微生物的營養(yǎng)

第四章微生物的營養(yǎng)微生物的營養(yǎng)(nutrition)是微生物生理學的重要研究領(lǐng)域，闡明營養(yǎng)物質(zhì)在微生物生命活動過程中的生理功能以及微生物細胞從外界環(huán)境攝取營養(yǎng)物質(zhì)的具體機制是微生物營養(yǎng)的主要研究內(nèi)容。為了生存，微生物必須從環(huán)境吸收營養(yǎng)物質(zhì)，通過新陳代謝將這些營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成自身新的細胞物質(zhì)或代謝物，并從中獲取生命活動必需的能量，同時將代謝活動產(chǎn)生的廢物排除體外。那些能夠滿足微生物機體生長、繁殖和完成各種生理活動所需的物質(zhì)稱為營養(yǎng)物質(zhì)(nutrient),而微生物獲得和利用營養(yǎng)物質(zhì)的過程稱為營養(yǎng)。營養(yǎng)物質(zhì)是微生物生存的物質(zhì)基礎，而營養(yǎng)是微生物維持和延續(xù)其生命形式的一種生理過程。第一節(jié)微生物的營養(yǎng)要求一、微生物細胞的化學組成.化學元素(chemicalelement)構(gòu)成微生物細胞的物質(zhì)基礎是各種化學元素。根據(jù)微生物生長時對各類化學元素需要量的大小，可將它們分為主要元素(macroelement)和微量元素(traceelement),主要元素包括碳、氫、氧、氮、磷、硫、鉀、鎂、鈣、鐵等，碳、氫、氧、氮、磷、硫這六種主要元素可占細菌細胞干重的97%(表4-1)。微量元素包括鋅、鎰、鈉、氯、鉬、硒、鉆、銅、鎢、鎳、硼等。表4-1微生物細胞中幾種主要元素的含量(干重%)元素細菌酵母菌真菌碳?50?50?48氮?15?12?5氫?8?7?7氧?20?31?40磷?3硫?1組成微生物細胞的各類化學元素的比例常因微生物種類的不同而不同，例如細菌、酵母菌和真菌的碳、氫、氧、氮、磷、硫六種元素的含量就有差別(表4-1),而硫細菌(sulfurbacteria)、鐵細菌(ironbacteria)和海洋細菌(marinebacteria)相對于其他細菌則含有較多的硫、鐵和鈉、氯等元素，硅藻(Diatom)需要硅酸來構(gòu)建富含(SiO2)n的細胞壁。不僅如此，微生物細胞的化學元素組成也常隨菌齡及培養(yǎng)條件的不同而在一定范圍內(nèi)發(fā)生變化，幼齡的或在氮源(sourceofnitrogen)豐富的培養(yǎng)基(medium)上生長的細胞與老齡的或在氮源相對貧乏的培養(yǎng)基上生長的細胞相比，前者含氮量高，后者含氮量低。.化學成分及其分析各種化學元素主要以有機物、無機物和水的形式存在于細胞中。有機物主要包括蛋白質(zhì)、糖、脂、核酸、維生素以及它們的降解產(chǎn)物和一些代謝產(chǎn)物等物質(zhì)。細胞有機物成分的分析通常采取兩種方式：一是用化學方法直接抽提細胞內(nèi)的各種有機成分，然后加以定性和定量分析；另一種是先將細胞破碎，然后獲得不同的亞顯微結(jié)構(gòu)，再分析這些結(jié)構(gòu)的化學成分。無機物是指與有機物相結(jié)合或單獨存在于細胞中的無機鹽（inorganicsalt）等物質(zhì)。分析細胞無機成分時一般將干細胞在高溫爐（550℃）中焚燒成灰，所得到的灰份物質(zhì)是各種無機元素的氧化物，稱為灰份（ashconstituent）。采用無機化學常規(guī)分析法可定性定量分析出灰份中各種無機元素的含量。水是細胞維持正常生命活動所必不可少的，一般可占細胞重量的70?90%。細胞濕重（wetweight）與干重（dryweight）之差為細胞含水量，常以百分率表示：濕重-干重/濕重X100%。將細胞外表面所吸附的水份除去后稱量所得重量即為濕重，一般以單位培養(yǎng)液中所含細胞重量表示（克/升或毫克/毫升），但在具體測量過程中，常由于細胞表面吸附水份除去程度的不同而導致測量結(jié)果有誤差，聚集在一起的單細胞微生物表面吸附的水份難以除去，這些吸附的水份可占濕重的10%。采用高溫（105℃）烘干、低溫真空干燥和紅外線快速烘干等方法將細胞干燥至恒重即為干重。值得注意的是,采用高溫烘干法會導致細胞物質(zhì)分解，而利用后兩種方法所得結(jié)果較為可靠。二、營養(yǎng)物質(zhì)及其生理功能微生物需要從外界獲得營養(yǎng)物質(zhì)，而這些營養(yǎng)物質(zhì)主要以有機和無機化合物的形式為微生物所利用，也有小部分以分子態(tài)的氣體形式提供。根據(jù)營養(yǎng)物質(zhì)在機體中生理功能的不同，可將它們分為碳源、氮源、無機鹽、生長因子和水五大類。.碳源碳源是在微生物生長過程中為微生物提供碳素來源的物質(zhì)。碳源物質(zhì)在細胞內(nèi)經(jīng)過一系列復雜的化學變化后成為微生物自身的細胞物質(zhì)（如碳水化合物、脂、蛋白質(zhì)等）和代謝產(chǎn)物，碳可占一般細菌細胞干重的一半。同時，絕大部分碳源物質(zhì)在細胞內(nèi)生化反應過程中還能為機體提供維持生命活動所需的能源，因此碳源物質(zhì)通常也是能源物質(zhì)。但是有些以CO2作為唯一或主要碳源的微生物生長所需的能源則并非來自碳源物質(zhì)。微生物利用碳源物質(zhì)具有選擇性，糖類是一般微生物較容易利用的良好碳源和能源物質(zhì)，但微生物對不同糖類物質(zhì)的利用也有差別，例如在以葡萄糖和半乳糖為碳源的培養(yǎng)基中,大腸桿菌（Escherichiacoli）首先利用葡萄糖，然后利用半乳糖，前者稱為大腸桿菌的速效碳源，后者稱為遲效碳源。目前在微生物工業(yè)發(fā)酵中所利用的碳源物質(zhì)主要是單糖、飴糖、糖蜜（制糖工業(yè)副產(chǎn)品）、淀粉（玉米粉、山芋粉、野生植物淀粉）、麩皮、米糠等。為了節(jié)約糧食，人們已

經(jīng)開展了代糧發(fā)酵的科學研究，以自然界中廣泛存在的纖維素作為碳源和能源物質(zhì)來培養(yǎng)微生物。不同種類微生物利用碳源物質(zhì)的能力也有差別。有的微生物能廣泛利用各種類型的碳源物質(zhì)，而有些微生物可利用的碳源物質(zhì)則比較少，例如假單胞菌屬(Pseudomonas)中的某些種可以利用多達90種以上的碳源物質(zhì)，而一些甲基營養(yǎng)型(methylotrophs)微生物只能利用甲醇或甲烷等一碳化合物作為碳源物質(zhì)。微生物利用的碳源物質(zhì)主要有糖、有機酸、醇、脂類、烴、CO2及碳酸鹽等(表4-2)。表4-2微生物利用的碳源物質(zhì)種類碳源物質(zhì)備注糖葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、半乳糖、乳糖、甘露糖、纖維二糖、纖維素、半纖維素、甲殼素、木質(zhì)素等單糖優(yōu)于雙糖，己糖優(yōu)于戊糖，淀粉優(yōu)于纖維素，純多糖優(yōu)于雜多糖有機酸糖酸、乳酸、檸檬酸、延胡索酸、低級脂肪酸、高級脂肪酸、氨基酸等與糖類比效果較差，有機酸較難進入細胞，進入細胞后會導致pH下降。當環(huán)境中缺乏碳源物質(zhì)時，氨基酸可被微生物作為碳源利用醇乙醇在低濃度條件下被某些酵母菌和醋酸菌利用脂脂肪、磷脂主要利用脂肪，在特定條件下將磷脂分解為甘油和脂肪酸而加以利用烴天然氣、石油、石油餾份、石蠟油等利用烴的微生物細胞表面有一種由糖脂組成的特殊吸收系統(tǒng)，可將難溶的烴充分乳化后吸收利用CO2，CO2為自養(yǎng)微生物所利用碳酸鹽NaHCO3、CaCO3、白堊等其它芳香族化合物、氰化物蛋白質(zhì)、肽、核酸等為自養(yǎng)微生物所利用。利用這些物質(zhì)的微生物在環(huán)境保護方面有重要作用當環(huán)境中缺乏碳源物質(zhì)時,可被微生物作為碳源而降解利用

