菌種管理和保藏

菌種保藏的重要性菌種保藏是微生物檢驗工作中的一項常規(guī)技術(shù)科學(xué)保藏和管理關(guān)系到檢驗結(jié)果的正確性.第一頁，共34頁。

菌種的—2015版指導(dǎo)原則

原則：

應(yīng)來自認可的國內(nèi)或國外菌種保藏機構(gòu)的標準菌株，或使用與標準菌株所有相關(guān)特性等效的商業(yè)派生菌株。

第二頁，共34頁。

使用菌種來源

菌種編號

2015版CMCC——中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心CMCC（F）真菌

CMCC（B）細菌

協(xié)調(diào)案ATCC美國標準菌種收藏中心

NCIMB英國食品工業(yè)與海洋菌種保藏中心

NBRC日本技術(shù)評價研究所生物資源中心CIP法國巴斯德研究所菌種保藏中心第三頁，共34頁。菌種保藏的中心任務(wù)

-廣泛收集。

-選擇最適宜的保藏方法，保持菌種的生物學(xué)特性。第四頁，共34頁。常用菌種的保藏

菌種保藏的原則根據(jù)微生物菌種的生理、生化特性，盡量降低微生物細胞的代謝強度，處于休眠狀態(tài)，以減低菌種的變異率。第五頁，共34頁。常用菌種的保藏—2015指導(dǎo)原則試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代）。采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保存，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。冷凍保藏：在低溫下保藏，一般在低于-30℃或-70℃，是有效的長期儲藏方法。凍干法保藏：是一種長期保藏菌種的方法法。冷藏：在2～8℃保藏，是短期儲藏方法。第六頁，共34頁。

菌種的保藏

低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)等環(huán)境條件都可以抑制微生物的代謝和生長繁殖，因此低溫、干燥和真空是菌種保藏的重要手段。

第七頁，共34頁。

菌種的保藏工作菌株不可代替標準菌株，標準菌株的商業(yè)衍生物僅可用作

工作菌株。

標準儲備菌株可用于制備每月或每周一次轉(zhuǎn)種的工作菌株。冷凍菌株一旦解凍轉(zhuǎn)種制備工作菌株后,不得重新冷凍或再次使用。第八頁，共34頁。菌種的保藏

不同的微生物，應(yīng)根據(jù)其生物特征來選擇最適宜的保藏方法：⑴

挑選特征典型的純菌菌落⑵確定保藏的合適菌體形態(tài)⑶選擇最適宜的方法保藏⑷定期檢查第九頁，共34頁。

菌種的保藏方法主要原理適用的微生物保藏時間特點液氮超低溫保藏法超低溫廣泛數(shù)十年復(fù)雜、需要專門設(shè)備，有效冷凍真空干燥保藏法干燥、缺氧、低溫廣泛5～10年以上復(fù)雜、需要專門設(shè)備和方法，有效干燥（沙土、牛奶）保藏法干燥、無營養(yǎng)產(chǎn)孢微生物1～10年較簡便，需制備沙土管，有效液體石蠟保藏法低溫、缺氧廣泛1年以上簡便瓊脂斜面低溫保藏法低溫4℃廣泛短時間簡便液體冷凍保藏法液體培養(yǎng)基低溫廣泛半年以上簡便一定比例甘油低溫、缺氧廣泛數(shù)十年以上簡便瓷珠冷凍保藏法低溫廣泛1年以上簡便第十頁，共34頁。

瓊脂斜面低溫保藏法

菌種培養(yǎng)基保存溫度傳接時間金黃色葡萄球菌

營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基

4℃

約1個月

大腸埃希菌乙型副傷寒沙門菌枯草芽孢桿菌銅綠假單孢桿菌

室溫生孢梭菌皰肉培養(yǎng)基

4℃

約3個月白色念珠菌改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基黑曲霉第十一頁，共34頁。

液體冷凍保藏法制備方法1%蛋白胨、甘油

,滅菌,接種、培養(yǎng)18-24小時.

保存條件

-80℃可保存數(shù)年.

第十二頁，共34頁。

菌種的傳代和使用

工作菌種傳代次數(shù)不得超過5代。

1代是指將活的培養(yǎng)物接種到新鮮培養(yǎng)基中，任何亞培養(yǎng)的形式均被認為是轉(zhuǎn)種或傳代一次。

第十三頁，共34頁。

基本操作技術(shù)

細菌的接種、分離和培養(yǎng)接種：將微生物的培養(yǎng)物接種到培養(yǎng)基上的一種操作技術(shù)。接種：斜面培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基第十四頁，共34頁。

分離技術(shù)

將細菌分離成單個細胞，使其獨立分裂繁殖形成單個菌落的操作技術(shù)。方法

平板劃線-分段劃線、連續(xù)劃線

涂布分離法

傾注分離法等第十五頁，共34頁。培養(yǎng)

接種后的培養(yǎng)基，根據(jù)不同微生物生長條件的要求，培養(yǎng)基放在適宜微生物生長的環(huán)境中溫度、濕度、氧氣等），使其生長繁殖的過程。

需氣菌培養(yǎng)法:

厭氧培養(yǎng)法

嗜溫性微生物：15℃～45℃。嗜熱性微生物：45℃以上。嗜冷性微生物：15℃以下。第十六頁，共34頁。

培養(yǎng)后微生物的生長判斷

固體培養(yǎng)基

有菌落生長或沿穿刺線擴散生長。

液體培養(yǎng)基

渾濁、菌膜、沉淀等。

第十七頁，共34頁。

菌種的傳代和使用

凍干菌種（0代）↓增菌培養(yǎng)蘇醒（1代）↓增菌培養(yǎng)復(fù)壯（2代）→分裝冷凍保存↓斜面培養(yǎng)基劃線傳代（3代）→使用→分裝冷凍保存

