上海市結(jié)核病實驗診斷操作規(guī)程演示文稿

上海市結(jié)核病實驗診斷操作規(guī)程演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有71頁\編輯于星期六（優(yōu)選）上海市結(jié)核病實驗診斷操作規(guī)程現(xiàn)在是2頁\一共有71頁\編輯于星期六第一章結(jié)核病及其實驗診斷的概述現(xiàn)在是3頁\一共有71頁\編輯于星期六結(jié)核病是一種嚴重危害人民健康的慢性傳染病，目前全球有約20億人被感染，每年新出現(xiàn)結(jié)核病患者約800-1000萬，每年因結(jié)核病死亡人數(shù)約為200-300萬。我國結(jié)核病患病人數(shù)居世界第二位，僅次于印度。我國結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為130萬，因結(jié)核病死亡人數(shù)每年達13萬，超過其他傳染病死亡人數(shù)的總和。結(jié)核病是我國重點防控的重大傳染性疾病之一。現(xiàn)在是4頁\一共有71頁\編輯于星期六第一節(jié)編寫目的和應(yīng)用范圍現(xiàn)在是5頁\一共有71頁\編輯于星期六根據(jù)我國的結(jié)核病防控體系，結(jié)核病的診治工作主要在定點醫(yī)院內(nèi)進行。初次感染病人的癥狀往往不典型，存在輕癥甚至無癥狀的結(jié)核病，老年人的結(jié)核病癥狀容易被其他疾病掩蓋。這些病人的首診醫(yī)院往往不是定點醫(yī)院。非定點醫(yī)院的實驗室人員一般未經(jīng)過結(jié)核分枝桿菌檢驗的正規(guī)培訓(xùn)和能力認可，操作規(guī)程、方法和檢測的能力各不相同，容易導(dǎo)致不正確的檢驗結(jié)果，使結(jié)核病的漏診、誤診率增加?，F(xiàn)在是6頁\一共有71頁\編輯于星期六第二節(jié)結(jié)核病基礎(chǔ)知識現(xiàn)在是7頁\一共有71頁\編輯于星期六一、結(jié)核病定義和傳播途徑結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacteriumtuberculosiscomplex,簡稱結(jié)核分枝桿菌）引起的慢性感染性疾病，可累及全身多個器官系統(tǒng)，最常見的患病部位是肺臟。傳播途徑主要是通過呼吸道傳播。個體吸入含有結(jié)核分枝桿菌的飛沫后是否患病取決于吸入結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量、毒力和個體的抵抗力等多種因素?，F(xiàn)在是8頁\一共有71頁\編輯于星期六二、結(jié)核分枝桿菌生物特性結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌，引起人類結(jié)核病的主要病原菌是結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌大小為m×1-4m，菌體細長而略彎，兩端略鈍?？顾崛旧栃允瞧渲匾匦?。結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，至少需要2-4周才出現(xiàn)可見菌落。結(jié)核分枝桿菌細胞壁富含脂質(zhì)，約占細胞壁的60%，主要的成分是分枝菌酸和酸化海藻糖。前者是抗酸染色反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)；后者包括海藻糖雙分枝菌酸和硫甘酸，分別具有介導(dǎo)肉芽腫形成和保護細菌在吞噬細胞內(nèi)存活的作用，被認為是結(jié)核分枝桿菌的毒力因素。

現(xiàn)在是9頁\一共有71頁\編輯于星期六三、檢測分枝桿菌的臨床意義

臨床檢測分枝桿菌的最終目的是為了輔助分枝桿菌感染患者的診斷及治療。根據(jù)病人標本類型不同，所分離到分枝桿菌的臨床意義也各不相同，實驗室應(yīng)盡快對病原菌做出鑒定，以確定其臨床意義?，F(xiàn)在是10頁\一共有71頁\編輯于星期六（一）非結(jié)核分枝桿菌找到非結(jié)核分枝桿菌的臨床意義取決于很多因素，包括：臨床環(huán)境和宿主狀態(tài)病原菌種類及其致病性分離培養(yǎng)標本的來源及其被污染的可能性被檢出病原菌的數(shù)量（包括抗酸染色涂片）陽性培養(yǎng)的次數(shù)現(xiàn)在是11頁\一共有71頁\編輯于星期六非結(jié)核分枝桿菌與臨床疾病的關(guān)系非結(jié)核分枝桿菌菌種臨床相關(guān)疾病 標本來源膿腫分枝桿菌或鳥分枝