.氮源氮源物質(zhì)為微生物提供氮素來源，這類物質(zhì)主要用來合成細胞中的含氮物質(zhì)，一般不作為能源，只有少數(shù)自養(yǎng)微生物能利用銨鹽、硝酸鹽同時作為氮源與能源。在碳源物質(zhì)缺乏的情況下，某些厭氧微生物在厭氧條件下可以利用某些氨基酸作為能源物質(zhì)。能夠被微生物利用的氮源物質(zhì)包括蛋白質(zhì)及其不同程度的降解產(chǎn)物(胨、肽、氨基酸等)、銨鹽、硝酸鹽、分子氮、嘌吟、嘧啶、脲、胺、酰胺、氰化物等(表4-3)。表4-3微生物利用的氮源物質(zhì)種類氮源物質(zhì)備注蛋白出蛋白質(zhì)及其不同程度降解產(chǎn)物(胨、肽、氨基酸等)大分子蛋白質(zhì)難進入細胞，一些真菌和少數(shù)細菌能分泌胞外蛋白酶，將大分子蛋白質(zhì)降解利用，而多數(shù)細菌只能利用分子量較小其降解產(chǎn)物氨及銨鹽NH3、（NH3）2sO4等容易被微生物吸收利用硝酸鹽KNO3等容易被微生物吸收利用分子氮N2固氮微生物可利用，但當環(huán)境中有化合態(tài)氮源時，固氮微生物就失去固氮能力其它嘌吟、嘧啶、大腸桿菌不能以嘧啶作為唯一氮源，在氮在氮限量的葡萄糖培養(yǎng)基上生長時，可通過誘導作用先合成分解嘧啶的酶，然后再分解并利用嘧啶脲、胺、酰胺、氰化物可不同程度地被微生物作為氮源加以利用常用的蛋白質(zhì)類氮源包括蛋白胨(peptone)、魚粉、蠶蛹粉、黃豆餅粉、花生餅粉、玉米漿、牛肉浸膏(beefextract)、酵母浸膏(yeastextract)等。微生物對這類氮源的利用具有選擇性。例如，土霉素產(chǎn)生菌利用玉米漿比利用黃豆餅粉和花生餅粉的速度快，這是因為玉米漿中的氮源物質(zhì)主要以較易吸收的蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物形式存在，而降解產(chǎn)物特別是氨基酸可以通過轉(zhuǎn)氨作用直接被機體利用，而黃豆餅粉和花生餅粉中的氮主要以大分子蛋白質(zhì)形式存在，需進一步降解成小分子的肽和氨基酸后才能被微生物吸收利用，因而對其利用的速度較慢。因此玉米漿為速效氮源，黃豆餅粉和花生餅粉作為遲效氮源，前者有利于菌體生長，后者有利于代謝產(chǎn)物的形成，在發(fā)酵生產(chǎn)土霉素的過程中，往往將兩者按一定比例制成混合氮源，以控制菌體生長時期與代謝產(chǎn)物形成時期的長短，達到提高土霉素產(chǎn)量的目的。微生物吸收利用銨鹽和硝酸鹽的能力較強,nh4+被細胞吸收后可直接被利用，因而（nh4）2sO4等銨鹽一般被稱為速效氮源，而NO「被吸收后需進一步還原成NH4+后再被微生物利用。許多腐生型細菌、腸道菌、動植物致病菌等可利用銨鹽或硝酸鹽作為氮源例如大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacteraerogenes）、枯草芽抱桿菌（Bacillussubtilis）、銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa等均可利用硫酸銨和硝酸銨作為氮源,放線菌可以利用硝酸鉀作為氮源,霉菌可以利用硝酸鈉作為氮源。以（NH4）2SO4等銨鹽為氮源培養(yǎng)微生物時，由于NH4+被吸收，會導致培養(yǎng)基pH下降,因而將其稱為生理酸性鹽；以硝酸鹽（如KNO3）為氮源培養(yǎng)微生物時，由于NO「被吸收,會導致培養(yǎng)基pH升高,因而將其稱為生理堿性鹽。為避免培養(yǎng)基pH變化對微生物生長造成不利影響,需要在培養(yǎng)基中加入緩沖物質(zhì)。.無機鹽無機鹽是微生物生長必不可少的一類營養(yǎng)物質(zhì),它們在機體中的生理功能主要是作為酶活性中心的組成部分、維持生物大分子和細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)并維持細胞的滲透壓平衡、控制細胞的氧化還原電位和作為某些微生物生長的能源物質(zhì)等（表4-4）。微生物生長所需的無機鹽一般有磷酸鹽、硫酸鹽、氯化物以及含有鈉、鉀、鈣、鎂、鐵等金屬元素的化合物。表4-4無機鹽及其生理功能元素化合物形式（常用）生理功能磷KH2PO“K2HpO4核酸、核蛋白、磷脂、輔酶及ATP等高能分子的成份，作為緩沖系統(tǒng)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH硫(NH)2sO“MgSO4含硫氨基酸（半胱氨酸、甲硫氨酸等）、維生素的成份，谷胱甘肽可調(diào)節(jié)胞內(nèi)氧化還原電位鎂MgSO4己糖磷酸化酶、異檸檬酸脫氫酶、核酸聚合酶等活性中心組份，葉綠素和細菌葉綠素成份鈣CaCl2，Ca(NO3)2某些酶的輔因子，維持酶（如蛋白酶）的穩(wěn)定性，芽抱和某些抱子形成所需，建立細菌感受態(tài)所需

鈉NaCl細胞運輸系統(tǒng)組份，問吃細胞滲透壓，維持某些酶的穩(wěn)定性鉀KH2PO“K2HpO4某些酶的輔因子，維持細胞滲透壓，某些嗜鹽細菌核糖體的穩(wěn)定因子鐵FeSO4細胞色素及某些酶的組份，某些鐵細菌的能源物質(zhì)，合成葉綠素、白喉毒素所需在微生物的生長過程中還需要一些微量元素，微量元素是指那些在微生物生長過程中起重要作用，而機體對這些元素的需要量極其微小的元素，通常需要量在10-6?10-8mol/L（培養(yǎng)基中含量）。微量元素一般參與酶的組成或使酶活化（表4-5）。如果微生物在生長過程中缺乏微量元素，會導致細胞生理活性降低甚至停止生長。由于不同微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的需求不盡相同，微量元素這個概念也是相對的。微量元素通?；祀s在天然有機營養(yǎng)物、無機化學式劑、自來水、蒸餾水、普通玻璃器皿中，如果沒有特殊原因，在配制培養(yǎng)基時沒有必要另外加入微量元素。值得注意的是,許多微量元素是重金屬,如果它們過量,就會對機體產(chǎn)生毒害作用,而且單獨一種微量元素過量產(chǎn)生的毒害作用更大,因此有必要將培養(yǎng)基中微量元素的量控制在正常范圍內(nèi),并注意各種微量元素之間保持恰當比例。表4-5微量元素與生理功能元素生理功能鋅存在于乙醇脫氫酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、醛縮酶、RNA與DNA聚合酶中鉬存在于硝酸鹽還原酶、固氮酶、甲酸脫氫酶中銅存在于細胞色素氧化酶中硒存在于甘氨酸還原酶、甲酸脫氫酶中鉆存在于谷氨酸變位酶中鎢存在于甲酸脫氫酶中鎰存在于過氧化物歧化酶、磷酸烯醇式脫竣酶、檸檬酸合成酶中鎳存在于脲酶中，為氫細菌生長所必需.生長因子生長因子通常指那些微生物生長所必需且需要量很小,而且微生物自身不能合成或合成量不足以滿足機體生長需要的有機化合物。不同微生物需求的生長因子的種類和數(shù)量是不同的(表4-6)。自養(yǎng)微生物和某些異養(yǎng)微生物(如大腸桿菌)甚至不需外源生長因子也能生長。不僅如此，同種微生物對生長因子的需求也會隨著環(huán)境條件的變化而改變例如魯氏毛霉(Mucorrouxii)在厭氧條件下生長時需要維生素B1與生物素,而在好氧條件下生長時自身能合成這兩種物質(zhì)，不需外加這兩種生長因子。有時由于對某些微生物生長所需生長因子的本質(zhì)還不了解，在培養(yǎng)它們時通常在培養(yǎng)基中加入酵母浸膏、牛肉浸膏及動植物組織液等天然物質(zhì)以滿足需要。根據(jù)生長因子的化學結(jié)構(gòu)和它們在機體中的生理功能的不同,可將生長因子分為維生素(vitamin)、氨基酸與嘌吟及嘧啶三大類。最早發(fā)現(xiàn)的生長因子在化學本質(zhì)上是維生素目前發(fā)現(xiàn)的許多維生素都能起到生長因子的作用。雖然一些微生物能合成維生素,但許多微生物仍然需要外界提供維生素才能生長。維生素在機體中所起的作用主要是作為酶的輔基或輔酶參與新陳代謝;有些微生物自身缺乏合成某些氨基酸的能力，因此必須在培養(yǎng)基中補充這些氨基酸或含有這些氨基酸的小肽類物質(zhì),微生物才能正常生長。腸膜明串珠菌生長需要十七種氨基酸有些細菌需要D-丙氨酸用于合成細胞壁；嘌吟和嘧啶作為生長因子在微生物機體內(nèi)的作用主要是作為酶的輔酶或輔基，以及用來合成核甘、核甘酸和核酸。表4-6某些微生物生長所需的生長因子微生物生長因子需要量/ml弱氧化醋酸桿菌(Acetobactersuboxydans)對氨基苯甲酸煙堿酸0?10ng3ug丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicun)對氨基苯甲酸0.15ngIII型肺炎球菌(Streptococcuspneumoniae)膽堿6ug腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)吡哆醛0.025ug金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)硫胺素0.5ng

