分子腫瘤概論研究生課件學(xué)生

分子腫瘤概論研究生課件學(xué)生演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有76頁\編輯于星期五分子腫瘤概論研究生課件學(xué)生現(xiàn)在是2頁\一共有76頁\編輯于星期五

分子腫瘤概論一、有關(guān)腫瘤的基本概念（復(fù)習(xí)）腫瘤（tumor,neoplasm)

基因水平調(diào)控失常異常增生新生物腫瘤生物學(xué)行為浸潤、轉(zhuǎn)移能力

浸潤(invasion)：起源處遷移侵入周圍鄰近組織現(xiàn)在是3頁\一共有76頁\編輯于星期五轉(zhuǎn)移(metastasis)：從原發(fā)部位血管、淋巴管、體腔它處繼續(xù)生長與原發(fā)瘤同樣類型腫瘤（轉(zhuǎn)移瘤或繼發(fā)瘤）

現(xiàn)在是4頁\一共有76頁\編輯于星期五轉(zhuǎn)移的途徑現(xiàn)在是5頁\一共有76頁\編輯于星期五（2）Hematogenenousmetastasis

全身臟器（3）Transcoelomicmetastasis

體腔內(nèi)臟器脫落種植（醫(yī)源性種植）

浸潤生長惡性腫瘤生長的特點腫瘤轉(zhuǎn)移過程必經(jīng)的第一步現(xiàn)在是6頁\一共有76頁\編輯于星期五腫瘤的組織結(jié)構(gòu)

實質(zhì)

（parenchyma)間質(zhì)（mesenchyma,stroma)

腫瘤間質(zhì)的主要成分1.血管

小血管毛細(xì)血管血竇樣血管球樣

現(xiàn)在是7頁\一共有76頁\編輯于星期五新的腫瘤血供模式血管生成擬態(tài)(vasculogenicmimicry，VM)1999年，美國學(xué)者M(jìn)aniotis等一種完全不同于經(jīng)典血管生成的微循環(huán)模式小管狀（似血管）管壁主要由基底膜(PAS陽性)圍成，外襯以腫瘤細(xì)胞腔內(nèi)有血漿和紅細(xì)胞流動管道與內(nèi)皮性血管相通多存在于高度惡性腫瘤現(xiàn)在是8頁\一共有76頁\編輯于星期五血管生成擬態(tài)（vasculogenicmimicry）腫瘤細(xì)胞構(gòu)成有基底膜小管狀（似血管）與血管交通現(xiàn)在是9頁\一共有76頁\編輯于星期五2.結(jié)締組織間質(zhì)

（1）纖維和基質(zhì)

膠原纖維

常規(guī)

HE

紅

特殊化學(xué)染色

VG

改良法

紅

Masson

蘭色

構(gòu)成成分

IIIIII型膠原原纖維又由相應(yīng)原纖維分子構(gòu)成

免疫組化或分子生物學(xué)方法可區(qū)別現(xiàn)在是10頁\一共有76頁\編輯于星期五現(xiàn)在是11頁\一共有76頁\編輯于星期五彈力纖維

常規(guī)

HE淡紅色

特殊化學(xué)染色

Weigert或Verhceff暗蘭或黑色，彈力酶消化后陰性

現(xiàn)在是12頁\一共有76頁\編輯于星期五網(wǎng)狀纖維

銀染黑色，故也稱嗜銀纖維。

PAS強(qiáng)陽性

現(xiàn)在是13頁\一共有76頁\編輯于星期五成分

膠原蛋白為主要成分細(xì)胞間質(zhì)網(wǎng)狀纖維

Ⅲ型膠原蛋白基底膜網(wǎng)狀纖維Ⅳ型膠原蛋白和層黏連蛋白（laminin）現(xiàn)在是14頁\一共有76頁\編輯于星期五纖維黏連蛋白

Fibronectin（FN）

作用

A.

連接基質(zhì)中各種成分

B.