患有囊性纖維變性或呼吸道桿菌復(fù)合群（MAC）

支氣管擴張的老年人 偶發(fā)分枝桿菌 食道賁門失弛緩癥，慢性呼吸道

返流病，或礦物油攝入史 海分枝桿菌 有魚缸或海水接觸史的嚴重傷口活檢/抽吸物堪薩斯分枝桿菌或MAC

毛細胞白血病，HIV感染史 血液，骨髓龜分枝桿菌，膿腫分枝

慢性免疫抑制藥（如類固醇激素）桿菌或嗜血分枝桿菌 導(dǎo)致的浸潤性皮膚損傷活檢/抽吸物龜分枝桿菌，類龜分枝中央靜脈導(dǎo)管，假肢，桿菌，偶發(fā)分枝桿菌或創(chuàng)口，膿腫分枝桿菌 注射部位，局部創(chuàng)傷 活檢/抽吸物現(xiàn)在是12頁\一共有71頁\編輯于星期六四、實驗室檢查結(jié)核分支桿菌檢查是確診結(jié)核病最特異的方法?，F(xiàn)在是13頁\一共有71頁\編輯于星期六（一）痰涂片優(yōu)點：操作簡便，價格低廉，能快速檢測出感染性肺結(jié)核。缺點：直接涂片法靈敏度相對不高，要求每毫升痰標本中至少要包含5,000個桿狀細菌才能檢出陽性。肺外結(jié)核、HIV合并感染結(jié)核以及非結(jié)核分枝桿菌（NTM）感染的涂片靈敏度更低。限制因素：抗酸桿菌（AFB）涂片鏡檢不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌（NTM），也不能區(qū)分死菌與活菌、耐藥與敏感菌株?，F(xiàn)在是14頁\一共有71頁\編輯于星期六（二）分枝桿菌培養(yǎng)優(yōu)點：分枝桿菌的分離培養(yǎng)和菌種鑒定能為結(jié)核病患者提供最終的診斷依據(jù)，與涂片相比可顯著提高陽性檢出率（通常提高30%-50%）。分離培養(yǎng)同時也為藥物敏感性試驗提供實驗菌株。缺點：操作更復(fù)雜，價格更昂貴，且菌體生長周期緩慢，并要求由專門的實驗技術(shù)人員進行操作，用特殊的實驗儀器進行培養(yǎng)，且所有實驗必須保證在恰當?shù)纳锇踩珬l件下才能開展。限制因素：樣本在培養(yǎng)之前必須去污染，以抑制其他雜菌的生長。所有去污染的操作對分枝桿菌都有一定程度的傷害，因此，培養(yǎng)靈敏度不能達到100%?，F(xiàn)在是15頁\一共有71頁\編輯于星期六（三）基因檢測及鑒定優(yōu)點：在檢測速度、操作標準化、潛在高流通量以及較低的生物安全要求等明顯方面。2008年，WHO認證了用分子線形探針試驗（LPAs）可以快速檢測利福平耐藥性（單獨耐藥或與異煙肼聯(lián)合耐藥）。缺點：進行LPAs試驗仍需再做常規(guī)培養(yǎng)及DST。目前注冊使用的LPAs方法只適用于對涂片陰性培養(yǎng)陽性或涂片陽性標本進行檢測。限制因素：LPAs適合在中心實驗室/國家參比室開展。如果地區(qū)實驗室的基礎(chǔ)設(shè)施能達到要求，也可考慮開展實驗。現(xiàn)在是16頁\一共有71頁\編輯于星期六第三節(jié)相關(guān)術(shù)語現(xiàn)在是17頁\一共有71頁\編輯于星期六肺結(jié)核：意指肺內(nèi)結(jié)核。粟粒性結(jié)核有肺部病灶者也歸類為肺結(jié)核。肺外結(jié)核：包括結(jié)核性腦膜炎、心包膜結(jié)核、腹膜結(jié)核、脊椎結(jié)核、脊椎以外的骨與關(guān)節(jié)結(jié)核、腸結(jié)核、生殖泌尿系統(tǒng)結(jié)核，淋巴結(jié)核、皮膚結(jié)核；胸腔內(nèi)的肺門或縱膈腔淋巴結(jié)核或單純結(jié)核肋膜積液屬肺外結(jié)核。痰涂片陽性肺結(jié)核（涂陽肺結(jié)核）至少一次痰涂片顯微鏡檢查陽性、且醫(yī)師判定胸部X光的病灶符合肺結(jié)核的變化、決定實施一個完整抗結(jié)核治療的療程；至少一次痰涂片顯微鏡檢查陽性且該標本結(jié)核菌培養(yǎng)陽性。

