實(shí)驗(yàn)細(xì)菌的培養(yǎng)方法

實(shí)驗(yàn)細(xì)菌的培養(yǎng)方法第1頁/共40頁微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)一

細(xì)菌的培養(yǎng)方法（綜合性實(shí)驗(yàn)）第2頁/共40頁1.實(shí)驗(yàn)室規(guī)則2．錄相：細(xì)菌標(biāo)本的采集和細(xì)菌的接種方法3．操作：⑴細(xì)菌的接種法（液體、半固體、固體1套/3人）⑵空氣中細(xì)菌的檢查（沉降法血平板1塊/6人）⑶呼吸道細(xì)菌的檢查（咳碟培養(yǎng)血平板1塊/3人）⑷隨身物品的細(xì)菌檢查（普通平板1塊/3人）4.材料：⑴大腸桿菌斜面培養(yǎng)物（1支/6人）⑵碘酒、75%酒精、棉簽等（1套/6人）

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容第3頁/共40頁教學(xué)目標(biāo)了解：培養(yǎng)基的類型與制備方法；細(xì)菌菌落的觀察常用的細(xì)菌接種方法和各種細(xì)菌的培養(yǎng)方法掌握：

1.細(xì)菌的液體、半固體、固體接種

2.空氣中細(xì)菌的檢查方法——沉降法

3.呼吸道細(xì)菌的檢查法——咳碟法

4.隨身物品的細(xì)菌檢查方法第4頁/共40頁實(shí)驗(yàn)室規(guī)則1.穿白大褂，盡量少帶物件進(jìn)實(shí)驗(yàn)室。2.嚴(yán)格按老師及教材要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以獲得正確結(jié)果。3.書、筆記本、筆等文具放入實(shí)驗(yàn)臺(tái)抽屜里。4.嚴(yán)禁在實(shí)驗(yàn)室喝水，吃東西，用嘴咬筆或標(biāo)簽，不要用手撫摸頭、臉等部位，以免發(fā)生感染。

微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的對(duì)象多為病原微生物，如有不慎就會(huì)發(fā)生實(shí)驗(yàn)室感染。第5頁/共40頁5.實(shí)驗(yàn)室不得高聲喧嘩，保持安靜，守秩序，不要隨便走動(dòng)，以免影響他人實(shí)驗(yàn)和安全。6.如果發(fā)生實(shí)驗(yàn)室不慎，吸入菌液、劃破手指、培養(yǎng)物破損傳染物外溢，應(yīng)及時(shí)報(bào)告，及時(shí)處理。7.實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意節(jié)約實(shí)驗(yàn)材料、愛護(hù)儀器，損壞器材要及時(shí)報(bào)告、登記、并作相應(yīng)的賠償。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)物品，未經(jīng)老師許可，嚴(yán)禁帶出室外。第6頁/共40頁8.每次實(shí)驗(yàn)之后，所用物品放回原處。需要培養(yǎng)或消毒處理的物品及時(shí)送到指定地點(diǎn)，用過的涂菌載玻片放入小桶內(nèi)，不得亂丟亂放。9.實(shí)驗(yàn)完畢，整理桌面，肥皂洗手，值日生打掃實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生，關(guān)好水電門窗，待老師檢查后方可離開。第7頁/共40頁

細(xì)菌和其它生物一樣，大多數(shù)屬異養(yǎng)菌，必須從周圍環(huán)境中攝取營養(yǎng)，進(jìn)行新陳代謝及生長繁殖等生命活動(dòng)。人為地提供細(xì)菌生長繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)（適宜的培養(yǎng)基）和創(chuàng)造適合細(xì)菌生長繁殖的有利條件如溫度、濕度、氣體等，能使細(xì)菌在體外迅速生長繁殖。細(xì)菌的人工培養(yǎng)第8頁/共40頁細(xì)菌生長繁殖的條件：1．充足的營養(yǎng)物質(zhì)2．適宜的溫度3．合適的酸堿度（pH）4．必要的氣體環(huán)境第9頁/共40頁一、細(xì)菌生長繁殖所需營養(yǎng)

1．水

營養(yǎng)的吸收與代謝均需有水才能進(jìn)行。2．碳源病原菌主要從糖類獲得碳及能量。

4．無機(jī)鹽

常用元素如磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣、鐵等3．氮源其主要功能是作為菌體成分的原料。5．生長因子