白喉棒桿菌(Cornebacteriumdiphtherriae)B-丙氨酸1.5ug破傷風梭狀芽抱桿菌（Clostridiumtetani）尿嘧啶0?4ug阿拉伯糖乳桿菌（Lactobacillus煙堿酸0.1ugarabinosus)泛酸0.02ug甲硫氨酸10ug糞鏈球菌(Streptococcusfaecali^葉酸ug200精氨酸50ug德氏乳桿菌(Lactobacillus酪氨酸8ugdelbruckii)胸腺核苷0?2ug干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)生物素麻黃素1ng0.02ug.水水是微生物生長所必不可少的。水在細胞中的生理功能主要有：（1）起到溶劑與運輸介質(zhì)的作用，營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝產(chǎn)物的分泌必須以水為介質(zhì)才能完成;（2）參與細胞內(nèi)一系列化學反應；（3）維持蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子穩(wěn)定的天然構(gòu)象;（4）因為水的比熱高，是熱的良好導體,能有效地吸收代謝過程中產(chǎn)生的熱并及時地將熱迅速散發(fā)出體外從而有效地控制細胞內(nèi)溫度的變化；（5）保持充足的水分是細胞維持自身正常形態(tài)的重要因素;（6）微生物通過水合作用與脫水作用控制由多亞基組成的結(jié)構(gòu)，如酶、微管、鞭毛及病毒顆粒的組裝與解離。微生物生長的環(huán)境中水的有效性常以水活度值（wateractivity,aw）表示水活度值是指在一定的溫度和壓力條件下,溶液的蒸汽壓力與同樣條件下純水蒸汽壓力之比,即：aw=Pw/POw,式中Pw代表溶液蒸汽壓力，POw代表純水蒸汽壓力。純水a(chǎn)w為1.00，溶液中溶質(zhì)越多，aw越小。微生物一般在aw為0.60?0.99的條件下生長，對某種微生物而言，aw過低時，微生物生長的遲緩期延長,比生長速率和總生長量減少。微生物不同，其生長的最適aw不同（表4-7）。一般而言,細菌生長最適aw較酵母菌和霉菌高，而嗜鹽微生物生長最適aw則較低。表4-7幾類微生物生長最適aw微生物aw一般細菌0.91酵母菌0.88

霉菌0.80嗜鹽細菌0.76嗜鹽真菌0.65嗜高滲酵母0.60三.微生物的營養(yǎng)類型3玳汽宣。皿1types)由于微生物種類繁多,其營養(yǎng)類型比較復雜,人們常在不同層次和側(cè)重點上對微生物營養(yǎng)類型進行劃分(表4-8)。根據(jù)碳源、能源及電子供體性質(zhì)的不同，可將絕大部分微生物分為光能無機自養(yǎng)型(photolithoautotrophy)、光能有機異養(yǎng)型(photoorganoheterotrophy)、化能無機自養(yǎng)型(chemolithoautotrophy)及化能有機營養(yǎng)型(chemoorganoheterotrophy)四種類型(表4-9)。表4-8微生物營養(yǎng)類型(I)劃分依據(jù)營養(yǎng)類型特點碳源自養(yǎng)型(autotrophs)以co2為唯一或主要碳源異養(yǎng)型(heterotrophs)以有機物為碳源能源光能營養(yǎng)型(phototrophs)以光為能源化能營養(yǎng)型(chemotrophs)以有機物氧化釋放的化學能為能源電子供體無機營養(yǎng)型(lithotrophs)以還原性無機物為電子供體有機營養(yǎng)型(organotrophs)以有機物為電子供體光能無機自養(yǎng)型和光能有機異養(yǎng)型微生物可利用光能生長，在地球早期生態(tài)環(huán)境的演化過程中起重要作用；化能無機自養(yǎng)型微生物廣泛分布于土壤及水環(huán)境中,參與地球物質(zhì)循環(huán)；對化能有機異養(yǎng)型微生物而言，有機物通常既是碳源也是能源。目前已知的大多數(shù)細菌、真菌、原生動物都是化能有機異養(yǎng)型微生物。值得注意的是，已知的所有致病微生物都屬于此種類型。根據(jù)化能有機異養(yǎng)型微生物利用的有機物性質(zhì)的不同,又可將它們分為腐生型(metatrophy))和寄生型(paratrophy)兩類,前者可利用無生命的有機物(如動植物尸體和殘體)作為碳源,后者則寄生在活的寄主機體內(nèi)吸取營養(yǎng)物質(zhì),離開寄主就不能生存。在腐生型和寄生型之間還存在一些中間類型，如兼性腐生型(facultivemetatrophy)和兼性寄生型(facultiveparatrophy)。表4-9微生物的營養(yǎng)類型(11)營養(yǎng)類型電子供體碳源能源舉例光能無機自養(yǎng)型H2、H2S、s或H2OCO2光能著色細菌、藍細菌、藻類光能有機異養(yǎng)型有機物有機物光能紅螺細菌化能無機自養(yǎng)型H2、H2S、Fe2+、NH3或NO2-CO2(無機物氧化)化學能氫細菌、硫桿菌、亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、硝化桿菌屬(Nitrobacter)、甲烷桿菌屬(Methanobacteriun)、醋桿菌屬(Acetobacter)化能有機異養(yǎng)型有機物有機物化學(有機物氧化)能假單胞菌屬、芽抱桿菌屬、乳酸菌屬、真菌、原生動物某些菌株發(fā)生突變(自然突變或人工誘變)后,失去合成某種(或某些)對該菌株生長必不可少的物質(zhì)(通常是生長因子如氨基酸、維生素)的能力,必須從外界環(huán)境獲得該物質(zhì)才能生長繁殖,這種突變型菌株稱為營養(yǎng)缺陷型5/。仃口卜)，相應的野生型菌株稱為原養(yǎng)型伯「用。仃/卜)。營養(yǎng)缺陷型菌株經(jīng)常用來進行微生物遺傳學方面的研究。必須明確，無論那種分類方式,不同營養(yǎng)類型之間的界限并非絕對的,異養(yǎng)型微生物并非絕對不能利用CO2,只是不能以82為唯一或主要碳源進行生長,而且在有機物存在的情況下也可將co2同化為細胞物質(zhì)。同樣，自養(yǎng)型微生物也并非不能利用有機物進行生長。另外，有些微生物在不同生長條件下生長時,其營養(yǎng)類型也會發(fā)生改變,例如紫色非硫細菌(purplenonsulphurbacteria)在沒有有機物時可以同化CO2,它為自養(yǎng)型微生物,而當有機物存在時,它又可以利用有機物進行生長,此時它為異養(yǎng)型微生物。再如，紫色非硫細菌在光照和厭氧條件下可利用光能生長,為光能營養(yǎng)型微生物,而在黑暗與好氧條件下,依靠有機物氧化產(chǎn)生的化學能生長,則為化能營養(yǎng)型微生物。微生物營養(yǎng)類型的可變性無疑有利于提高微生物對環(huán)境條件變化的適應能力。第二節(jié)培養(yǎng)基培養(yǎng)基（medium）是人工配制的，適合微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。無論是以微生物為材料的研咒還是利用微生物生產(chǎn)生物制品,都必須進行培養(yǎng)基的配制，它是微生物學研究和微生物發(fā)酵工業(yè)的基礎。一、配制培養(yǎng)基的原則.選擇適宜的營養(yǎng)物質(zhì)總體而言，所有微生物生長繁殖均需要培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無機鹽、生長因子、水及能源，但由于微生物營養(yǎng)類型復雜,不同微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的需求是不一樣的,因此首先要根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需求配制針對性強的培養(yǎng)基。