1 通過檢測腫瘤染色體易位及融合基因診斷腫瘤 慢粒：（染色體易位）費城染色體 PCR檢測融合基因

2 檢測腫瘤相關(guān)基因癌基因（ras）、抑癌基因（p53）、腫瘤轉(zhuǎn)移基因3 檢測腫瘤相關(guān)病毒基因 HBVHCV－肝癌 EB－鼻咽癌4 檢測腫瘤標志物基因或mRNA

肝癌—甲胎蛋白（AFP）結(jié)腸癌—癌胚抗原（CEA）腫瘤基因診斷的策略第四十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日腫瘤標記物基因的檢測著絲粒

染色體22bcrgenec-ablgene

染色體9

bcr-mRNA

bcr-abl

mRNA

染色體9,22

bcr-abl融合蛋白（具PTK活性）

慢性骨髓白血病

引物A引物B第四十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日2 癌基因和抑癌基因的檢測㈠ras癌基因的檢測ras基因中最常見的點突變是第12，13或61密碼子突變檢測方法：PCR/ASOPCR-SSCP第四十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日㈡p53的檢測p53基因突變主要為點突變，熱點區(qū)域位于密碼子130~290，以175、273、284最多見檢測方法：PCR—SSCPPCR—測序PCR—RFLP第四十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日㈢其它基因的檢測PCR結(jié)合其它技術(shù)基因芯片第四十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日4、腫瘤標志物檢測或mRNA診斷腫瘤標志物 是由腫瘤組織細胞產(chǎn)生的、與腫瘤形成和發(fā)展相關(guān)的物質(zhì)，包括腫瘤抗原、激素、酶、同工酶等?；驑酥竞突虮硇蜆酥荆ㄅ咛バ钥乖z測方法：PCR—ASOPCR—測序PCR—RFLPPCR－SSCP第四十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日第四節(jié)感染性疾病的

基因診斷第四十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日一、感染性疾病基因

診斷的策略針對病原體特異的核酸序列設(shè)計探針進行雜交應(yīng)用PCR技術(shù)擴增病原體基因保守序列核酸雜交技術(shù)與PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用第五十頁，共六十九頁，2022年，8月28日特點簡便、特異、快捷能檢測出潛在的病原體可對病原體進行分類、分型鑒定不能得知病原體進入體內(nèi)后機體的反應(yīng)第五十一頁，共六十九頁，2022年，8月28日二、基因診斷的感染性疾?。ㄒ唬?、病毒特點：分離培養(yǎng)—周期長，操作繁雜，制約因素多電鏡觀察—直觀快速，但昂貴免疫學(xué)診斷—簡便快速，但存在問題：不易檢出潛伏期的病毒有些病毒亞型多，抗原變異性大整合進入人基因組的病毒第五十二頁，共六十九頁，2022年，8月28日病毒核酸分析技術(shù)HBV—包含4個開放閱讀框，S、C、P、X PCR PCR/限制性內(nèi)切酶譜分析 PCR/點雜交, PCR/Southernblot 基因芯片目的基因引物序列擴增片段C5’ACTGTTCAAGCCTCCAAGCT3’425bp5’AGTGCGAATCCACACTC3’第五十三頁，共六十九頁，2022年，8月28日

調(diào)節(jié)和啟動轉(zhuǎn)錄LTRgagpolenv

tat，revLTR

長末端重復(fù)序列調(diào)節(jié)蛋白基因正常的病毒基因產(chǎn)生病毒核心蛋白產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶

產(chǎn)生病毒外膜蛋白附加基因*HIV病毒基因組結(jié)構(gòu)第五十四頁，共六十九頁，2022年，8月28日目的基因引物序列擴增片段env5’ACAATTATTGTCTGGTATAG3’135bp5’AGGTATCTTTCCACAGCCAG3’HIV-1ProbeTGAGTTGCAACAGATGCTGTTGCGCCTCAATAGCCCTCAGPCR/核酸雜交診斷艾滋病第五十五頁，共六十九頁，2022年，8月28日SARS——RT－PCR多重PCR熒光定量PCR第五十六頁，共六十九頁，2022年，8月28日（二）、細菌細菌性痢疾——志賀菌，侵襲性大腸桿菌，大質(zhì)粒；PCR結(jié)核病——PCR

第五十七頁，共六十九頁，2022年，8月28日（三）、寄生蟲重復(fù)序列探針法、寡核苷酸探針法、基因組探針法、PCR第五十八頁，共六十九頁，2022年，8月28日第五節(jié)基因診斷策略第五十九頁，共六十九頁，2022年，8月28日（一）檢測致病基因突變基因變異致病的類型：內(nèi)源基因的變異基因結(jié)構(gòu)的突變點突變、插入、缺失、重排、異位基因表達異常mRNA剪接異常外源基因的插入第六十頁，共六十九頁，2022年，8月28日點