相關(guān)術(shù)語現(xiàn)在是18頁\一共有71頁\編輯于星期六痰涂片陰性肺結(jié)核（涂陰肺結(jié)核）定義一：至少三套痰標本涂片顯微鏡檢查結(jié)果均為陰性；胸部X光病灶符合活動性肺結(jié)核變化；臨床上對一周以上廣譜抗生素治療無反應(yīng)（不包括使用抗結(jié)核藥、氟喹諾酮或氨基糖苷類)；醫(yī)師臨床診斷為結(jié)核病并決定實施一個完整的抗結(jié)核治療療程。定義二：痰涂片檢查陰性但痰培養(yǎng)陽性（涂陰培陽）醫(yī)師臨床診斷為結(jié)核病并決定實施一個完整的抗結(jié)核治療療程。相關(guān)術(shù)語現(xiàn)在是19頁\一共有71頁\編輯于星期六耐藥結(jié)核?。╠rug-resistanttuberculosis,DR-TB）：體外試驗證實結(jié)核患者感染的結(jié)核分枝桿菌對一種或多種抗結(jié)核藥物耐藥。單耐藥結(jié)核?。∕onodrug–resistanttuberculosis,DR-TB）：體外試驗證實結(jié)核患者感染的結(jié)核分枝桿菌對一種抗結(jié)核藥物耐藥。耐多藥結(jié)核?。∕ultidrug-resistanttuberculosis,MDR-TB）：體外試驗證實結(jié)核患者感染的結(jié)核分枝桿菌至少對一線抗結(jié)核藥物中的異煙肼和利福平耐藥。廣泛耐藥結(jié)核?。‥xtensivelydrug-resistanttuberculosis,XDR-TB）：體外試驗證實結(jié)核患者感染的結(jié)核分枝桿菌至少對一線抗結(jié)核藥物中的異煙肼和利福平耐藥外，還同時對卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素中的任一注射類藥物和氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星中的任一氟喹諾酮類藥物耐藥。

相關(guān)術(shù)語現(xiàn)在是20頁\一共有71頁\編輯于星期六第二章管理要求現(xiàn)在是21頁\一共有71頁\編輯于星期六第一節(jié)實驗室環(huán)境要求現(xiàn)在是22頁\一共有71頁\編輯于星期六結(jié)核分枝桿菌大量活菌操作如抗原提純、疫苗生產(chǎn)等須在符合生物安全三級（BSL-3）的環(huán)境中進行；結(jié)核樣本檢測，包括涂片、顯微鏡觀察、樣本的病原菌分離純化、免疫學(xué)實驗、PCR核酸提取等初步檢測活動，可以在符合生物安全二級（BSL-2）的環(huán)境中進行；藥物敏感性試驗、生化鑒定建議在有負壓的BSL-2環(huán)境條件下進行。