自養(yǎng)型微生物能從簡單的無機物合成自身需要的糖、脂類、蛋白質(zhì)、核酸、維生素等復雜的有機物因此培養(yǎng)自養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基完全可以（或應該）由簡單的無機物組成。例如,培養(yǎng)化能自養(yǎng)型的氧化硫硫桿菌（ThiobacillusthiooxidanS的培養(yǎng)基組成見表4-10。在該培養(yǎng)基配制過程中并未專門加入其他碳源物質(zhì),而是依靠空氣中和溶于水中的CO2為氧化硫硫桿菌提供碳源。表4-10幾種類型培養(yǎng)基組成*成份氧化硫硫桿菌培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基高氏一號合成培養(yǎng)基查氏合成培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基主要作用牛肉膏5碳源（能源）、氮源、無機鹽、生長因子蛋白胨1010氮源、碳源（能源）、生長因子酵母浸膏5生長因子、氮源、碳源（能源）葡萄糖5碳源（能源）蔗糖30碳源（能源）可溶性淀粉20碳源（能源）CO2（來自空氣）碳源

（NH4）2SO40.4氮源、無機鹽NH4H2PO41氮源、無機鹽KNO31氮源、無機鹽NaNO33氮源、無機鹽MgSO4?7H2O0.50.20.50.5無機鹽FeSO40.010.010.01無機鹽KH2PO44無機鹽K2HPO410.51無機鹽NaCl550.510無機鹽KCl0.5無機鹽CaCl20.25無機鹽S10能源H2O100010001000100010001000溶劑pH7.07.0-7.27.0-7.27.2-7.4自然7.0滅菌條件121℃20分112℃30分121℃20分121℃20分121℃20分121℃20分*表中培養(yǎng)基各組份含量均為每升培養(yǎng)基中該成份的克數(shù)。培養(yǎng)其他化能自養(yǎng)型微生物與上述培養(yǎng)基成分基本類似只是能源物質(zhì)有所改變。對光能自養(yǎng)型微生物而言,除需要各類營養(yǎng)物質(zhì)外,還需光照提供能源。培養(yǎng)異養(yǎng)型微生物需要在培養(yǎng)基中添加有機物,而且不同類型異養(yǎng)型微生物的營養(yǎng)要求差別很大因此其培養(yǎng)基組成也相差很遠。例如,培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基組成比較簡單（表4-10），而有些異養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基的成份非常復雜,如腸膜明串珠菌需要生長因子,若配制培養(yǎng)它的合成培養(yǎng)基時,需要在培養(yǎng)基中添加的生長因子多達33種，因此通常采用天然有機物來為它提供生長所需的生長因子。就微生物主要類型而言,有細菌、放線菌、酵母菌、霉菌、原生動物、藻類及病毒之分培養(yǎng)它們所需的培養(yǎng)基各不相同。在實驗室中常用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（或簡稱普通肉湯培養(yǎng)基）培養(yǎng)細菌（表4-10）;用高氏1號合成培養(yǎng)基培養(yǎng)放線菌（表4-10）;培養(yǎng)酵母菌一般用麥芽汁培養(yǎng)基,它是將麥芽粉與4倍水混勻,在58~65℃條件下保溫3~4小時至完全糖化,調(diào)整糖液濃度為10o巴林，煮沸后用紗布過濾，調(diào)pH為6.0配制而成。麥芽粉組成復雜,能為酵母菌提供足夠的營養(yǎng)物質(zhì);培養(yǎng)霉菌則一般用查氏合成培養(yǎng)基（表4-10）。原生動物也可用培養(yǎng)基培養(yǎng),有的原生動物需要較多的營養(yǎng)物質(zhì),例如梨型四膜蟲（Tetrahymenapyriformi§的培養(yǎng)基含有10種氨基酸、7種維生素、鳥嘌吟、尿嘧啶及一些無機鹽等，而有些變形蟲可在較簡單的蛋白胨肉湯（peptonebroth）中生長。大多數(shù)藻類可以利用光能,只需要CO2、水和一些無機鹽就可生長,而某些藻類如眼蟲藻（Euglena）中的一些種可在黑暗條件下利用有機物質(zhì)生長。有些藻類需要在培養(yǎng)基中補加土壤浸液,培養(yǎng)海洋藻類時可直接利用海水,但如果在特殊情況下需要用合成培養(yǎng)基培養(yǎng)海洋藻類時,則必需在培養(yǎng)基中加入海水中含有的各種鹽。.營養(yǎng)物質(zhì)濃度及配比合適培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)濃度合適時微生物才能生長良好營養(yǎng)物質(zhì)濃度過低時不能滿足微生物正常生長所需，濃度過高時則可能對微生物生長起抑制作用,例如高濃度糖類物質(zhì)、無機鹽、重金屬離子等不僅不能維持和促進微生物的生長反而起到抑制或殺菌作用。另外，培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物質(zhì)之間的濃度配比也直接影響微生物的生長繁殖和（或）代謝產(chǎn)物的形成和積累，其中碳氮比（C/N）的影響較大。嚴格地講，碳氮比指培養(yǎng)基中碳元素與氮元素的摩爾數(shù)比值有時也指培養(yǎng)基中還原糖與粗蛋白之比。例如，在利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的過程中，培養(yǎng)基碳氮比為4/1時,菌體大量繁殖,谷氨酸積累少;當培養(yǎng)基碳氮比為3/1時,菌體繁殖受到抑制,谷氨酸產(chǎn)量則大量增加。再如，在抗生素發(fā)酵生產(chǎn)過程中,可以通過控制培養(yǎng)基中速效氮（或碳）源與遲效氮（或碳）源之間的比例來控制菌體生長與抗生素的合成。.控制pH條件培養(yǎng)基的pH必須控制在一定的范圍內(nèi)，以滿足不同類型微生物的生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。各類微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的最適pH條件各不相同,一般來講,細菌與放線菌適于在pH7~7.5范圍內(nèi)生長,酵母菌和霉菌通常在pH4.5~6范圍內(nèi)生長。值得注意的是,在微生物生長繁殖和代謝過程中，由于營養(yǎng)物質(zhì)被分解利用和代謝產(chǎn)物的形成與積累,會導致培養(yǎng)基pH發(fā)生變化,若不對培養(yǎng)基pH條件進行控制,往往導致微生物生長速度或（和）代謝產(chǎn)物產(chǎn)量降低。因此,為了維持培養(yǎng)基pH的相對恒定,通常在培養(yǎng)基中加入pH緩沖劑,常用的緩沖劑是一氫和二氫磷酸鹽（如K2HPO4和KH2PO4）組成的混合物。K2HPO4溶液呈堿性,KH2P04溶液呈酸性,兩種物質(zhì)的等克分子混合溶液的pH值為6.8。當培養(yǎng)基中酸性物質(zhì)積累導致H+濃度增加時，H+與弱堿性鹽結(jié)合形成弱酸性化合物,培養(yǎng)基pH不會過度降低;如果培養(yǎng)基中OH-濃度增加，OH-則與弱酸性鹽結(jié)合形成弱堿性化合物,培養(yǎng)基pH也不會過度升高。&HPQd+K—KHJKX+K卜KH之久工十K‘十OH——*K2HPO4+H；O但可皿04/陽2PO4緩沖系統(tǒng)只能在一定的pH范圍(pH6.4~7.2)內(nèi)起調(diào)節(jié)作用。