↓

斜面培養(yǎng)基

劃線傳代（4代）→使用→分裝冷凍保存↓斜面培養(yǎng)基劃線傳代（5代）→使用→分裝冷凍保存。第十八頁，共34頁。

斜面培養(yǎng)物1～3環(huán)↓適宜液體培養(yǎng)基5～10ml，培養(yǎng)18～24h取適當量，用滅菌生理鹽水稀釋后比濁（或預(yù)實驗）↓按比濁結(jié)果或預(yù)實驗將菌液稀釋到相應(yīng)倍數(shù)↓平板計數(shù)(取上述稀釋液1ml加入平皿中加入

規(guī)定培養(yǎng)基、培養(yǎng)、點計菌落數(shù)↓實驗、陽性對照

平板計數(shù)也可和試驗同時進行

菌液的制備和使用第十九頁，共34頁。

修訂前修訂后營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基。胰酪大豆胨瓊脂或胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基；沙氏葡萄糖瓊脂或沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基；馬鈴薯葡萄糖瓊脂。

菌液制備用培養(yǎng)基—2015修訂內(nèi)容第二十頁，共34頁。

菌株培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度(℃)培養(yǎng)時間(h)枯草芽孢桿菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌胰酪大豆胨瓊脂或胰酪大豆胨肉湯。沙氏葡萄糖瓊脂或沙氏沙氏葡萄糖瓊脂或馬鈴薯葡萄糖瓊脂葡萄糖肉湯30～3520～2520～2518～242～3天5～7天，或直到獲得豐富的孢子

菌液制備用培養(yǎng)基—2015修訂內(nèi)容第二十一頁，共34頁。

修訂前修訂后0.9％氯化鈉溶液pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

0.9%無菌氯化鈉溶液。

菌液制備用稀釋液—2015修定內(nèi)容

第二十二頁，共34頁。

菌液貯存—2015修定內(nèi)容

修訂前

修訂后菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用；若保存在2-8℃，可在24小時內(nèi)使用。穩(wěn)定的黑曲孢子懸液可保存在2-8℃，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。第二十三頁，共34頁。

菌種的鑒定與復(fù)壯

菌種的衰退由自發(fā)突變的作用而引起某些優(yōu)良特性變?nèi)趸蛳У默F(xiàn)象?？刂凭N的衰退方法

-控制傳代次數(shù)降低突變幾率，采用良好的傳代保藏方法。-創(chuàng)造適宜的培養(yǎng)條件：

-用不同類型的細胞進行傳代

-采用有效的保藏方法定期檢查

第二十四頁，共34頁。

菌種的復(fù)壯采用分離純化的方法。形態(tài)特征、生理生化特征、代謝產(chǎn)物、血清學(xué)等一

系列試驗鑒定，證明復(fù)壯后的菌種與原種完全一致。

菌種的鑒定與復(fù)壯第二十五頁，共34頁。

微生物鑒定系統(tǒng)是基于不同的分析方法，其局限性與方法和數(shù)據(jù)庫的局限性有關(guān)。

微生物鑒定需通過已建立的標準微生物如模式菌株的特征(基因型和/或表型)相匹配來完成。否則將得不到鑒定的結(jié)果.

明確鑒定系統(tǒng)局限性和需要的鑒定水平(屬、種、型)。

菌種的鑒定第二十六頁，共34頁。鑒定方法傳統(tǒng)方法增菌→分離(純菌)→確認試驗(菌落形態(tài)、革蘭染色、顯微鏡下菌體形態(tài)、生化特性及血清學(xué)檢查)。依據(jù)伯杰士細菌鑒定手冊重要的生化試驗氧化酶試驗革蘭氏陰性菌、非發(fā)酵的棒狀細菌+腸道菌-過氧化氫酶試驗葡萄球菌+鏈球菌-凝固酶試驗+

葡萄球菌可能為致病菌以上信息對大部分類型的生產(chǎn)環(huán)境中的微生物的調(diào)查及日常分析，已可提供足夠的信息。2015版-指導(dǎo)原則

菌種的鑒定第二十七頁，共34頁。

純菌的分離

微生物的表型表型微生物鑒定通過長時間培養(yǎng)對微生物細胞的恢復(fù)、增殖是有限的，如有些環(huán)境中的微生物在普通微生物增殖培養(yǎng)基不能恢復(fù)。此外，分離出的受損的培養(yǎng)物可能不能完整表達其表型屬性。基因型微生物鑒定

菌種的鑒定第二十八頁，共34頁。微生物分類中使用的表型特征分類特征培養(yǎng)物菌落形態(tài)學(xué)、菌落顏色、形狀、大小和產(chǎn)色素形態(tài)學(xué)細胞形態(tài)學(xué)、細胞大小、細胞形狀、鞭毛類型、內(nèi)容

物、革蘭氏染色、芽孢和抗酸染色、孢子形成模式生理學(xué)氧氣耐受性、pH范圍、最適溫度和范圍、耐鹽性生化反應(yīng)碳源的利用、碳水化合物的氧化或發(fā)酵、酶的模式抑制性膽鹽耐受性、抗生素敏感性、染料耐受