現(xiàn)在是23頁\一共有71頁\編輯于星期六第二節(jié)實驗室設(shè)備條件現(xiàn)在是24頁\一共有71頁\編輯于星期六實驗室硬件設(shè)置須包括但不限于：II級及以上生物安全柜、應(yīng)急沖淋裝置、顯微鏡、培養(yǎng)箱、冰箱、高壓滅菌器、帶生物安全罩杯的離心機等。各儀器設(shè)備要有使用記錄，并按相應(yīng)的要求定期校準維護?，F(xiàn)在是25頁\一共有71頁\編輯于星期六第三節(jié)人員要求現(xiàn)在是26頁\一共有71頁\編輯于星期六需具備檢驗專業(yè)資質(zhì)、經(jīng)過上級實驗室的結(jié)核分枝桿菌檢驗培訓(xùn)和生物安全培訓(xùn)并獲得培訓(xùn)證書方可。必須能夠正確使用生物安全柜等實驗設(shè)備并懂得其基本原理。應(yīng)清楚并遵循實驗室各項工作安全條例，并接受實驗室管理人員的監(jiān)督。應(yīng)收集實驗室工作人員的本底血清并至少進行胸部X線檢查，以后每一年復(fù)查一次，作好登記記錄。必要時，實驗室人員還應(yīng)接受適當?shù)摹嶒炇抑薪佑|或可能接觸病原的免疫接種或測試，并根據(jù)所接觸的病原定期進行復(fù)查?；加袊乐丶膊±缑庖呷毕莼蛎庖咭种频墓ぷ魅藛T不應(yīng)進入實驗室，未經(jīng)過培訓(xùn)且合格授權(quán)的實驗室人員不得進入實驗室?，F(xiàn)在是27頁\一共有71頁\編輯于星期六第四節(jié)生物安全要求現(xiàn)在是28頁\一共有71頁\編輯于星期六生物安全柜：實驗室須配備II級或以上生物安全柜。易產(chǎn)生氣溶膠的操作，如處理標本、涂片、動物實驗等，均應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進行。每次實驗后必須開啟紫外燈1-2小時對生物安全柜內(nèi)進行物理消毒。定期擦拭并檢查紫外燈的燈管，確保其有效的消毒效果。離心機：在離心感染性材料時，要把待檢物放在密封離心管內(nèi)，離心機在使用后須對其表面進行消毒。廢棄物的處理實驗室內(nèi)所有可能被污染的廢棄物品，如手套、實驗室隔離衣等，在丟棄或重新使用之前，必須經(jīng)過高壓滅菌或含氯消毒液等消毒。所有實驗用過的材料必須置于高壓蒸汽滅菌器內(nèi)，滅菌后方可丟棄?，F(xiàn)在是29頁\一共有71頁\編輯于星期六第五節(jié)質(zhì)量管理要求現(xiàn)在是30頁\一共有71頁\編輯于星期六一、室內(nèi)質(zhì)量控制-涂片鏡檢

每新進一批試劑及每次進行涂片染色檢查時，需同時染色、閱讀一張陽性及一張陰性涂片。涂片可預(yù)先準備，熱固定后不染色，4℃儲存于密閉的容器內(nèi)。用臨床標本離心沉淀制備的涂片質(zhì)控片最佳。如無臨床標本，也可使用戈登分枝桿菌制備陽性質(zhì)控片，大腸埃希菌制備陰性質(zhì)控片?，F(xiàn)在是31頁\一共有71頁\編輯于星期六定期記錄、審核涂片結(jié)果，出現(xiàn)下列情況時需要注意：指定病人人群的陽性及陰性涂片率升高；不同病人標本出現(xiàn)連續(xù)涂陽；涂陽標本無分枝桿菌生長涂陰標本固體培養(yǎng)基上分枝桿菌生長，2+或以上。室內(nèi)質(zhì)量控制-涂片鏡檢現(xiàn)在是32頁\一共有71頁\編輯于星期六實驗室要有成文的質(zhì)控程序，需記錄所有QC試驗的結(jié)果。失控時，應(yīng)有恰當?shù)募m正措施，并記錄結(jié)果。所有培養(yǎng)基和試劑需要記錄批號、有效期。購買的商品培養(yǎng)基，實驗室需保存供應(yīng)商提供的相應(yīng)培養(yǎng)基QC。實驗室可建立不同檢驗結(jié)果參數(shù)的正常平均值，定期監(jiān)測這些參數(shù)以控制實驗過程的質(zhì)量。

室內(nèi)質(zhì)量控制-培養(yǎng)現(xiàn)在是33頁\一共有71頁\編輯于星期六固體藥敏試驗：培養(yǎng)基質(zhì)量控制：需監(jiān)控培養(yǎng)基的外觀、顏色、質(zhì)地、凝固性、均質(zhì)性。含藥培養(yǎng)基無菌試驗，采用同一批次的不含藥培養(yǎng)基抽取5%進行無菌性測試。藥物純粉：藥敏試驗應(yīng)使用廠家提供的藥物標準粉或純粉，并從廠家獲得藥粉的效價和純度。含藥培養(yǎng)基保存：培養(yǎng)基應(yīng)在冷藏環(huán)境下置于密封袋內(nèi)保存，保存期空白培養(yǎng)基不超過2個月。異煙肼可室溫保存，鏈霉素、乙胺丁醇、卡那霉素、丁胺卡那應(yīng)冷藏保存，卷曲霉素和利福平應(yīng)冷凍保存。商業(yè)化液體藥敏試驗：遵循商家說明書進行。室內(nèi)質(zhì)量控制-藥敏試驗現(xiàn)在是34頁\一共有71頁\編輯于星期六二、室間質(zhì)量評估