有些微生物，如乳酸菌能大量產(chǎn)酸,上述緩沖系統(tǒng)就難以起到緩沖作用,此時可在培養(yǎng)基中添加難溶的碳酸鹽(如CaCO3)來進行調(diào)節(jié),CaCO3難溶于水,不會使培養(yǎng)基pH過度升高,但它可以不斷中和微生物產(chǎn)生的酸,同時釋放出82,將培養(yǎng)基pH控制在一定范圍內(nèi)。在培養(yǎng)基中還存在一些天然的緩沖系統(tǒng)，如氨基酸、肽、蛋白質(zhì)都屬于兩性電解質(zhì)也可起到緩沖劑的作用。.控制氧化還原電位(redoxpotential)不同類型微生物生長對氧化還原電位(①)的要求不一樣,一般好氧性微生物在①值為+0.1伏以上時可正常生長,一般以+0.3?+0.4伏為宜,厭氧性微生物只能在①值低于+0.1伏條件下生長,兼性厭氧微生物在①值為+0.1伏以上時進行好氧呼吸,在+0.1伏以下時進行發(fā)酵。①值與氧分壓和pH有關(guān),也受某些微生物代謝產(chǎn)物的影響。在pH相對穩(wěn)定的條件下,可通過增加通氣量（如振蕩培養(yǎng)、攪拌）提高培養(yǎng)基的氧分壓，或加入氧化劑，從而增加①值;在培養(yǎng)基中加入抗壞血酸、硫化氫、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇等還原性物質(zhì)可降低①值。.原料來源的選擇在配制培養(yǎng)基時應盡量利用廉價且易于獲得的原料作為培養(yǎng)基成份，特別是在發(fā)酵工業(yè)中,培養(yǎng)基用量很大,利用低成本的原料更體現(xiàn)出其經(jīng)濟價值。例如，在微生物單細胞蛋白的工業(yè)生產(chǎn)過程中,常常利用糖蜜（制糖工業(yè)中含有蔗糖的廢液）、乳清（乳制品工業(yè)中含有乳糖的廢液）、豆制品工業(yè)廢液及黑廢液（造紙工業(yè)中含有戊糖和己糖的亞硫酸紙漿）等都可作為培養(yǎng)基的原料。再如，工業(yè)上的甲烷發(fā)酵主要利用廢水、廢渣作原料，而在我國農(nóng)村，已推廣利用人畜糞便及禾草為原料發(fā)酵生產(chǎn)甲烷作為燃料。另外，大量的農(nóng)副產(chǎn)品或制品，如麩皮、米糠、玉米漿、酵母浸膏、酒糟、豆餅、花生餅、蛋白胨等都是常用的發(fā)酵工業(yè)原料。.滅菌處理要獲得微生物純培養(yǎng)，必須避免雜菌污染，因此對所用器材及工作場所進行消毒與滅菌。對培養(yǎng)基而言，更是要進行嚴格的滅菌。對培養(yǎng)基一般采取高壓蒸汽滅菌，一般培養(yǎng)基用1.05kg/cm2,121.3℃15-30分鐘可達到滅菌目的。在高壓蒸汽滅菌過程中，長時間高溫會使某些不耐熱物質(zhì)遭到破壞，如使糖類物質(zhì)形成氨基糖、焦糖，因此含糖培養(yǎng)基常用0.56kg/cm2,112.6℃15-30分鐘進行滅菌，對某些對糖要求較高的培養(yǎng)基，可先將糖進行過濾除菌或間歇滅菌，再與其他已滅菌的成份混合；長時間高溫還會引起磷酸鹽、碳酸鹽與某些陽離子（特別是鈣、鎂、鐵離子）結(jié)合形成難溶性復合物而產(chǎn)生沉淀，因此，在配制用于觀察和定量測定微生物生長狀況的合成培養(yǎng)基時,常需在培養(yǎng)基中加入少量螯合劑,避免培養(yǎng)基中產(chǎn)生沉淀而影響O.D.值的測定，常用的螯合劑為乙二胺四乙酸（EDTA）。還可以將含鈣、鎂、鐵等離子的成份與磷酸鹽、碳酸鹽分別進行滅菌，然后再混合，避免形成沉淀；高壓蒸汽滅菌后，培養(yǎng)基pH會發(fā)生改變（一般使pH降低），可根據(jù)所培養(yǎng)微生物的要求，在培養(yǎng)基滅菌前后加以調(diào)整。在配制培養(yǎng)基過程中,泡沫的存在對滅菌處理極不利,因為泡沫中的空氣形成隔熱層,使泡沫中微生物難以被殺死。因而有時需要在培養(yǎng)基中加入消泡沫劑以減少泡沫的產(chǎn)生，或適當提高滅菌溫度，延長滅菌時間。二、培養(yǎng)基的類型及應用培養(yǎng)基種類繁多,根據(jù)其成份、物理狀態(tài)和用途可將培養(yǎng)基分成多種類型。.按成份不同劃分（1）天然培養(yǎng)基（complexmedium）這類培養(yǎng)基主要以化學成分還不清楚或化學成分不恒定的天然有機物組成牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基就屬于此類。基因克隆技術(shù)中常用的LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基也是一種復合培養(yǎng)基,其組成見表4-10常用的天然有機營養(yǎng)物質(zhì)包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏(表4-11)、豆芽汁、玉米粉、土壤浸液、麩皮、牛奶、血清、稻草浸汁、羽毛浸汁、胡羅卜汁、椰子汁等嗜糞微生物(coprophilousmicroorganisms)可以利用糞水作為營養(yǎng)物質(zhì)。復合培養(yǎng)基成本較低，除在實驗室經(jīng)常使用外,也適于用來進行工業(yè)上大規(guī)模的微生物發(fā)酵生產(chǎn)。表4-11牛肉浸膏、蛋白胨及酵母浸膏的來源及主要成份營養(yǎng)物質(zhì)來源主要成份牛肉浸膏瘦牛肉組織浸出汁濃縮而成的膏狀物質(zhì)富含水溶性碳水化合物、有機氮化合物、維生素、鹽等蛋白胨將肉、酪素或明膠用酸或蛋白酶水解后干燥而成的粉末狀物質(zhì)富含有機氮化合物、也含有一些維生素和碳水化合物酵母浸膏酵母細胞的水溶性提取物濃縮而成的膏狀物質(zhì)富含B類維生素，也含有有機氮化合物和碳水化合物(2)合成培養(yǎng)基(syntheticmedium)合成培養(yǎng)基是由化學成份完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基，也稱化學限定培養(yǎng)基(chemicallydefinedmedium),高氏1號培養(yǎng)基和查氏培養(yǎng)基就屬于此種類型。配制合成培養(yǎng)基時重復性強,但與天然培養(yǎng)基相比其成本較高，微生物在其中生長速度較慢,一般適于在實驗室用來進行有關(guān)微生物營養(yǎng)需求、代謝、分類鑒定、生物量測定、菌種選育及遺傳分析等方面的研究工作。.根據(jù)物理狀態(tài)劃分根據(jù)培養(yǎng)基中凝固劑的有無及含量的多少,可將培養(yǎng)基劃分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基三種類型。(1)固體培養(yǎng)基(solidmedium)在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑即為固體培養(yǎng)基。理想的凝固劑應具備以下條件：1.不被所培養(yǎng)的微生物分解利用;2.在微生物生長的溫度范圍內(nèi)保持固體狀態(tài)。在培養(yǎng)嗜熱細菌時,由于高溫容易引起培養(yǎng)基液化,通常在培養(yǎng)基中適當增加凝固劑來解決這一問題;3.凝固劑凝固點溫度不能太低,否則將不利于微生物的生長;4.凝固劑對所培養(yǎng)的微生物無毒害作用;5.凝固劑在滅菌過程中不會被破壞;6.透明度好,粘著力強;7.配制方便且價格低廉。常用的凝固劑有瓊脂(agar)、明膠(gelatin)和硅膠(silicagel)。表4-12列出瓊脂和明膠的一些主要特征。對絕大多數(shù)微生物而言,瓊脂是最理想的凝固劑,瓊脂是由藻類(海產(chǎn)石花菜)中提取的一種高度分支的復雜多糖；明膠是由膠原蛋白制備得到的產(chǎn)物是最早用來作為凝固劑的物質(zhì),但由于其凝固點太低,而且某些細菌和許多真菌產(chǎn)生的非特異性胞外蛋白酶以及梭菌產(chǎn)生的特異性膠原酶都能液化明膠，目前已較少作為凝固劑；硅膠是由無機的硅酸鈉(Na2SiO3)及硅酸鉀(K2SiO3)被鹽酸及硫酸中和時凝聚而成的膠體,它不含有機物,適合配制分離與培養(yǎng)自養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基。