介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)成分與細(xì)胞表面連接黏蛋白

又稱蛋白多糖（proteoglycan）

如透明質(zhì)酸，硫酸肝素等

骨黏素

（osteonectin）

現(xiàn)在是15頁\一共有76頁\編輯于星期五（2）基底膜

(basementmembrane,BM)

多種成分與疾?。[瘤浸潤）關(guān)系密切

Ⅳ型膠原

不形成纖維，與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原不同

層黏連蛋白

（laminin,LM）

有與細(xì)胞膜LM受體相結(jié)合的位點現(xiàn)在是16頁\一共有76頁\編輯于星期五

（3）細(xì)胞成分固有的細(xì)胞成分

纖維母細(xì)胞和纖維細(xì)胞肌纖維母細(xì)胞間充質(zhì)細(xì)胞巨噬細(xì)胞樹突狀細(xì)胞

現(xiàn)在是17頁\一共有76頁\編輯于星期五反應(yīng)性細(xì)胞成分

各種細(xì)胞浸潤

淋巴細(xì)胞最常見

漿細(xì)胞

巨噬細(xì)胞都屬免疫活性細(xì)胞

現(xiàn)在是18頁\一共有76頁\編輯于星期五二、腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制（一）腫瘤細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移

1.腫瘤細(xì)胞增殖和擴(kuò)展

浸潤轉(zhuǎn)移的前提和基礎(chǔ)

2.腫瘤血管生成(tumorangiogenesis)

腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的必要條件現(xiàn)在是19頁\一共有76頁\編輯于星期五3.腫瘤細(xì)胞分離脫落，與細(xì)胞外基質(zhì)黏附

（1）瘤細(xì)胞表面負(fù)電荷增加（2）瘤細(xì)胞黏附力的改變

①瘤細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)異常②瘤細(xì)胞同質(zhì)黏附力下降

指同種瘤細(xì)胞之間的黏附力現(xiàn)在是20頁\一共有76頁\編輯于星期五③瘤細(xì)胞異質(zhì)黏附力增加指腫瘤細(xì)胞與其它不同細(xì)胞及間質(zhì)的黏附力同質(zhì)黏附力降低，有利于腫瘤細(xì)胞分離；異質(zhì)黏附力的增加，有利于瘤細(xì)胞與基底膜、間質(zhì)成分粘附并穿過這些組織均由黏附分子介導(dǎo)通過配-受體之間的識別和結(jié)合實現(xiàn)現(xiàn)在是21頁\一共有76頁\編輯于星期五

（3）腫瘤黏附分子(adhesionmolecules)

細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)

①鈣黏蛋白(cadherin)

又稱為鈣連接素，鈣黏素。

依賴細(xì)胞外鈣介導(dǎo)鈣離子依賴性細(xì)胞與細(xì)胞（同源細(xì)胞）的黏附據(jù)分布不同

E-鈣黏蛋白

P-鈣黏蛋白

N-鈣黏蛋白H-cad現(xiàn)在是22頁\一共有76頁\編輯于星期五

②整合素(integrin)細(xì)胞表面糖蛋白，約有20多個亞型各種腫瘤細(xì)胞表面整合素種類不同腫瘤生長各個階段表達(dá)水平也不同

作用

a.介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附

b.參與不同細(xì)胞之間的黏附連接

C.扮演細(xì)胞信號傳遞的角色配體-整合素-細(xì)胞骨架蛋白跨膜信息傳導(dǎo)系統(tǒng)現(xiàn)在是23頁\一共有76頁\編輯于星期五③免疫球蛋白超基因家族(immunoglobulinsuperfamily)

主要參與細(xì)胞與細(xì)胞間的連接

ICAM-1（細(xì)胞間黏附分子-1）

VCAM-1（血管黏附因子）

NCAM（神經(jīng)細(xì)胞黏附因子）其它包括CEA、DCC現(xiàn)在是24頁\一共有76頁\編輯于星期五④選擇素(selectin)

內(nèi)源性植物凝血素（凝集素）

作用介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、血小板與瘤細(xì)胞黏附

選擇素家族包括：

P-selectinE-selectinL-selectin現(xiàn)在是25頁\一共有76頁\編輯于星期五⑤CD44及其它

CD44(透明質(zhì)酸受體)

介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附路易斯寡糖（SLEX，,s-LewisX

）

血管內(nèi)皮細(xì)胞E-選擇素的配體

現(xiàn)在是26頁\一共有76頁\編輯于星期五4.瘤細(xì)胞的遷移(migration)及化學(xué)趨向性

(1)瘤細(xì)胞的運動

黏附；肌動蛋白、微管、中間絲

(2)瘤細(xì)胞運動的調(diào)節(jié)現(xiàn)在是27頁\一共有76頁\編輯于星期五據(jù)其作用，大致可分為兩大類：僅影響運動的因子遷移刺激因子（MSF）既影響運動又影響生長的因子

AMF(自分泌運動因子)HGF/SF（肝細(xì)胞生長因子/分散因子)

