第四章外植體的選擇和消毒

第四章外植體的選擇和消毒第一頁，共二十八頁，2022年，8月28日一、外植體的選擇1.選擇什么種類的植物2.選擇植物體的部位、發(fā)育年齡和季節(jié)第二頁，共二十八頁，2022年，8月28日如：莖尖、莖段、塊莖、鱗莖、球莖、表皮、皮層、維管束、髓細胞、樹木的形成層，子葉、上胚軸、下胚軸、葉片、葉柄、葉枕和根，以及生殖器官中的花托、花瓣、花藥、花粉、子房、胚珠、胚、胚乳、胚柄等都可以作為外植物體第三頁，共二十八頁，2022年，8月28日

由于不同植物以及同一株植物在不同發(fā)育階段和時期所取的同一組織和器官在組織培養(yǎng)過程中,其脫分化和再分化的難易程度不同.所以取外植物體時應(yīng)考慮以下三個方面:1.取材的部位;2.取材的季節(jié)

3.器官發(fā)育年齡的選擇;4.取材大小的影響第四頁，共二十八頁，2022年，8月28日(1)莖尖是最普遍采用的部位，其分生能力強、生長速度快，且不帶病毒，是獲得脫毒苗的重要途徑.規(guī)律：一般頂芽生長勢比側(cè)芽旺，比較容易成活.1.常見取材的部位第五頁，共二十八頁，2022年，8月28日(2)葉片規(guī)律：老葉和幼嫩的小葉比成熟葉片難于培養(yǎng).幼嫩的小葉生理功能還不健全，分化能力差；老葉生理功能已經(jīng)衰退，葉柄營養(yǎng)成分減少，難以分化.成熟葉片營養(yǎng)豐富，生理功能旺盛，光和作用能力強，細胞處于活性狀態(tài)，容易脫分化和再分化1.常見取材的部位第六頁，共二十八頁，2022年，8月28日(3)莖如：大花萱草等植物的側(cè)芽在土中，極易污染，而且分化能力很差，用花莖做外植體時效果很好，細胞脫分化和再分化都很快.1.常見取材的部位第七頁，共二十八頁，2022年，8月28日

(4)鱗莖百合、大蒜等植物做外植物體時效果較其它部位好，且鱗莖的不同部位的再生能力有很大的差別，外層比內(nèi)層鱗片葉的再生能力強，同一鱗片下段比中上段再生能力強.1.常見取材的部位第八頁，共二十八頁，2022年，8月28日因此，選擇合適最能表達全能性的部位和組織，是決定組織培養(yǎng)成功的前提之一.1.常見取材的部位第九頁，共二十八頁，2022年，8月28日2.取材季節(jié)的選擇規(guī)律：一般植物在旺盛生長期取材比較好，而在即將進入休眠期和休眠期的外植體的效果較差.如：蘋果在3-6月份取材成活率為60%，7-11月份就下降到10%，12月至次年2月份則在10%以下.馬鈴薯在4月份和12月份取的莖做外植體有較高的塊莖發(fā)生率，而在2-3月份或5-11月份取的則塊莖發(fā)生率大大降低.

百合的鱗片做外植物體時，在春、秋取材容易形成小鱗莖，而在夏、冬取材就難以形成小鱗莖第十頁，共二十八頁，2022年，8月28日在雜交育種過程中遇到雜種胚發(fā)育不良、早衰等現(xiàn)象，要在胚早衰之前取出并進行培養(yǎng)，一般都是在胚接近七八分成熟時而不是完全成熟時進行胚培養(yǎng).雜種胚，特別是遠緣雜交的胚，后期敗育，一切生理活動都停止了，必須在敗育之前進行培養(yǎng).第十一頁，共二十八頁，2022年，8月28日3.取材大小的影響要求：大小適宜，大的不易消毒，小的操作困難且不易成活.如：脫毒培養(yǎng)時要求莖尖大小為；葉片做外植體時，不能小于5mm2第十二頁，共二十八頁，2022年，8月28日3.取材大小的影響

除葉片外，花瓣、莖段等也都不宜取得太小，但也不能過大。過大則難以消毒滅菌，容易引起污染等.第十三頁，共二十八頁，2022年，8月28日二、外植體的消毒（一）外植體消毒滅菌的要求包括兩個方面：把外植體上帶的一切微生物，包括真菌、細菌及其他微生物都殺死不能損傷組織材料，保持外植體的生活力，使外植體在良好的培養(yǎng)條件下很快恢復生機，正常生長和繁殖.第十四頁，共二十八頁，2022年，8月28日（二）常用消毒劑的種類和特性要求：具有良好的消毒作用，既不會殺死植物的組織細胞，又易被無菌水沖洗掉，不影響消毒后外植體的生長和分化.第十五頁，共二十八頁，2022年，8月28日常用消毒劑效果比較