表4-12瓊脂與明膠主要特征比較內(nèi)容瓊脂明膠常用濃度(%)1.5~25~12溶點(℃)9625凝固點(℃)4020pH微酸酸性灰份(%)1614~15氧化鈣(%)1.150氧化鎂(%)0.770氮(%)0.418.3微生物利用能力絕大多數(shù)微生物不能利用許多微生物能利用除在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑制備的固體培養(yǎng)基外,一些由天然固體基質(zhì)制成的培養(yǎng)基也屬于固體培養(yǎng)基。例如，由馬鈴薯塊、胡羅卜條、小米、麩皮及米糠等制成固體狀態(tài)的培養(yǎng)基就屬于此類。如生產(chǎn)酒的酒曲，生產(chǎn)食用菌的棉子殼培養(yǎng)基。在實驗室中，固體培養(yǎng)基一般是加入平皿或試管中，制成培養(yǎng)微生物的平板或斜面。固體培養(yǎng)基為微生物提供一個營養(yǎng)表面,單個微生物細胞在這個營養(yǎng)表面進行生長繁殖可以形成單個菌落。固體培養(yǎng)基常用來進行微生物的分離、鑒定、活菌計數(shù)及菌種保藏等。(2)半固體培養(yǎng)基(semisolidmedium)半固體培養(yǎng)基中凝固劑的含量比固體培養(yǎng)基少,培養(yǎng)基中瓊脂量一般為0.2~0.7%。半固體培養(yǎng)基常用來觀察微生物的運動特征、分類鑒定及噬菌體效價滴定等。(3)液體培養(yǎng)基(liquidmedium)液體培養(yǎng)基中未加任何凝固劑。在用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物時,通過振蕩或攪拌可以增加培養(yǎng)基的通氣量，同時使營養(yǎng)物質(zhì)分布均勻。液體培養(yǎng)基常用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)以及在實驗室進行微生物的基礎理論和應用方面的研究。.按用途劃分(1)基礎培養(yǎng)基(minimummedium)盡管不同微生物的營養(yǎng)需求各不相同，但大多數(shù)微生物所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)是相同的?；A培養(yǎng)基是含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是最常用的基礎培養(yǎng)基?；A培養(yǎng)基也可以作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎成份，再根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)需求,在基礎培養(yǎng)基中加入所需營養(yǎng)物質(zhì)。(2)加富培養(yǎng)基(enrichmentmedium)加富培養(yǎng)基也稱營養(yǎng)培養(yǎng)基,即在基礎培養(yǎng)基中加入某些特殊營養(yǎng)物質(zhì)制成的一類營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基,這些特殊營養(yǎng)物質(zhì)包括血液、血清、酵母浸膏、動植物組織液等。加富培養(yǎng)基一般用來培養(yǎng)營養(yǎng)要求比較苛刻的異養(yǎng)型微生物，如培養(yǎng)百日咳博德氏菌(Bordetellapertussis)需要含有血液的加富培養(yǎng)基。加富培養(yǎng)基還可以用來富集和分離某種微生物,這是因為加富培養(yǎng)基含有某種微生物所需的特殊營養(yǎng)物質(zhì)，該種微生物在這種培養(yǎng)基中較其他微生物生長速度快并逐漸富集而占優(yōu)勢,逐步淘汰其他微生物,從而容易達到分離該種微生物的目的。從某種意義上講,加富培養(yǎng)基類似選擇培養(yǎng)基,兩者區(qū)別在于，加富培養(yǎng)基是用來增加所要分離的微生物的數(shù)量，使其形成生長優(yōu)勢，從而分離到該種微生物；選擇培養(yǎng)基則一般是抑制不需要的微生物的生長，使所需要的微生物增殖，從而達到分離所需微生物的目的。(3)鑒別培養(yǎng)基(differentialmedium)鑒別培養(yǎng)基是用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中加入某種特殊化學物質(zhì),某種微生物在培養(yǎng)基中生長后能產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，而這種代謝產(chǎn)物可以與培養(yǎng)基中的特殊化學物質(zhì)發(fā)生特定的化學反應,產(chǎn)生明顯的特征性變化,根據(jù)這種特征性變化,可將該種微生物與其他微生物區(qū)分開來。鑒別培養(yǎng)基主要用于微生物的快速分類鑒定，以及分離和篩選產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物的微生物菌種。常用的一些鑒別培養(yǎng)基見表4-13表4-13一些鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)基名稱加入化學物質(zhì)微生物代謝產(chǎn)物培養(yǎng)基特征性變化主要用途

酪素培養(yǎng)基酪素胞外蛋白酶蛋白水解圈鑒別產(chǎn)蛋白酶菌株明膠培養(yǎng)基明膠胞外蛋白酶明膠液化鑒別產(chǎn)蛋白酶菌株油脂培養(yǎng)基食用油、土溫、中性紅指示劑胞外脂肪酶由淡紅色變成深紅色鑒別產(chǎn)脂肪酶菌株淀粉培養(yǎng)基可溶性淀粉胞外淀粉酶淀粉水解圈鑒別產(chǎn)淀粉酶菌株H2S試驗培關(guān)苴養(yǎng)基醋酸鉛H2S產(chǎn)生黑色沉淀鑒別產(chǎn)H2S菌株糖發(fā)酵培養(yǎng)基澳甲酚紫乳酸、醋酸、丙酸等由紫色變成黃色鑒別腸道細菌遠藤氏培養(yǎng)基堿性復紅、亞硫酸鈉酸、乙醛帶金屬光澤深紅色菌落鑒別水中大腸菌群伊紅美藍培關(guān)苴養(yǎng)基伊紅、美藍酸帶金屬光澤深紫色菌落鑒別水中大腸菌群(4)選擇培養(yǎng)基(selectivemedium)選擇培養(yǎng)基是用來將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來的培養(yǎng)基。根據(jù)不同種類微生物的特殊營養(yǎng)需求或?qū)δ撤N化學物質(zhì)的敏感性不同，在培養(yǎng)基中加入相應的特殊營養(yǎng)物質(zhì)或化學物質(zhì)，抑制不需要的微生物的生長,有利于所需微生物的生長。一種類型選擇培養(yǎng)基是依據(jù)某些微生物的特殊營養(yǎng)需求設計的，例如，利用以纖維素或石蠟油作為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基，可以從混雜的微生物群體中分離出能分解纖維素或石蠟油的微生物;利用以蛋白質(zhì)作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以分離產(chǎn)胞外蛋白酶的微生物;缺乏氮源的選擇培養(yǎng)基可用來分離固氮微生物。另一類選擇培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入某種化學物質(zhì),這種化學物質(zhì)沒有營養(yǎng)作用,對所需分離的微生物無害,但可以抑制或殺死其他微生物,例如,在培養(yǎng)基中加入數(shù)滴10%酚可以抑制細菌和霉菌的生長,從而由混雜的微生物群體中分離出放線菌;在培養(yǎng)基中加入亞硫酸鉍,可以抑制革蘭氏陽性細菌和絕大多數(shù)革蘭氏陰性細菌的生長而革蘭氏陰性的傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)可以在這種培養(yǎng)基上生長；在培養(yǎng)基中加入染料亮綠(brilliantgreen)或結(jié)晶紫(crystalviolet),可以抑制革蘭氏陽性細菌的生長,從而達到分離革蘭氏陰性細菌的目的;在培養(yǎng)基中加入青霉素、四環(huán)素或鏈霉素，可以抑制細菌和放線菌生長，而將酵母菌和霉菌分離出來?