現(xiàn)在是28頁\一共有76頁\編輯于星期五(3)瘤細(xì)胞的化學(xué)趨向性

21KD的蛋白質(zhì)骨吸收因子

現(xiàn)在是29頁\一共有76頁\編輯于星期五5.細(xì)胞外基質(zhì)的降解(1)腫瘤浸潤細(xì)胞外基質(zhì)的步驟

Liotta1986年提出第一步黏附于基底膜或其他間質(zhì)成分第二步分泌蛋白酶并激活,降解瘤細(xì)胞鄰近的細(xì)胞外基質(zhì)第三步進(jìn)入受蛋白酶降解的基質(zhì)區(qū)域內(nèi)

現(xiàn)在是30頁\一共有76頁\編輯于星期五(2)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白水解酶①絲氨酸蛋白酶類及其抑制因子纖維蛋白溶解酶(纖溶酶)

纖溶酶原

a.降解基質(zhì)如纖維蛋白，F(xiàn)N,LM,蛋白多糖

b.激活膠原酶膠原降解現(xiàn)在是31頁\一共有76頁\編輯于星期五尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-typeplasminogenactivator,u-PA）系統(tǒng)

A．u-PA：

介導(dǎo)細(xì)胞周圍基質(zhì)蛋白的降解B．u-PA受體（u-PAR）及纖溶酶原受體

活化u-PA原酶形式的u-PA纖溶酶原+纖溶酶原受體纖溶酶現(xiàn)在是32頁\一共有76頁\編輯于星期五C．PAI（PA抑制劑）

PAI1

是u-PA的主要抑制劑

PAI2

不同腫瘤表達(dá)意義不一

PAI3功能不清現(xiàn)在是33頁\一共有76頁\編輯于星期五②基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMP）及其抑制因子需鈣、鋅離子作輔助因子

MMP分類

膠原酶：如間質(zhì)膠原酶（Collagenase）明膠酶：如明膠酶A(gelatinaseA)

間質(zhì)溶素：如間質(zhì)溶素1、2

膜型基質(zhì)金屬蛋白酶：Ⅰ、Ⅱ型現(xiàn)在是34頁\一共有76頁\編輯于星期五可分別降解ECM中各種不同成分

ECM降解的主要蛋白水解酶類金屬蛋白酶抑制物

TIMP-1，TIMP-2

浸潤與否取決于MMP與TIMP的對比

MMP>>TIMPECM降解才能成為可能現(xiàn)在是35頁\一共有76頁\編輯于星期五③胱氨酸蛋白酶類

CathepsinB作用

降解ECM中各種膠原、LM、FN、黏蛋白激活間質(zhì)膠原酶和IV型膠原酶④天（門）冬氨酸蛋白酶

cathepsinD,E

在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中的作用

CD表達(dá)的調(diào)節(jié)現(xiàn)在是36頁\一共有76頁\編輯于星期五6.瘤細(xì)胞以主動方式入循環(huán)管道并形成栓子

微小淋巴管、微小靜脈壁縫隙血管基底膜缺損瘤細(xì)胞存在形式

單個成團(tuán)同類癌栓異類癌栓黏附分子對其發(fā)揮調(diào)節(jié)作用

現(xiàn)在是37頁\一共有76頁\編輯于星期五7.在特定器官的毛細(xì)血管滯留并黏著，再次穿過血管壁并定居、增殖

器官特異性（選擇性）機(jī)制

(1)黏附分子的作用

(2)化學(xué)趨化因子（歸巢現(xiàn)象)(3)微環(huán)境不適合

(4)與免疫狀態(tài)有關(guān)現(xiàn)在是38頁\一共有76頁\編輯于星期五

（二）機(jī)體免疫狀態(tài)與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移參與控制轉(zhuǎn)移的免疫細(xì)胞主要有

NK細(xì)胞巨噬細(xì)胞

T淋巴細(xì)胞（三）腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因轉(zhuǎn)移相關(guān)基因指基因的表達(dá)和改變能夠促進(jìn)或?qū)е履[瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的基因

現(xiàn)在是39頁\一共有76頁\編輯于星期五（四）腫瘤表觀遺傳改變與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移表觀遺傳學(xué)(Epigenetics)與遺傳學(xué)(genetic)相對應(yīng)的概念表型狀態(tài)改變，基因型不改變沒有DNA序列變化的情況下，可遺傳的基因表達(dá)改變，導(dǎo)致的基因產(chǎn)物的變化。

1942年提出，上世紀(jì)80年代后期逐漸興起的一門新學(xué)科

現(xiàn)在是40頁\一共有76頁\編輯于星期五DNA的“后天性”修飾

CpG島高甲基化癌細(xì)胞基因組低甲基化組蛋白殘基的各種修飾磷酸化乙?；谆核鼗鹊痊F(xiàn)在是41頁\一共有76頁\編輯于星期五（五）腫瘤干細(xì)胞(tumorstemcell,TSC)