某些細(xì)菌生長所必需而又不能自身合成的有機(jī)化合物。第10頁/共40頁（一）培養(yǎng)基（culturemedium）

由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)物制品。培養(yǎng)基的制備第11頁/共40頁（1）按用途劃分1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基含多數(shù)細(xì)菌生長所需要的最基本營養(yǎng)，能滿足一般細(xì)菌生長繁殖的營養(yǎng)需要，如肉湯（含有水、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉等原料）。2）營養(yǎng)培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入葡萄糖、血液、酵母浸膏等。1、培養(yǎng)基的類型及應(yīng)用第12頁/共40頁3）鑒別培養(yǎng)基4）選擇培養(yǎng)基

在培養(yǎng)基中加入一定底物和指示劑，而不同種類的細(xì)菌由于分解代謝及合成代謝能力的不同，會(huì)產(chǎn)生不同的特征性培養(yǎng)結(jié)果，從而將不同細(xì)菌區(qū)分開來的培養(yǎng)基。

在培養(yǎng)基中加入某些特殊的營養(yǎng)物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)，使之能抑制一些細(xì)菌生長，而有利于另一些細(xì)菌生長，從而將后者從混雜的細(xì)菌群體中分離出來的培養(yǎng)基。第13頁/共40頁SS瓊脂培養(yǎng)基（Salmonella-Shigellaagar）

大腸埃希菌沙門菌志賀菌第14頁/共40頁5）厭氧培養(yǎng)基

用于培養(yǎng)厭氧性細(xì)菌的培養(yǎng)基，此時(shí)需要在培養(yǎng)基中加入還原劑降低培養(yǎng)基的氧化還原電勢，厭氧菌才能生長發(fā)育。

皰肉培養(yǎng)基

——不飽和脂肪酸和谷胱甘肽第15頁/共40頁（2）根據(jù)物理狀態(tài)分液體培養(yǎng)基：增菌固體培養(yǎng)基（瓊脂濃度為1.5％）：分離培養(yǎng)半固體培養(yǎng)基（瓊脂濃度為0.5%）：動(dòng)力檢查

液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基第16頁/共40頁嗜冷菌（10-20℃）嗜溫菌（20-40℃）：絕大多數(shù)病原菌嗜熱菌（50-60℃）二、適宜的溫度第17頁/共40頁嗜中性菌（pH6.0-8.0）嗜酸性菌（pH<5.5）嗜堿性菌（pH>8.5）多數(shù)病原菌最適酸堿度為pH7.2-7.6霍亂弧菌耐堿(pH8.4-9.2)結(jié)核分枝桿菌耐酸(pH6.5-6.8)三、適宜的酸堿度（pH）第18頁/共40頁氧和二氧化碳1、按細(xì)菌對(duì)氧的需求可分為四種類型：

專性需氧菌（obligateaerobe）

兼性厭氧菌（facultativeanaerobe）

微需氧菌（microaerophilicbacterium）

專性厭氧菌（obligateanaerobe）四、適宜的氣體環(huán)境第19頁/共40頁2、細(xì)菌的二氧化碳培養(yǎng)法燭缸法二氧化碳孵箱

某些細(xì)菌（腦膜炎雙球菌、淋球雙球菌、布氏桿菌等少數(shù)細(xì)菌）的生長，需在孵育時(shí)加入5-10%CO2示教第20頁/共40頁1.細(xì)菌的接種法：液體、半固體、固體培養(yǎng)基2.空氣中細(xì)菌的檢查（沉降法，血平板）3.呼吸道細(xì)菌的檢查（咳碟培養(yǎng)，血平板）4.隨身物品細(xì)菌檢查（普通平板）操作內(nèi)容第21頁/共40頁

細(xì)菌的分離接種是人工分離培養(yǎng)細(xì)菌的重要步驟，是微生物學(xué)的基本技術(shù)之一，其目的是從含多種細(xì)菌的患者標(biāo)本中分離出單一病原菌，從而可以進(jìn)行感染性疾病的病原學(xué)診斷。同時(shí)，在細(xì)菌學(xué)的研究，生物制品如疫苗、類毒素、抗毒素和免疫血清等的制備，基因工程及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等方面，人工培養(yǎng)分離細(xì)菌，都有著極為重要的意義。

操作一細(xì)菌的接種法第22頁/共40頁瓊脂平板劃線分離接種法（固體培養(yǎng)基）劃線法斜面培養(yǎng)基接種法（蛇形劃線法）半固體培養(yǎng)基接種法（穿刺法）液體培養(yǎng)基接種法（乳磨法）