，F(xiàn)代基因克隆技術(shù)中也常用選擇培養(yǎng)基,在篩選含有重組質(zhì)粒的基因工程菌株過程中,利用質(zhì)粒上具有的對某種(些)抗生素的抗性選擇標記,在培養(yǎng)基中加入相應抗生素,就能比較方便地淘汰非重組菌株,以減少篩選目標菌株的工作量。在實際應用中,有時需要配制既有選擇作用又有鑒別作用的培養(yǎng)基。例如，當要分離金黃色葡萄球菌時,在培養(yǎng)基中加入7.5%NaCl、甘露糖醇和酸堿指示劑,金黃色葡萄球菌可耐高濃度NaCl,且能利用甘露糖醇產(chǎn)酸。因此，能在上述培養(yǎng)基生長，而且菌落周圍培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化，則該菌落有可能是金黃色葡萄球菌,再通過進一步鑒定加以確定。(4)其它 I除上述四種主要類型外，培養(yǎng)基按用途劃分還有很多種，比如：分析培養(yǎng)基 (assaymedium)常用來分析某些化學物質(zhì)(抗生素、維生素)的濃度，還可用來分析微生物的營養(yǎng)需求；還原性培養(yǎng)基(reducedmedium)專門用來培養(yǎng)厭氧型微生物；組織培養(yǎng)物培養(yǎng)基(tissue-culturemidium)含有動、植物細胞，用來培養(yǎng)病毒、衣原體(chlamydia)、立克次氏體(rickettsia)及某些螺旋體(spirochete)等專性活細胞寄生的微生物。盡管如此，有些病毒和立克次氏體目前還不能利用人工培養(yǎng)基來培養(yǎng)，需要接種在動植物體內(nèi)、動植物組織中才能增殖。常用的培養(yǎng)病毒與立克次氏體的動物有小白鼠、家鼠和豚鼠，雞胚也是培養(yǎng)某些病毒與立克次氏體的良好營養(yǎng)基質(zhì)，雞瘟病毒、牛痘病毒、天花病毒、狂犬病毒等十幾種病毒也可用雞胚培養(yǎng)。瓊脂一從餐桌到實驗臺最早用來培養(yǎng)微生物的人工配制的培養(yǎng)基是液體狀態(tài)的，但是，用液體培養(yǎng)基分離并獲得微生物純培養(yǎng)非常困難：將混雜的微生物樣品進行系列稀釋，直到平均每個培養(yǎng)管中只有一個微生物個體，進而獲得微生物純培養(yǎng)物。此方法不僅煩瑣，而且重復性差，并常導致純培養(yǎng)物被雜菌污染。因此，在早期微生物學研究中，分離(病原)微生物的進展相當緩慢。利用固體培養(yǎng)基分離培養(yǎng)微生物的技術(shù)，首先是由德國細菌學家RobertKoch及其助手建立的。1881年，Koch發(fā)表論文介紹利用土豆片分離微生物的方法，其作法是：用灼燒滅菌的刀片將煮熟的土豆切成片，然后用針尖挑取微生物樣品在土豆片表面劃線接種，經(jīng)培養(yǎng)后可獲得微生物的純培養(yǎng)。上述方法的缺點是一些細菌在土豆培養(yǎng)基上生長狀態(tài)較差。幾乎在同時，Koch的助手FrederickLoeffler發(fā)展了利用肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)病原細菌的方法，Koch決定采取方法固化此培養(yǎng)基。值得提及的是，Koch還是一個業(yè)余攝影家，是他首先拍出細菌的顯微照片，具有利用銀鹽和明膠制備膠片的豐富經(jīng)驗。作為一名知識淵博的杰出科學家，Koch將其制備膠片方面的知識應用到微生物學研究方面，他將明膠和肉膏蛋白胨培養(yǎng)基混合后鋪在玻璃平板上，讓其凝固，然后采取在土豆片表面劃線接種的同樣方法在其表面接種微生物，獲得純培養(yǎng)。使用這種培養(yǎng)基效果良好，但由于明膠溶點低，而且容易被一些微生物分解利用，其使用受到限制。有意思的是，Koch一名助手的妻子FannieEilshemiusHesse,具有豐富的廚房經(jīng)驗，當她聽說明膠作為凝固劑遇到的問題后，提議以廚房中用來做果胨的瓊脂代替明膠。1882年，瓊脂就開始作為凝固劑用于固體培養(yǎng)基的配制，這樣，瓊脂從餐桌走向了實驗臺，為微生物學發(fā)展起到重要作用，一百多年來，一直延用至今，是培養(yǎng)基最好的凝固劑。第三節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞營養(yǎng)物質(zhì)能否被微生物利用的一個決定性因素是這些營養(yǎng)物質(zhì)能否進入微生物細胞。只有營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞后才能被微生物細胞內(nèi)的新陳代謝系統(tǒng)分解利用，進而使微生物正常生長繁殖。影響營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞的的因素主要有三個：其一是營養(yǎng)物質(zhì)本身的性質(zhì)。分子量、溶解性、電負性、極性等都影響營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞的難易程度。其二是微生物所處的環(huán)境。溫度通過影響營養(yǎng)物質(zhì)的溶解度、細胞膜的流動性及運輸系統(tǒng)的活性來影響微生物的吸收能力；pH和離子強度通過影響營養(yǎng)物質(zhì)的電離程度來影響其進入細胞的能力。例如，當環(huán)境pH比胞內(nèi)pH高時，弱堿性的甲胺進入大腸桿菌后以帶正電荷的形式存在，而這種狀態(tài)的甲胺不容易分泌而導致細胞內(nèi)甲胺濃度升高，當環(huán)境pH比胞內(nèi)pH低時，甲胺以帶正電荷的形式存在于環(huán)境中而難以進入細胞，導致細胞內(nèi)甲胺濃度降低；當環(huán)境中存在誘導物質(zhì)運輸系統(tǒng)形成的物質(zhì)時，有利于微生物吸收營養(yǎng)物質(zhì)。而環(huán)境中存在的代謝過程抑制劑、解偶聯(lián)劑以及能與原生質(zhì)膜上的蛋白質(zhì)或脂類物質(zhì)等成份發(fā)生作用的物質(zhì)(如巰基試劑、重金屬離子等)都可以在不同程度上影響物質(zhì)的運輸速率。另外，環(huán)境中被運輸物質(zhì)的結(jié)構(gòu)類似物也影響微生物細胞吸收被運輸物質(zhì)的速率，例如L-刀豆氨酸、L-賴氨酸或D-精氨酸都能降低釀酒酵母吸收L-精氨酸的能力。其三是微生物細胞的透過屏障(permeabilitybarrier)。所有微生物都具有一種保護機體完整性且能限制物質(zhì)進出細胞的透過屏障,滲透屏障主要由原生質(zhì)膜、細胞壁、莢膜及粘液層等組成的結(jié)構(gòu)。莢膜與粘液層的結(jié)構(gòu)較為疏松，對細胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)影響較小。革蘭氏陽性細菌由于細胞壁結(jié)構(gòu)較為緊密，對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收有一定的影響，分子量大于10000的葡聚糖難以通過這類細菌的細胞壁。真菌和酵母菌細胞壁只能允許分子量較小的物質(zhì)通過。與細胞壁相比，原生質(zhì)膜在控制物質(zhì)進入細胞的過程中起著更為重要的作用，它對跨膜運輸(transportacrossmembrane)的物質(zhì)具有選擇性,營養(yǎng)物質(zhì)的跨膜運輸是本節(jié)著重探討的問題。根據(jù)物質(zhì)運輸過程的特點，可將物質(zhì)的運輸方式分為擴散、促進擴散、主動運輸與膜泡運輸。、擴散(diffusion)原生質(zhì)膜是一種半透膜，營養(yǎng)物質(zhì)通過原生質(zhì)膜上的含水小孔，由高濃度的胞外（內(nèi)）環(huán)境向低濃度的胞內(nèi)（外）進行擴散。擴散是非特異性的，但原生質(zhì)膜上的含水小孔的大小和形狀對參與擴散的營養(yǎng)物質(zhì)分子有一定的選擇性。物質(zhì)在擴散過程中，既不與膜上的各類分子發(fā)生反應，自身分子結(jié)構(gòu)也不發(fā)生變化。