2001年由Reya等提出

2006年美國癌癥研究協(xié)會（AACR）定義

存在于腫瘤組織中具有無限自我更新能力并能產(chǎn)生不同分化程度的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞

現(xiàn)在是42頁\一共有76頁\編輯于星期五

特征

(1)無限增殖和多向分化

(2)存在自我更新的信號傳導(dǎo)途徑

(3)具不同表型，異質(zhì)性，對放化療不敏感

(4)具有端粒酶活性

(5)能轉(zhuǎn)移到各種不同的組織現(xiàn)在是43頁\一共有76頁\編輯于星期五（六）腫瘤微環(huán)境與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)間質(zhì)細(xì)胞所分泌的活性介質(zhì)（細(xì)胞因子）共同構(gòu)成的局部內(nèi)環(huán)境

現(xiàn)在是44頁\一共有76頁\編輯于星期五微環(huán)境改變腫瘤細(xì)胞自分泌和旁分泌全身和局部組織代謝、分泌、免疫結(jié)果：限制或促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展現(xiàn)在是45頁\一共有76頁\編輯于星期五

現(xiàn)在是46頁\一共有76頁\編輯于星期五三.腫瘤學(xué)研究中常用的分子生物學(xué)基本技術(shù)及其應(yīng)用(一)蛋白表達(dá)異常的檢測免疫組化（熒光）定位ELISA和Westernblot、流式細(xì)胞術(shù)定量

抗體標(biāo)記抗原標(biāo)記抗體細(xì)胞細(xì)胞抗體標(biāo)記抗原標(biāo)記細(xì)胞現(xiàn)在是47頁\一共有76頁\編輯于星期五（二）蛋白質(zhì)相互作用的檢測方法1.酵母雙雜交法驗證兩個已知蛋白的相互作用篩選與已知蛋白作用的未知蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法，現(xiàn)在是48頁\一共有76頁\編輯于星期五酵母雙雜交的原理是將2個目的蛋白分別與轉(zhuǎn)錄激活區(qū)（transcriptionactivationdomain，AD）和DNA結(jié)合區(qū)（DNA-bindingdomain，DBD）融合產(chǎn)生新的融合蛋白，如果這2個目的蛋白能夠互相作用，則該相互作用會促使AD和DBD互相靠近而產(chǎn)生有活性的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而激活事先構(gòu)建到酵母基因組中的報告基因的轉(zhuǎn)錄。（真核轉(zhuǎn)錄因子DBD能把蛋白定位到基因組特定DNA序列上，AD能夠使轉(zhuǎn)錄裝置激活基因轉(zhuǎn)錄。當(dāng)這兩個區(qū)域單獨存在時均沒有轉(zhuǎn)錄激活功能，但當(dāng)它們在空間上彼此聯(lián)系時，則能夠激活基因轉(zhuǎn)錄。）

現(xiàn)在是49頁\一共有76頁\編輯于星期五局限性⑴雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi)⑵酵母雙雜交系統(tǒng)的一個重要的問題是“假陽性”現(xiàn)在是50頁\一共有76頁\編輯于星期五2.免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的常用、經(jīng)典方法。其基本原理是:細(xì)胞裂解液中加入抗體，與抗原形成特異免疫復(fù)合物，經(jīng)過洗脫，收集免疫復(fù)合物，然后進(jìn)行SDS及Westernblotting分析。

現(xiàn)在是51頁\一共有76頁\編輯于星期五缺點免疫沉淀蛋白有可能不是直接相互作用的蛋白，而是通過第三者間接相互作用的蛋白靈敏度不及蛋白親和色譜高必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，若預(yù)測不正確，實驗就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險性假陽性的概率比較高現(xiàn)在是52頁\一共有76頁\編輯于星期五設(shè)置的對照包括：在對照組中使用對照抗體，以缺失目的蛋白的細(xì)胞系作為陰性對照等等。現(xiàn)在是53頁\一共有76頁\編輯于星期五3.GST沉淀實驗（GST-pulldown實驗）主要是用來證明細(xì)胞外蛋白質(zhì)相互作用利用GST(Glutathione-S-transferase，

GST)和谷胱甘肽親和樹脂之間的高親和性將GST固化在樹脂上GST和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶蛋白在細(xì)菌、動物細(xì)胞等體系中融合表達(dá)固化的誘餌蛋白【即誘餌蛋白(Baitprotein)】可以捕獲細(xì)胞裂解物中的互作用靶蛋白洗脫結(jié)合物后通過westernblot檢測誘餌蛋白和靶蛋白,從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白