接種時(shí)要注意無菌操作，避免污染，也要防止細(xì)菌外溢污染環(huán)境。細(xì)菌的分離接種方法第23頁/共40頁固體平板培養(yǎng)基的劃線接種三線法第24頁/共40頁劃線接種手法第25頁/共40頁平板劃線接種的結(jié)果——菌落觀察1．固體平板培養(yǎng)結(jié)果觀察單個(gè)微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面生長、繁殖到一定程度，可以形成肉眼可見的有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的細(xì)菌集團(tuán)，稱為菌落（colony）。菌落特征是鑒別細(xì)菌的重要依據(jù)之一。第26頁/共40頁肺炎克雷伯菌奇異變形桿菌菌落形態(tài)鏈球菌第27頁/共40頁斜面培養(yǎng)基接種——蛇形劃線第28頁/共40頁半固體培養(yǎng)基的穿刺接種及結(jié)果觀察第29頁/共40頁液體培養(yǎng)基的乳磨接種手法第30頁/共40頁液體培養(yǎng)結(jié)果觀察表面生長

沉淀生長

混濁生長

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空氣中沒有營養(yǎng)物質(zhì)，且受日光中紫外線的作用，細(xì)菌一般不能繁殖。然而，土壤中有大量的細(xì)菌存在，可隨塵埃散布到空氣中；寄生在人和動(dòng)物呼吸道及消化道中的細(xì)菌也能通過各種途徑散布到空氣中，使得空氣中也有一定量的細(xì)菌存在?？諝庵屑?xì)菌的數(shù)量和種類隨地區(qū)、季節(jié)和人口密度的不同而不同。通常，可測定單位體積空氣中所含細(xì)菌的數(shù)量來評(píng)價(jià)空氣的污染程度。操作二空氣中細(xì)菌的檢查第32頁/共40頁

沉降法是利用含有細(xì)菌的塵粒或氣溶膠粒因重力作用自然下降到培養(yǎng)基表面，通過細(xì)菌培養(yǎng)，計(jì)數(shù)菌落數(shù)，粗略評(píng)估空氣中細(xì)菌含量。

沉降法簡單易行，缺點(diǎn)是不夠準(zhǔn)確。但它客觀地反映了空氣污染的程度和衛(wèi)生通風(fēng)狀況，對(duì)手術(shù)室、食品業(yè)等有重要的參考意義，是判斷空氣污染的指標(biāo)之一。第33頁/共40頁操作：將血平板打開蓋，放到教室的四個(gè)角上，靜止15分鐘后，合上蓋送37℃孵箱培養(yǎng)。

據(jù)推算，每100cm2培養(yǎng)基在空氣中暴露5min，其表面接受自然沉降的細(xì)菌數(shù)約相當(dāng)于10升空氣中所含的細(xì)菌量。那么，暴露于空氣中15min應(yīng)相當(dāng)于30升，所以，每m3空氣中活菌數(shù)=（100cm2培養(yǎng)基上菌落平均數(shù)/30）x1000注意：計(jì)數(shù)菌落時(shí)，兩個(gè)或幾個(gè)菌落邊緣有重疊者，均分別計(jì)算為兩個(gè)或幾個(gè)。第34頁/共40頁

人體呼吸道與外界相通，常常有不同種類的細(xì)菌存在。其中，1/4為需氧菌，3/4為厭氧菌。這些細(xì)菌常是條件致病菌，在一般情況下并不致病。有時(shí)，正常人的呼吸道中也有致病菌的存在，如肺炎球菌、腦膜炎球菌、乙型鏈球菌、流感桿菌等，是引起疾病傳播的一個(gè)重要因素。由于寄居人體的關(guān)系，這些細(xì)菌對(duì)營養(yǎng)的要求較高，常需要用含血液成分的培養(yǎng)基進(jìn)行分離。操作三呼吸道細(xì)菌的檢查—咳碟試驗(yàn)第35頁/共40頁操作方法：打開血平板，將平板置于口腔前約15cm處，對(duì)準(zhǔn)培養(yǎng)基表面用力咳嗽3～4次，然后蓋好平板蓋，放置于37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷：平板上可有不同的菌落長出，觀察菌落的形態(tài)、大小及溶血現(xiàn)象。第36頁/共40頁

人體的皮膚表面有多種細(xì)菌存在，用水洗手或用肥皂洗手，可以除去皮膚上的污垢和灰塵，從而減少手上細(xì)菌數(shù)量，但并不能有效的殺死細(xì)菌。日常醫(yī)療、試驗(yàn)工作中常用的化學(xué)消毒劑如碘酒、酒精等有很好的殺菌作用，在臨床醫(yī)療中廣泛應(yīng)用。操作四正常人體皮膚及隨身物品的細(xì)菌檢查第37頁/共40頁1、在平板底部用筆劃分8個(gè)區(qū)，分別標(biāo)記為①②③④⑤⑥⑦⑧。2、用右手食指在①區(qū)上輕輕按一下，然