擴散是一種最簡單的物質(zhì)跨膜運輸方式為純粹的物理學過程,在擴散過程中不消耗能量,物質(zhì)擴散的動力來自參與擴散的物質(zhì)在膜內(nèi)外的濃度差,營養(yǎng)物質(zhì)不能逆濃度運輸。物質(zhì)擴散的速率隨原生質(zhì)膜內(nèi)外營養(yǎng)物質(zhì)濃度差的降低而減小，直到膜內(nèi)外營養(yǎng)物質(zhì)濃度相同時才達到一個動態(tài)平衡。由于原生質(zhì)膜主要由磷脂雙分子層和蛋白質(zhì)組成而且膜上分布有含水膜孔,膜內(nèi)外表面為極性表面,中間為疏水層,因而物質(zhì)跨膜擴散的能力和速率與該物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān),分子量小、脂溶性、極性小的物質(zhì)易通過擴散進出細胞。另外,溫度高時,原生質(zhì)膜的流動性增加,有利于物質(zhì)擴散進出細胞，而pH與離子強度通過影響物質(zhì)的電離程度而影響物質(zhì)的擴散速率。擴散并不是微生物細胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要方式,水是唯一可以通過擴散自由通過原生質(zhì)膜的分子,脂肪酸、乙醇、甘油、苯、一些氣體分子（O2、CO2）及某些氨基酸在一定程度上也可通過擴散進出細胞。二、促進擴散（facilitateddiffusion）與擴散一樣，促進擴散也是一種被動的物質(zhì)跨膜運輸方式，在這個過程中不消耗能量，參與運輸?shù)奈镔|(zhì)本身的分子結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化，不能進行逆濃度運輸，運輸速率與膜內(nèi)外物質(zhì)的濃度差成正比。促進擴散與擴散的主要區(qū)別在于通過促進擴散進行跨膜運輸?shù)奈镔|(zhì)需要借助與載體（carrier）的作用才能進入細胞（圖4-1），而且每種載體只運輸相應的物質(zhì)，具有較高的專一性。被運輸物質(zhì)與相應載體之間存在一種親和力，而且這種親和力在原生質(zhì)膜內(nèi)外的大小不同，當物質(zhì)與相應載體在胞外親和力大而在胞內(nèi)親和力小時，通過被運輸物質(zhì)與相應載體之間親和力的大小變化，使該物質(zhì)與載體發(fā)生可逆性的結(jié)合與分離，導致物質(zhì)穿過原生質(zhì)膜進入細胞。被運輸物質(zhì)與載體之間親和力大小變化是通過載體分子的構(gòu)象變化而實現(xiàn)的。參與圖4-1促進擴散示意圖促進擴散的載體主要是一些蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)能促進物質(zhì)進行跨膜運輸,自身在這個過程中不發(fā)生化學變化,而且在促進擴散中載體只影響物質(zhì)的運輸速率,并不改變該物質(zhì)在膜內(nèi)外形成的動態(tài)平衡狀態(tài),被運輸物質(zhì)在膜內(nèi)外濃度差越大,促進擴散的速率越快,但是當被運輸物質(zhì)濃度過高而使載體蛋白飽和時,運輸速率就不再增加,這些性質(zhì)都類似于酶的作用特征,因此載體蛋白也稱為透過酶(permease)。透過酶大都是誘導酶,只有在環(huán)境中存在機體生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)時，相應的透過酶才合成。通過促進擴散進入細胞的營養(yǎng)物質(zhì)主要有氨基酸、單糖、維生素及無機鹽等。一般微生物通過專一的載體蛋白運輸相應的物質(zhì),但同時微生物對同一物質(zhì)的運輸由一種以上的載體蛋白來完成,例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimuriu)m利用四種不同載體蛋白運輸組氨酸釀酒酵母(Saccharomycescerevisia。有三種不同的載體蛋白來完成葡萄糖的運輸。另外,某些載體蛋白可同時完成幾種物質(zhì)的運輸，例如大腸桿菌可通過一種載體蛋白完成亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的運輸,但這種載體蛋白對這三種氨基酸的運輸能力有差別。除以蛋白質(zhì)載體介導的促進擴散外,一些抗菌素可以通過提高膜的離子通透性而促進離子進行跨膜運輸。短桿菌肽A是由15個L型和D型氨基酸交替連接而成的短肽,兩個短桿菌肽A分子可在膜上形成含水通道,離子可以穿過此通道進行跨膜運輸;纈氨霉素是一種環(huán)狀分子,K+可結(jié)合在環(huán)狀分子中心,而環(huán)狀分子外周的碳氫鏈使得該復合物能穿過膜的疏水性中心,從而促進K+的跨膜運輸,在這個過程中，纈氨霉素實際上起到載體的作用。三、主動運輸(activetransport)主動運輸是廣泛存在于微生物中的一種主要的物質(zhì)運輸方式。與擴散及促進擴散這兩種被動運輸(passivetransport)方式相比,主動運輸?shù)囊粋€重要特點是在物質(zhì)運輸過程中需要消耗能量,而且可以進行逆濃度運輸。在主動運輸過程中，運輸物質(zhì)所需能量來源因微生物不同而不同,好氧型微生物與兼性厭氧微生物直接利用呼吸能厭氧型微生物利用化學能(ATP),光合微生物利用光能，嗜鹽細菌通過紫膜(purplemembrane)利用光能。主動運輸與促進擴散類似之處在于物質(zhì)運輸過程中同樣需要載體蛋白,載體蛋白通過構(gòu)象變化而改變與被運輸物質(zhì)之間的親和力大小,使兩者之間發(fā)生可逆性結(jié)合與分離,從而完成相應物質(zhì)的跨膜運輸,區(qū)別在于主動運輸過程中的載體蛋白構(gòu)象變化需要消耗能量。主動運輸?shù)木唧w方式有多種,主要有初級主動運輸、次級主動運輸、基團轉(zhuǎn)位、Na+,K+-ATP酶（Na+,K+-ATPase）系統(tǒng)及ATP偶聯(lián)主動運輸?shù)取?初級主動運輸（primaryactivetransport）初級主動運輸指由電子傳遞系統(tǒng)、ATP酶或細菌嗜紫紅質(zhì)引起的質(zhì)子運輸方式,從物質(zhì)運輸?shù)慕嵌瓤紤]是一種質(zhì)子的主動運輸方式。呼吸能、化學能和光能的消耗，引起胞內(nèi)質(zhì)子（或其他離子）外排,導致原生質(zhì)膜內(nèi)外建立質(zhì)子濃度差（或電勢差），使膜處于充能狀態(tài)（圖4-2）,即形成能化膜（energizedmembrane）。不同微生物的初級主動運輸方式不同,好氧型微生物和兼性厭氧微生物在有氧條件下生長時,物質(zhì)在胞內(nèi)氧化釋放的電子在位于原生質(zhì)膜上的電子傳遞鏈上傳遞的過程中伴隨質(zhì)子外排;厭氧型微生物利用發(fā)酵過程中產(chǎn)生ATP,在位于原生質(zhì)膜上的ATP酶的作用下,ATP水解生成ADP和磷酸,同時伴隨質(zhì)子向胞外分泌;光合微生物吸收光能后,光能激發(fā)產(chǎn)生的電子在電子傳遞過程中也伴隨質(zhì)子外排;嗜鹽細菌紫膜上的細菌嗜紫紅質(zhì)吸收光能后，引起蛋白質(zhì)分子中某些化學基團pK值發(fā)生變化,導致質(zhì)子迅速轉(zhuǎn)移,在膜內(nèi)外建立質(zhì)子濃度差。.次級主動運輸（secondaryactivetransport）通過初級主動運輸建立的能化膜在質(zhì)子濃度差（或電勢差）消失的過程中，往往偶聯(lián)其他物質(zhì)的運輸，包括以下三種方式：同向運輸（symport）是指某種物質(zhì)與質(zhì)子通過同一載體按同一方向運輸（圖4-2a）。除質(zhì)子外,其他帶電荷離子（如鈉離子）建立起來的電勢差也可引起同向運輸。在大腸桿菌中，通過這種方式運輸?shù)奈镔|(zhì)主要有丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸、谷氨酸、半乳糖、巖藻糖、蜜二糖、阿拉伯糖、乳酸、葡萄糖醛酸及某些陰離子（如HPO42-、HSO4-）等；逆向運輸（antiport）是指某種物質(zhì)（如Na+）與質(zhì)子通過同一載體按相反方向進