蛋白質(zhì)定量分析

蛋白質(zhì)定量分析第一頁(yè)，共二十一頁(yè)，2022年，8月28日定性分析定量分析有沒有是不是有多少第二頁(yè)，共二十一頁(yè)，2022年，8月28日內(nèi)容BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)定量分析的方法操作注意事項(xiàng)思考討論第三頁(yè)，共二十一頁(yè)，2022年，8月28日

BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

2.掌握分光光度計(jì)的使用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握BCA法測(cè)定血清蛋白質(zhì)濃度的原理。第四頁(yè)，共二十一頁(yè)，2022年，8月28日BCA分子式BCA試劑盒實(shí)驗(yàn)原理

BCA(bicinchoninicacid,二辛可酸）第五頁(yè)，共二十一頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)原理紫藍(lán)色562nm第六頁(yè)，共二十一頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)步驟（一）實(shí)驗(yàn)材料

1、器材721型分光光度計(jì)、恒溫水浴箱、移液管、試管

2、試劑（1）試劑A:含1%BCA二鈉鹽、2%無(wú)水碳酸鈉、0.16%酒石酸鈉、0.4%氫氧化鈉、0.95%碳酸氫鈉，將上述液體混合后調(diào)pH至11.25。（2）試劑B：4%硫酸銅。（3）BCA工作液：試劑A100mL+試劑B2mL，混合。（4）蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取150mg牛血清白蛋白，溶于

100mL蒸餾水中，即為1.5mg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。（5）待測(cè)樣品。第七頁(yè)，共二十一頁(yè)，2022年，8月28日

表1BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

管號(hào)試劑（mL）

空白管

1

2

3

4

5

測(cè)定管

標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（0.3mg/ml）

—

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

—

蒸餾水

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

—

—

待測(cè)樣品

—

—

—

—

—

—

0.5

BCA工作液

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

蛋白質(zhì)含量g

30

60

90

120

150

數(shù)據(jù)有改動(dòng)ug第八頁(yè)，共二十一頁(yè)，2022年，8月28日1、將上述各管混勻后于37°C保溫30分鐘，用562nm波長(zhǎng)比色測(cè)定吸光度值。2、以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3、用測(cè)定管光吸收值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量M，再計(jì)算出待測(cè)血清中蛋白質(zhì)濃度（g/L)。 （二）實(shí)驗(yàn)操作C=MV——×250第九頁(yè)，共二十一頁(yè)，2022年，8月28日蛋白質(zhì)定量分析的方法紫外線吸收法改良微量凱式定氮法雙縮脲法

Folin-酚試劑法考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法

BCA法280nm16%第十頁(yè)，共二十一頁(yè)，2022年，8月28日方法靈敏度時(shí)間原理干擾物紫外線吸收法較低快速酪氨酸和色氨酸在280nm的光吸收核苷酸改良凱氏定氮低費(fèi)時(shí)將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮雙縮脲法低中速肽鍵和堿性Cu2＋形成紫色絡(luò)合物硫酸銨；Tris緩沖液某些氨基酸Lowry法高費(fèi)時(shí)雙縮脲反應(yīng)；酚試劑被還原甘氨酸硫醇考馬斯亮藍(lán)法高快速G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合物在595nm的光吸值強(qiáng)堿性緩沖液TritonX-100;SDSBCA法最高較快肽鍵和堿性Cu2＋形成紫色絡(luò)合物不受去污劑、尿素等的影響第十一頁(yè)，共二十一頁(yè)，2022年，8月28日

BCA法的特點(diǎn)

1、操作簡(jiǎn)便，快速2、準(zhǔn)確靈敏，試劑穩(wěn)定性好

3、抗試劑干擾能力較強(qiáng)4、經(jīng)濟(jì)實(shí)用第十二頁(yè)，共二十一頁(yè)，2022年，8月28日注意事項(xiàng)1、實(shí)驗(yàn)分組2、準(zhǔn)確量取試劑，吸管殘余液體要吹出。3、平行加樣，物歸原位。4、正確使用分光光度計(jì)，比色杯不潤(rùn)洗。5、正確繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)注名稱、姓名、儀器型號(hào)、作圖時(shí)間。6、實(shí)驗(yàn)結(jié)果書寫規(guī)范，三線表。第十三頁(yè)，共二十一頁(yè)，2022年，8月28日可見光分光光度計(jì)的操作步驟：1）預(yù)熱儀器。2）選定波長(zhǎng)。3）固定靈敏度檔。一般固定在“1”檔。4）調(diào)節(jié)“0”點(diǎn)。5）調(diào)節(jié)T=100％。6）測(cè)定。7）關(guān)機(jī)。（重復(fù)2-3次）第十四頁(yè)，共二十一頁(yè)，2022年，8月28日表1BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量管號(hào)空白管12345測(cè)定管M（ug）306090120150？吸光值儀器型號(hào)：721/722型波長(zhǎng)=562nm第十五頁(yè)，共二十一頁(yè)，2022年，8月28日思考討論1、蛋白質(zhì)定量分析的多種方法中，哪種方法更適合測(cè)定血清蛋白的濃度，說(shuō)出你的理由？2、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，有沒有可改進(jìn)的方法，如果有請(qǐng)說(shuō)出你的想法？第十六頁(yè)，共二十一頁(yè)，2022年，8月28日

下次實(shí)驗(yàn)：血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

預(yù)習(xí)要點(diǎn)：1、復(fù)習(xí)蛋白質(zhì)兩性解離。2、預(yù)習(xí)電泳的基本原理。3、請(qǐng)簡(jiǎn)要寫出操作流程圖。4、請(qǐng)寫出計(jì)算公式。第十七頁(yè)，共二十一頁(yè)，2022年，8月28日第十八頁(yè)，共二十一頁(yè)，2022年，8月28日

一、蛋白質(zhì)的相關(guān)理論知識(shí)16%蛋白質(zhì)的平均含氮量樣品中蛋白質(zhì)的含量=樣品中氮含量÷16%（或×6.25）凱氏定氮法1、元素組成第十九頁(yè)，共二十一頁(yè)，2022年，8月28日

2、蛋白質(zhì)的紫外吸收280nm蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸的特征性吸收峰紫外線吸收法共軛雙鍵第二十頁(yè)，共二十一頁(yè)，202