實驗十五：酸性磷酸酶的顯示

實驗十五：酸性磷酸酶的顯示第1頁/共11頁實驗十一：細胞內(nèi)化學成分的顯示方法——酸性磷酸酶的顯示【課前預習】1．溶酶體分為幾類，各有何特點？2．溶酶體是如何形成的？其標志酶是什么？如何在顯微鏡下顯示？3．溶酶體具有哪些功能？第2頁/共11頁【目的要求】1．熟悉酸性磷酸酶顯示方法的原理及操作步驟2．觀察酸性磷酸酶在細胞中的分布第3頁/共11頁【基本原理】1．細胞化學：細胞化學是在保持細胞原有形態(tài)結構的基礎上，利用已知的化學反應原位顯示細胞內(nèi)的某種化學成分，然后通過顯微鏡進行定性、定位、定量研究的科學。2．細胞化學技術要求：保持樣品的形態(tài)結構不發(fā)生改變；保存細胞內(nèi)生前化學成分及酶的活性；顯示成分的化學反應必須對將被顯示的化學物質(zhì)有高度特異性和高度靈敏性；反應所生成的產(chǎn)物要在原位沉淀、顯色明顯、不溶、不擴散，并在重復實驗中結果一致。3．染色的作用：由于正常的生物組織是無色透明的，因此無法在光鏡下進行觀察。因此必須要對樣品進行染色；染色劑可以滲透到組織的間隙中，細胞中的蛋白質(zhì)等成份可以吸附不同的色素粒子；染色劑中的陽離子和陰離子可分別與細胞中的酸性、堿性物質(zhì)相結合。染色就是根據(jù)這些原理，利用染色劑與細胞內(nèi)含物的物理作用與化學作用，將細胞和組織染成各種不同的顏色；由于染色劑的化學性質(zhì)不同，以及固定材料時所用的固定劑不同，染色劑對被染色的組織有一定的選擇性，從而使某些部位染色很清楚，而另一些部位可能完全不著色。例如，有些染色劑可染細胞核，有些染色劑可染細胞質(zhì)。第4頁/共11頁4．染色的方法：（1）利用化學原理進行的染色方法：金屬沉淀法：利用酶催化反應形成的分解產(chǎn)物與金屬化合物反應，最終生成有色沉淀，借此辨認所要檢查的酶的活性。偶氮偶聯(lián)法：用人工合成的酶底物在酶的作用下產(chǎn)生分解產(chǎn)物，后者與重氮鹽結合形成不溶性的偶氮色素。Schiff反應法：游離的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)樽霞t色產(chǎn)物，這種反應通常用于顯示多糖類（PAS反應）和脫氧核糖核酸（Feulgen反應）。聯(lián)苯胺法：過氧化物酶分解H2O2產(chǎn)生氧，后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍，進而變成棕色化合物。四唑鹽顯示脫氫酶；（2）利用物理學原理進行的染色：脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。熒光分析：借某些物質(zhì)可被紫外線激發(fā)產(chǎn)生可見熒光而被顯示。也可用熒光染色法將特定的熒光染料對細胞中的化學成分染色，在熒光顯微鏡下對這些成分進行直接觀察。放射自顯影技術：用放射性核素標記化合物，使其在細胞中參與代謝，將帶有標記的代謝產(chǎn)物通過放射自顯影技術顯示出來，借以探測物質(zhì)代謝途徑和細胞增殖周期；（3）利用免疫學原理的染色方法：大分子物質(zhì)具有免疫原性可制備特異抗體。用各種標記物如熒光素、辣根過氧化物酶和膠體金等標記該抗體，利用免疫學抗原抗體反應原理，用標記抗體顯示相應抗原。第5頁/共11頁5．酸性磷酸酶的顯示方法：酸性磷酸酶（acidphosphatase，ACP）主要存在于巨噬細胞，定位于溶酶體內(nèi)。在溶酶體膜穩(wěn)定完整時，底物不易滲入，ACP活力微弱或無活性，經(jīng)固定，在合適pH條件下，膜本身變?yōu)椴环€(wěn)定，逐漸改變其滲透性，底物可以滲入，酶活力被顯示。ACP在酸性條件下（pH4.7）可使作用液中的底物β-甘油磷酸鈉的磷酸根解離出來，進而與溶液中硝酸鉛結合形成磷酸鉛沉淀，因其是難溶解的無色沉淀物，需要與黃色的硫化銨作用，生成棕黑色PbS沉淀而被顯示出來。β-甘油磷酸鈉甘油+PO3-PO4+Pb（NO3)2Pb2（PO4)2Pb2（PO4)4+（NH4)2SPbS第6頁/共11頁【實驗用品】1．器材：注射器、解剖用具、恒溫水浴鍋、載玻片、蓋玻片2．試劑：3%淀粉溶液；ACP作用液；2%硫化銨Gomori硝酸鉛作用液0.05mol／L醋酸緩沖液（pH5)lOOml0.6醋酸加蒸餾水200ml、取其42ml醋酸鈉1.36g加蒸餾水200ml，取其158ml共200mlB-甘油磷酸鈉2g醋酸鉛2g5％氯化鎂5ml以上作用液在臨用時配制，最終在pH5～5.2，過濾使用。3．材料：小鼠腹腔液涂片第7頁/共11頁【方法步驟】1．免疫動物：實驗前4～6天用無菌注射器取已滅菌的3%淀粉溶液1ml注射于小鼠腹腔內(nèi)，每天一次。2．頸椎脫臼處死小鼠，打開腹腔。3．吸取少量腹腔液，在玻片上涂層一薄層，室溫晾干。4．將涂片滴置于溫盒中，滴加適量ACP作用液，37℃作用30分鐘。取出后，蒸餾水漂洗。用10%甲醛鈣溶液后固定5min。5．玻片入2%硫化胺溶液作用2～3min，進行顯色。取出后蒸餾水漂洗，鏡檢。6．對照組的作用液中不加β-甘油磷酸鈉，而以蒸餾水代替；或入作用液前先用高溫（50）處理30min，使酶失去活性，作好標記，然后同時進行上述實驗。第8頁/共11頁