消毒劑濃度(%)去除難易消毒時間（分）效果酒精70-75易0.2-2好次氯酸鈉0.5-5易5-20很好氯化汞0.1-0.3較難2-10最好H2O210-12最易5-15好第十六頁，共二十八頁，2022年，8月28日各種消毒劑的特性70%-75%的酒精特點:具有很強的穿透力和殺菌力,通常外植體浸入15-30秒種即可起到消毒作用.由于酒精對組織細胞的殺傷力比較強,使用時間不能過長,一般達不到徹底消毒的要求，但酒精的浸潤作用可以促進其它消毒劑滲透到外植體的整個表面，提高殺菌效果常做為消毒的第一步.第十七頁，共二十八頁，2022年，8月28日各種消毒劑的特性次氯酸鈉（NaClO）可以分解釋放Cl2,具有較強的殺菌作用,對植物細胞的損傷較小,消毒時間10分鐘左右為宜.NaClO+H2O+CO2NaHCO3+Cl2注意:須防潮解,要求密封儲存,使用時隨配隨用第十八頁，共二十八頁，2022年，8月28日各種消毒劑的特性氯化汞(HgCl2)原理:具有劇毒的重金屬鹽殺菌劑,其Hg2+可與帶負電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合,使微生物菌體蛋白變性而失活.缺點:對植物組織的損傷較大,且不易被無菌水洗去,對人體也有毒害作用.優(yōu)點:消毒效果好,且穩(wěn)定,能長期保存小竅門:在HgCl2溶液中加入一滴1mol/L的鹽酸,滅菌效果更好第十九頁，共二十八頁，2022年，8月28日各種消毒劑的特性

H2O2原理:強氧化劑,可殺死微生物.優(yōu)點:容易被無菌水洗去使用濃度為:10%-12%,消毒時間為5-15分第二十頁，共二十八頁，2022年，8月28日外植體消毒的一般程序

70%酒精外植體放入滅菌的小燒杯(三角瓶等)中15-30秒

加入消毒劑(氯化汞、次氯酸鈉)迅速倒出酒精5-20分鐘（振搖加入無菌水數(shù)次）倒出消毒劑振搖數(shù)次將水倒掉(反復3-4次)

第二十一頁，共二十八頁，2022年，8月28日不同材料的消毒方法1.芽、莖段、葉片、花瓣的消毒植物的這些組織常暴露在空氣中，表面的雜菌較多，而芽的外面已有鱗片、茸毛、角質(zhì)層和蠟質(zhì)層，影響消毒劑的進入，在消毒前先用軟毛刷和棉球蘸清水清洗干凈，再用鑷子或解剖刀除去部分鱗片和茸毛.第二十二頁，共二十八頁，2022年，8月28日不同材料的消毒方法2.果實、種子和胚的消毒（1）果實、種子沒有裂口先用自來水沖洗，再用70%的酒精漂洗，2%的次氯酸鈉消毒8-10分鐘，然后用無菌水沖洗3次；也可將果實在火焰上灼燒一下，可有效的殺死果實表面的雜菌，然后在無菌的條件下取出果實內(nèi)的胚或胚乳.第二十三頁，共二十八頁，2022年，8月28日不同材料的消毒方法（2）開裂的果實成熟的種子因果實會開裂，容易腐爛，種子表面已帶大量細菌.

方法：直接剝?nèi)シN皮，取出種胚，用0.1%的氯化汞溶液消毒2-3分鐘，然后用無菌水沖洗5次.第二十四頁，共二十八頁，2022年，8月28日不同材料的消毒方法

3.花藥和子房的消毒花藥和子房的培養(yǎng)，一般是培養(yǎng)未成熟的花藥、花穗和子房.此時，由于花蕾尚未開裂，有花萼和花瓣緊緊包著，只要把整個花蕾取下，剝?nèi)ザ嘤嗟娜~片后即可進行消毒.第二十五頁，共二十八頁，2022年，8月28日不同材料的消毒方法方法：首先用70%的酒精消毒數(shù)秒，再用5%的次氯酸鈉溶液消毒5-10分鐘，然后用無菌水沖洗2-3次，即可在無菌條件下剝出花藥和子房進行培養(yǎng).第二十六頁，共二十八頁，2022年，8月28日不同材料的消毒方法4.根、塊根、塊莖、鱗莖的消毒這些材料由于生長在地下，帶菌量多，