基于水油體系與MagPack的自動核酸提取-擴增方法和儀器研究

基于水油體系與MagPack的自動核酸提取-擴增方法和儀器研究摘要：本文研究了一種基于水油體系和MagPack的自動核酸提取/擴增方法，并開發(fā)了相應(yīng)的自動化儀器。該方法首先通過油水分離的方式使非載體蛋白質(zhì)樣品純化，并通過磁性二氧化硅顆粒進行純化，最終得到高純度的核酸樣品。然后，通過自動化的PCR擴增模塊進行PCR擴增，能夠快速高效地獲得足夠的目標(biāo)產(chǎn)物。本方法不僅適用于病原體的檢測，還可用于環(huán)境、食品和藥物等檢測領(lǐng)域。

關(guān)鍵詞：核酸提取、擴增、水油體系、MagPack、自動化儀器

1.引言

核酸分析在現(xiàn)代生命科學(xué)中占據(jù)重要地位。核酸提取和擴增是核酸分析的重要步驟，通常需要耗費大量人力和時間。因此，自動化核酸提取和擴增方法的發(fā)展具有重要的應(yīng)用價值。

近年來，磁性二氧化硅顆粒（MagPack）具有很高的吸附性能和生物相容性，廣泛應(yīng)用于核酸提取、分離和富集等生物學(xué)領(lǐng)域[1][2]，可以提高核酸提取的效率和純度。同時，水油相分離技術(shù)能夠有效地純化非載體蛋白質(zhì)樣本[3]?；谒腕w系和MagPack的自動核酸提取/擴增方法雖然已經(jīng)報道[4][5]，但是相關(guān)的自動化儀器的研究相對較少。本研究旨在開發(fā)一種使用MagPack和水油分離技術(shù)的自動化核酸提取/擴增儀器。

2.材料和方法

1)核酸樣品制備

本研究選用金黃色葡萄球菌作為樣本，由3mL菌液經(jīng)離心，稀釋后制備不同濃度的細(xì)胞懸液，用蒸餾水沖洗洗滌膠體，最終得到30μL的核酸樣品。

2)核酸提取與純化

使用油水分離的方法在攪拌條件下使樣品中非載體蛋白質(zhì)與水相分離[5]，加入MagPack顆粒后，在磁力作用下將MagPack顆粒與載體蛋白質(zhì)一同沉淀，空化吸取上清液，在高鹽緩沖液中進行洗滌，最終用蒸餾水洗凈洗滌后的MagPack顆粒，然后將MagPack顆粒與區(qū)分水性的緩沖液混淆，最終得到1mL的高純度核酸樣品。

3)PCR擴增

使用Agilent2100電泳儀檢測提取的核酸樣品質(zhì)量，將30μL的核酸樣品作為PCR反應(yīng)體系的模板，使用自動化PCR擴增模塊進行PCR擴增，擴增條件為：95℃預(yù)變性5min；35個PCR循環(huán)（95℃30s，58℃30s，72℃45s）；72℃最后延期10min。

4)儀器設(shè)計和操作流程

該自動化核酸提取/擴增儀器由MagPackModule、PCRModule、HMI和計算機控制系統(tǒng)組成。采用VHDL語言設(shè)計的FPGA控制MagPackModule進行核酸提取和純化，同時PCRModule為自動化PCR體系提供擴增熱循環(huán)。HMI為人機界面，用于操作系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)輸出。本儀器的操作流程如下：樣品輸入→核酸提取→PCR擴增→結(jié)果輸出。

3.結(jié)果與討論

1)核酸提取結(jié)果

使用磁性二氧化硅顆粒進行核酸提取和純化，結(jié)合水油相分離技術(shù)，得到了高純度的核酸樣品。

2)PCR擴增結(jié)果

使用自動化PCR擴增模塊進行PCR擴增，得到了目標(biāo)產(chǎn)物細(xì)差部位的PCR產(chǎn)物，其大小符合預(yù)期。擴增產(chǎn)物通過Agilent2100電泳儀檢測，結(jié)果如圖1所示。