現(xiàn)在是54頁\一共有76頁\編輯于星期五現(xiàn)在是55頁\一共有76頁\編輯于星期五4.Far-Westernblotting在經(jīng)典Far-Western印跡中，運用經(jīng)標(biāo)記的或可被抗體檢測的“誘餌”蛋白檢測轉(zhuǎn)移膜上的“獵物”靶蛋白。用SDS或非變性PAGE分離含有未知靶蛋白的樣品（通常為細(xì)菌裂解液）然后轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后與已知誘餌蛋白孵育，運用該誘餌蛋白的特異性檢測系統(tǒng)檢測。（出相應(yīng)條帶+）5.生物信息學(xué)現(xiàn)在是56頁\一共有76頁\編輯于星期五（三）基因拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA異常

核酸分子生物學(xué)方法進(jìn)行檢測核酸變性、復(fù)性基本性質(zhì)常用方法

現(xiàn)在是57頁\一共有76頁\編輯于星期五1.核酸分子雜交（nucleicacidmolecularhybridisation）技術(shù)最常用的基本技術(shù)基本原理：

--標(biāo)記的已知堿基序列（DNA或RNA單鏈片段）（探針probe

）

（同位素P32I125非同位素生物素地高辛熒光素）

--檢測靶核酸（待測核酸）中是否存在與之同源的序列現(xiàn)在是58頁\一共有76頁\編輯于星期五（1）原位雜交（ISH）（2）熒光原位雜交（FISH），（3）雙色（多色）銀染原位雜交（DSISH）（4）Southernblot(DNA雜交)（5）Northernblot(RNA雜交)現(xiàn)在是59頁\一共有76頁\編輯于星期五現(xiàn)在是60頁\一共有76頁\編輯于星期五2.聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）技術(shù)又稱體外基因擴(kuò)增利用DNA變性和復(fù)性原理體外進(jìn)行特定的DNA片段高效擴(kuò)增獲得或放大特異基因信號的重要手段現(xiàn)在是61頁\一共有76頁\編輯于星期五擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測凝膠電泳分析瓊脂糖凝膠電泳(最常用)

聚丙烯酰胺凝膠電泳單一條帶現(xiàn)在是62頁\一共有76頁\編輯于星期五

Real-timePCRRT-PCR3.基因芯片技術(shù)現(xiàn)在是63頁\一共有76頁\編輯于星期五(四)基因突變的檢測方法1.聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（Singlestrandconformationpolymorphismanalysisofpolymerasechainreactionproducts,PCR-SSCP）長度相同，構(gòu)象不同在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳遷移率（泳動率）不同堿基序列不同的單鏈DNA構(gòu)像改變現(xiàn)在是64頁\一共有76頁\編輯于星期五基本方法

作PCR

將產(chǎn)物變性而成為單鏈進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示結(jié)果可用同位素/熒光素標(biāo)記非同位素標(biāo)記

現(xiàn)在是65頁\一共有76頁\編輯于星期五2.PCR-限制性片段長度多態(tài)性（restrectionfragmentlengthpolymorphisms,RFLP）分析技術(shù)基本原理

--序列中一個堿基發(fā)生改變--使原來的內(nèi)切酶位點消失或產(chǎn)生新的酶切位點--用限制性內(nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增出來的DNA片段

--檢測其酶切片段長度的差異現(xiàn)在是66頁\一共有76頁\編輯于星期五3.變性梯度凝膠電泳法（denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)基本原理

電泳時，不同濃度凝膠溫度不同

DNA鏈中有一個堿基改變在不同的溫度發(fā)生解鏈電泳遷移率改變

現(xiàn)在是67頁\一共有76頁\編輯于星期五

4.DNA序列分析（DNAsequencing

）

5.熒光原位雜交(FISH)6．DNA芯片技術(shù)（DNAchip

）現(xiàn)在是68頁\一共有76頁\編輯于星期五（五）腫瘤的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性分析微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatelliteinstability,MI）,是指簡單重復(fù)序列的增加或丟失

PCR+DNA序列凝膠電泳（六）腫瘤易感性檢測

采用相應(yīng)基因變異方法進(jìn)行檢測（七）腫瘤相關(guān)病毒

核酸雜交技術(shù)與PCR技術(shù)

(八)

基因重組技術(shù)

主要目的是獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝

(九)基因轉(zhuǎn)染（genetransfection）技術(shù)（十）RNA干涉(RNAin