結(jié)核病實驗室所有臨床服務(wù)項目每年應(yīng)當參加衛(wèi)生部、上海市臨床檢驗中心或上海市疾病預(yù)防控制中心組織的相關(guān)的能力驗證和/或室間質(zhì)評項目，且須符合要求，如無以上項目，可采用實驗室間比對來判定分析試驗的可靠性，每年至少兩次。痰涂片鏡檢結(jié)果質(zhì)量要求，涂片陰性符合率95%以上，涂片陽性符合率98%以上，總符合率96.5%以上?！?+”以上的陽性涂片不允許出現(xiàn)假陰性?，F(xiàn)在是35頁\一共有71頁\編輯于星期六第三章技術(shù)規(guī)范現(xiàn)在是36頁\一共有71頁\編輯于星期六第一節(jié)基本技術(shù)要求

該部分內(nèi)容系結(jié)核分枝桿菌檢驗基本技術(shù)，適用于非定點醫(yī)院結(jié)核檢測實驗室。現(xiàn)在是37頁\一共有71頁\編輯于星期六一、標本采集、運送及貯存

痰液：收集患者深部咳出痰置于無菌容器中（最小量3ml）。1h不能送檢，冷藏。血液：無菌方法采集10ml全血（成人最少量為5ml,兒童1ml）。不宜冷藏冷凍。體液：無菌方法采集10ml～15ml液體于無菌管中。液體量盡量多，不要用棉簽蘸取體液送檢。1h不能送檢，冷藏。膿液標本：1h不能送檢，冷藏。深部膿液：采用無菌方法，用注射器抽取膿液和/或采集組織。開放性損傷標本：應(yīng)盡可能從潰瘍基底部或邊緣部采集，無菌采集組織標本?，F(xiàn)在是38頁\一共有71頁\編輯于星期六二、病原學(xué)檢測方法現(xiàn)在是39頁\一共有71頁\編輯于星期六（一）涂片染色-樣本準備

一張載玻片上只能涂抹一份標本。每張載玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于涂片檢查。應(yīng)使用以95％乙醇擦拭（或浸泡）脫脂，經(jīng)干燥、清潔、無油污、無劃痕的新載玻片制備涂片，在載玻片一端有磨砂面上用鉛筆在上面直接書寫病人姓名、標本送檢日期、標本檢驗號。在生物安全柜中小心打開承載標本的容器，防止產(chǎn)生氣溶膠或標本外溢。現(xiàn)在是40頁\一共有71頁\編輯于星期六直接涂片法樣本準備

用折斷的竹簽茬端挑取痰標本的膿樣、干酪樣部分約50～100μl，于玻片正面的右側(cè)2/3中央處均勻涂抹成2cm×1cm橢圓、厚薄適度的涂片，置于烤片機上烘干，備染色用。涂片染色-樣本準備現(xiàn)在是41頁\一共有71頁\編輯于星期六離心沉淀法樣本準備高壓濃縮：將標本放入10ml耐高壓帶螺旋口的無菌管中，1:1加入生理鹽水。121℃高壓20分鐘。將標本管放入帶內(nèi)蓋的離心機中，3000g離心15分鐘后，取沉淀涂片。涂片都須放在生物安全柜中40±5℃烤片機上烘干固定，時間≥1小時。溶痰劑濃縮：將溶痰劑與痰液按約（1～3）：1的比例加入痰瓶中，竹簽打勻，至痰中黏液完全液化，濁度為1個麥氏單位左右。3000g，離心10min，棄去上清液，取沉淀物50-100μl制成2cm×1cm橢圓、厚薄適度的涂片，置于烤片機上烘干備用。涂片染色-樣本準備現(xiàn)在是42頁\一共有71頁\編輯于星期六萋尼抗酸染色程序（冷染）