3)儀器驗證結(jié)果

本儀器能夠自動完成核酸提取、純化和PCR擴增等步驟，該儀器輸出的擴增產(chǎn)物經(jīng)檢測表明，其質(zhì)量符合要求。

4.結(jié)論

本文開發(fā)了一種基于水油體系和MagPack的自動核酸提取/擴增方法，并設(shè)計了相應(yīng)的自動化儀器。該方法能夠提高核酸分析的效率和準(zhǔn)確度，適用于病原體檢測、環(huán)境監(jiān)測和食品藥品等領(lǐng)域。

5.優(yōu)點與局限性

該自動化核酸提取/擴增儀器具有以下優(yōu)點：

-自動化程度高，能夠大幅度提高實驗效率和準(zhǔn)確度；

-采用磁性二氧化硅顆粒進行核酸提取和純化，得到的核酸樣品質(zhì)量較高；

-操作簡便，適用于不同領(lǐng)域需求。

該儀器的局限性主要是：

-價格較高，不適用于個人實驗室使用；

-對樣品的適應(yīng)性需要進一步提高。

6.未來展望

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，自動化核酸提取/擴增技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。未來，可以將自動化核酸提取/擴增技術(shù)應(yīng)用于更多領(lǐng)域的病原體檢測、環(huán)境監(jiān)測、食品藥品等方面，提高樣品處理效率，降低人員感染風(fēng)險，實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的檢測未來，自動化核酸提取/擴增技術(shù)的發(fā)展方向主要集中在以下幾個方面：

1.小型化和便攜化：目前的自動化核酸提取/擴增儀器大多體積較大，適用于大型實驗室。未來的發(fā)展趨勢是將其小型化、便攜化，使其適用于現(xiàn)場快速檢測。

2.智能化：隨著人工智能和機器學(xué)習(xí)技術(shù)的發(fā)展，自動化核酸提取/擴增技術(shù)也將更加智能化。未來的自動化核酸提取/擴增儀器可能會具備自主學(xué)習(xí)和優(yōu)化功能，提高實驗效率和準(zhǔn)確度。

3.多樣性：未來的自動化核酸提取/擴增技術(shù)將會逐步向多樣化方向發(fā)展，針對不同樣品類型開發(fā)相應(yīng)的核酸提取/擴增方案，并提供高效、精準(zhǔn)的核酸提取/擴增解決方案。

4.綜合性：自動化核酸提取/擴增技術(shù)將會逐步發(fā)展成為一種綜合性的分子生物學(xué)工具，包括核酸提取、擴增、檢測等多個步驟。未來的自動化核酸提取/擴增儀器將會整合更多的功能，提供全流程、一體化的解決方案。

總之，自動化核酸提取/擴增技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新將會極大地推動分子生物學(xué)的發(fā)展和應(yīng)用，為人類的健康和福祉做出更大的貢獻(xiàn)5.更高的靈敏度和特異性：未來的自動化核酸提取/擴增技術(shù)還將面臨更高的靈敏度和特異性的要求，以滿足對一些微量、艱難樣本的快速檢測。為此，未來的核酸提取/擴增儀器將在以往平臺的基礎(chǔ)上，引入全新的納米技術(shù)、放大技術(shù)和基因修飾等，以達(dá)到更高的檢測水平。

6.更嚴(yán)格的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：自動化核酸提取/擴增技術(shù)的發(fā)展，也將促進更嚴(yán)格的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的建立，從而保證分子生物學(xué)實驗的有效性和可重復(fù)性。二維碼和技術(shù)流程記錄等新技術(shù)也將廣泛應(yīng)用，以更好地跟蹤和記錄實驗過程和結(jié)果，為實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性提供充分的保障和憑證。

7.聯(lián)網(wǎng)化和云端化：未來的核酸提取/擴增儀器也將更加聯(lián)網(wǎng)化、云端化，使得實驗室之間、甚至國家之間的實驗數(shù)據(jù)共享更加方便和及時。同時，這些數(shù)據(jù)的高效處理和分析的需求也將推動更強的數(shù)據(jù)存儲和計算能力的發(fā)展，以更好地應(yīng)對大批量數(shù)據(jù)的挑戰(zhàn)。

總體而言，未來自動化核酸提取/擴增技術(shù)的發(fā)展方向?qū)⑹切⌒突?、智能化、多樣性、綜合性、靈敏度與特異性、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的提高以及聯(lián)網(wǎng)化、云端化等方面的深入發(fā)展，這些發(fā)展將有助于提升分子生物學(xué)實驗的效率和準(zhǔn)確度，推動生物醫(yī)學(xué)研