加石碳酸復(fù)紅溶液，蓋滿痰膜，染色5分鐘或更久（不需加溫步驟，染色期間應(yīng)始終保持痰膜被染色液覆蓋，必要時可續(xù)加染色液）。水洗（之后盡可能將水分瀝干或以濾紙吸干）。加酸性酒精溶液，脫色2分鐘；如有必要，需流水洗去脫色液后，再次脫色至標本無可視紅色為止水洗。加亞甲基藍溶液染色30秒，水洗、干燥。鏡檢（300個視野）。一張合格的染色玻片，由于被亞甲蘭染色而呈亮藍色。將染色后的玻片放置在報紙上，如果透過痰膜不能分辨報紙上的文字，則表明該玻片過厚。（二）涂片染色-萋尼染色現(xiàn)在是43頁\一共有71頁\編輯于星期六萋尼抗酸染色程序（熱染）抗酸性桿菌胞壁含有類脂質(zhì)，一般不易著色，用強染劑（5%石炭酸復(fù)紅溶液）加溫或延長染色時間，可使其著色，并不易為鹽酸酒精所脫色，使菌體染成紅色。非抗酸菌易為鹽酸酒精脫色，再以美蘭復(fù)染使呈藍色，以此區(qū)分。涂片染色-萋尼染色現(xiàn)在是44頁\一共有71頁\編輯于星期六結(jié)果判讀抗酸桿菌陰性（-）連續(xù)300個不同視野未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌抗酸桿菌陽性（+）報告抗酸桿菌數(shù)：1-8條/300視野?？顾釛U菌陽性1＋：3-9條／100視野；抗酸桿菌陽性2＋：1-9條/10視野，連續(xù)100個視野；抗酸桿菌陽性3＋：1-9條/每個視野；抗酸桿菌陽性4＋：≥10條/每個視野。注：1）報告1+時至少觀察300個視野，報告2+至少觀察100個視野，3+、4+時至少觀察50個視野。

2）如果1－2條/300視野，建議再送一份樣本進行檢查。涂片染色-萋尼染色現(xiàn)在是45頁\一共有71頁\編輯于星期六質(zhì)量控制建議一名鏡檢人員每天的涂片閱讀量25張左右。采用自查和互查方式，至少抽查10%涂片，并填寫室內(nèi)質(zhì)控登記表。每次染色應(yīng)同時進行陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。涂片染色-萋尼染色現(xiàn)在是46頁\一共有71頁\編輯于星期六痰涂片的保存根據(jù)結(jié)核病細菌學(xué)實驗室登記本記錄，按照棄舊存新的原則，保存近期3個月的全部痰涂片待復(fù)檢。年涂片量不足500張的實驗室，必須保存全年的涂片待復(fù)檢。如果近3個月的涂片數(shù)超過1000張，可以按照棄舊存新的原則，保存近期1000張待抽查復(fù)檢。涂片染色-萋尼染色現(xiàn)在是47頁\一共有71頁\編輯于星期六涂片染色—熒光染色特點和原理熒光染色法將抗酸桿菌于黑色或暗紅色背景下染成橘黃色的菌體，較易于觀察。熒光染色的涂片應(yīng)于24小時內(nèi)鏡檢，否則熒光可能會消失。熒光染色陽性者需經(jīng)抗酸染色確認?，F(xiàn)在是48頁\一共有71頁\編輯于星期六操作步驟加入熒光染劑(auramineO或auramineO-rodamineB-phenol)，覆蓋整個涂片，靜置15分鐘（不必加濾紙和加熱）。以蒸餾水或去離子水沖洗（所用的水不可含氯，因為氯會干擾熒光的產(chǎn)生）。加入酸性酒精覆蓋整個涂片，脫色約兩分鐘，以水沖洗。加入高錳酸鉀溶液，覆蓋整個涂片復(fù)染約兩分鐘。時間不能過長，否則熒光會消失。沖凈，干燥。涂片染色—熒光染色現(xiàn)在是49頁\一共有71頁\編輯于星期六鏡檢與報告抗酸桿菌陰性（－）：連續(xù)觀察50個不同視野未見抗酸桿菌陰性（±）：連續(xù)觀察50個視野內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)1～3條，為可疑結(jié)果，報告實際條數(shù)。抗酸桿菌陽性（1＋）：10～99條／50個視野抗酸桿菌陽性（2＋）：1～9條／每個視野抗酸桿菌陽性（3＋）：10～99條／每個視野 抗酸桿菌陽性（4＋）：≥100條／每個視野涂片染色—熒光染色現(xiàn)在是50頁\一共有71頁\編輯于星期六質(zhì)量控制自查和互查：抽查復(fù)檢當日10%涂片，在抽查的流水號旁邊簽名。要求：不允許1+以上的陽性片出現(xiàn)假陰性。涂片脫落面積應(yīng)在10%以下。每次染一張抗酸染色陽性質(zhì)控片和陰性對照。涂片染色—熒光染色現(xiàn)在是51頁\一共有71頁\編輯于星期六（二）分枝桿菌培養(yǎng)-標本前處理NaOH-NALC法（N-乙酰-L半胱氨酸+NaOH）痰液和肺泡灌洗液取5-10ml標本到50ml帶有螺旋蓋的離心管內(nèi)。加等量的NaOH-NALC溶液，蓋緊蓋子后漩渦振蕩至液化。室溫靜置15-20分鐘，勿超過20分鐘，以防殺死分枝桿菌。添加PBS至50ml刻度線，蓋緊蓋子，顛倒混勻。離心3000g15分鐘。靜置5分鐘后把上清液倒至含有消毒劑的容器內(nèi)。添加1-2mlPBS，制備成混懸液。取適量混懸液進行接種及涂片檢查。處理后樣本中NaOH終濃度1%－1.5%。現(xiàn)在是52頁\一共有71頁\編輯于星期六分枝桿菌培養(yǎng)-標本前處理無菌體液腦脊液、胸腹水和關(guān)節(jié)液等體液標本都是無菌采集的，當采集的標本量較少，可以直接接種培養(yǎng)基；標本量>10ml時，以3000g的速度離心15分鐘后取沉淀物接種。如果標本存儲時間較長，應(yīng)對這些標本進行輕微去污處理。用5ml生理鹽水使沉淀物重新懸浮，然后按照與痰標本相同的程序進行去污處理。如果標本比較粘稠，在離心之前添加50mg的NALC，使標本液化?，F(xiàn)在是53頁\一共有71頁\編輯于星期六分枝桿菌培養(yǎng)-標本前處理胃液和尿液胃液標本由于pH值較低，如不能及時處理（標本采集后4小時內(nèi)），應(yīng)用NaOH溶液中和后儲存。對胃液和尿液標本離心集菌處理后，用5ml生理鹽水使沉淀物重新懸浮，然后按照與痰標本相同的程序進行去污處理?，F(xiàn)在是54頁\一共有71頁\編輯于星期六分枝桿菌培養(yǎng)-標本前處理糞便取適量成形糞便標本或1～5ml的液體標本于無菌離心管內(nèi)，加10毫升無菌生理鹽水，振蕩30秒，室溫靜置15分鐘，取7～8ml上清液到50毫升的離心管內(nèi)。隨后處理同痰標本。現(xiàn)在是55頁\一共有71頁\編輯于星期六分枝桿菌培養(yǎng)-標本前處理NaOH-NALC法標本前處理注意事項使用NaOH-NALC進行消化時，不要過度搖動試管。過度的振蕩將導(dǎo)致NALC被氧化，以致失效。如果標本中含有血液，則不能使用NaOH-NALC法，因為NALC在有血的環(huán)境中不起作用，應(yīng)使用NaOH方法。高速離心過程中溫度升高，直接影響分枝桿菌的活力，導(dǎo)致陽性率降低和檢測時間延長，建議使用低溫帶生物安全罩杯的離心機?，F(xiàn)在是56頁\一共有71頁\編輯于星期六分枝桿菌培養(yǎng)-標本前處理NaOH法取5-10ml痰或其他標本到50ml帶有螺旋蓋的離心管內(nèi)。添加等量的NaOH溶液，漩渦振蕩5-20秒。室溫靜置15-20分鐘。添加PBS至50ml刻度線，蓋緊蓋子，顛倒混勻。離心3000g15分鐘，建議使用低溫離心機。靜置5分鐘后把上清液倒至含有消毒劑的容器內(nèi)。沉淀物可接種酸性培養(yǎng)基。如接種中性培養(yǎng)基，需加幾滴酚紅，緩慢加入2NHCL溶液中和標本，混勻至出現(xiàn)持續(xù)黃色。添加1-2mlPBS，制備成混懸液，待用?，F(xiàn)在是57頁\一共有71頁\編輯于星期六（二）分枝桿菌培養(yǎng)-固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)基雞蛋為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基-羅氏培養(yǎng)基（LJ）是最常用的以雞蛋為基礎(chǔ)的固體培養(yǎng)基，是一種含孔雀綠的選擇性培養(yǎng)基，適合結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群生長，通常作為檢測和藥敏使用的培養(yǎng)基，一般是斜面培養(yǎng)基，接種面積較小，計數(shù)相對困難。羅氏培養(yǎng)基可分為中性羅氏和酸性羅氏培養(yǎng)基。瓊脂為基礎(chǔ)培養(yǎng)基-Middlebrook7H10瓊脂和Middlebrook7H11是最常用的瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基。Middlebrook7H11含有水解酪蛋白，適合需要復(fù)雜營養(yǎng)條件的及異煙肼耐藥的結(jié)核分枝桿菌生長。Middlebrook培養(yǎng)基一旦配制后不能直接暴露在光線下，須冷藏，保質(zhì)期為4-6周?，F(xiàn)在是58頁\一共有71頁\編輯于星期六分枝桿菌培養(yǎng)-固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)基的接種和培養(yǎng)LJ接種方法取3滴或0.2ml已經(jīng)處理的標本滴入LJ斜面，使標本均勻覆蓋LJ的斜面。接種后將LJ培養(yǎng)基傾斜放置并松開螺旋蓋1-2天，使標本溶液完全吸收，隨后蓋緊蓋子并豎直試管。LJ培養(yǎng)基在最初孵育的7-10天應(yīng)放置在5-10%的CO2孵育箱內(nèi)，隨后可以移入一般的溫箱內(nèi)繼續(xù)孵育。

現(xiàn)在是59頁\一共有71頁\編輯于星期六分枝桿菌培養(yǎng)-固體培養(yǎng)Middlebrook培養(yǎng)基接種法取3滴標本分別滴于平板表面，平板在室溫放置直到液體完全吸收用封口膜密封后放置在5-10%的CO2孵育箱內(nèi)。Middlebrook培養(yǎng)基接種后應(yīng)全程都放在CO2孵育箱內(nèi)。燭缸法因氧張力不能滿足分枝桿菌生長，所以不適合用?，F(xiàn)在是60頁\一共有71頁\編輯于星期六培養(yǎng)溫度結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的最佳生長條件是35℃-37℃。嗜血分枝桿菌、龜分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌需要有較低的生長溫度如25℃-33℃。如果皮膚、骨髓和關(guān)節(jié)活檢等標本高度懷疑有上述細菌，則應(yīng)接種2支培養(yǎng)基，一支放置在37℃，另一支放置在較低的溫度內(nèi)。蟾分枝桿菌要求較高的最適生長溫度（40℃-42℃）。分枝桿菌培養(yǎng)-固體培養(yǎng)現(xiàn)在是61頁\一共有71頁\編輯于星期六固體培養(yǎng)結(jié)果報告檢測時間所有的培養(yǎng)基在接種3天后開始查看快速生長的分枝桿菌和污染情況，至4周之前每周觀察2次，4周后每周1次。8周未見任何可疑菌落生長則報告陰性。對高度懷疑有潰瘍分枝桿菌（皮膚標本）和日內(nèi)瓦分枝桿菌感染的標本則需要延長培養(yǎng)時間至8-12周。分枝桿菌培養(yǎng)-固體培養(yǎng)現(xiàn)在是62頁\一共有71頁\編輯于星期六分枝桿菌培養(yǎng)-固體培養(yǎng)報告方式任何培養(yǎng)基上生長的菌落經(jīng)抗酸染色證實是抗酸桿菌，應(yīng)立即報告培養(yǎng)陽性，并按如下標準進行報告。現(xiàn)在是63頁\一共有71頁\編輯于星期六分枝桿菌培養(yǎng)-固體培養(yǎng)CLSI推薦的固體培養(yǎng)報告標準

菌落數(shù)

報告

無

無抗酸桿菌生長

<50

報實際數(shù)量50-100

1+100-200

2+200-500

3+>500

4+現(xiàn)在是64頁\一共有71頁\編輯于星期六分枝桿菌培養(yǎng)-固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)的質(zhì)量控制實驗室可通過一些實驗參數(shù)來監(jiān)測操作過程，經(jīng)過對實驗室3-6個月的數(shù)據(jù)進行分析，得到屬于本實驗室的參考數(shù)據(jù)。以下參數(shù)應(yīng)保持相對穩(wěn)定，如果出現(xiàn)顯著的變化或偏差，則所有的操作過程應(yīng)該重新審核。