分子診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用課件

（優(yōu)選）分子診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用課件現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五

狹義的分子診斷是基于核酸的診斷技術(shù)，是通過(guò)對(duì)DNA或RNA的檢測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的檢測(cè)和診斷。但是，隨著第一張人類基因組測(cè)序圖的完成，以及由此而帶來(lái)的基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝物組學(xué)等新興學(xué)科的發(fā)展，分子診斷的內(nèi)涵已經(jīng)從單純的DNA/RNA拷貝、突變等變化的檢測(cè)，拓展到核酸與DNA片段、蛋白與多肽、抗原與抗體、受體與配體等生物大分子的檢測(cè)，并廣泛應(yīng)用于疾病的篩查、診斷、治療監(jiān)測(cè)、預(yù)后與預(yù)防等生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。一、分子診斷的概念現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五根據(jù)分子診斷技術(shù)特征劃分為三類：一、基于分子雜交為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)兩條同源核酸分子（DNA或RNA）可以在堿基互補(bǔ)的原則下形成異質(zhì)雙鏈?zhǔn)沁z傳物質(zhì)最重要的化學(xué)特征，這一過(guò)程亦被稱為分子雜交。分子雜交是所有分子生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)，從最初的印跡雜交到聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），從基因芯片再到高通量的DNA測(cè)序技術(shù)，都離不開(kāi)堿基互補(bǔ)的分子雜交反應(yīng)?，F(xiàn)在是3頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五二、基于測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)DNA的序列分析是分子診斷學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)，各種遺傳疾病，病毒或細(xì)菌的感染與變異，在基因表達(dá)水平上的個(gè)性化用藥，多基因疾病的診斷與預(yù)測(cè)，最終都可以借助基因測(cè)序平臺(tái)的應(yīng)用?，F(xiàn)在是4頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五三、基于擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)1983年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerasechainreaction，PCR），使體外擴(kuò)增DNA成為可能，開(kāi)啟了體外擴(kuò)增和操作DNA或RNA技術(shù)的發(fā)展。到現(xiàn)在，擴(kuò)增DNA的技術(shù)已經(jīng)成為分子診斷應(yīng)用最廣的技術(shù)之一，并發(fā)展變化了數(shù)十種核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)?，F(xiàn)在是5頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五二、PCR概述（一）PCR概念PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈反應(yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。是一項(xiàng)體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA?，F(xiàn)在是6頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五

PCR技術(shù)能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍，使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定。二、PCR概述現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國(guó)內(nèi)全面展開(kāi)1998年熒光定量PCR技術(shù)開(kāi)始在中國(guó)應(yīng)用于臨床檢測(cè)PCR發(fā)展簡(jiǎn)史1983

Mullis于12月16日成功發(fā)明了PCR1985關(guān)于PCR的文章首次由Mullis及其同事等人在《Science》雜志上發(fā)表198912月《Science》雜志將PCR和它所使用的TaqDNA聚合酶命名為第一個(gè)“年度分子”。199310月13日Mullis獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

1995熒光定量PCR技術(shù)出現(xiàn)現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五PCR技術(shù)PCR核心技術(shù)是從水棲高溫菌中分離到能耐高溫的Taq酶，使擴(kuò)增反應(yīng)不需要每一個(gè)循環(huán)加一次DNA聚合酶，從而實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化，使應(yīng)用領(lǐng)域迅速擴(kuò)大，PCR技術(shù)成為了分子生物學(xué)中的一項(xiàng)突破性技術(shù)?，F(xiàn)在是9頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五PCR概述——2000至2013年發(fā)表論文1280748篇現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五二、PCR概述（二）原理雙鏈DNA變性

退火

延伸

（膜板）

（雙鏈分成單鏈）

（膜板與引物雜交）

（DNA合成）不斷重復(fù)PCR循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)量關(guān)系現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五高靈敏度高特異性簡(jiǎn)便快捷高效擴(kuò)增、忠實(shí)復(fù)制！PCR反應(yīng)的特點(diǎn)現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五三、熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因檢測(cè)性病相關(guān)病原體（CT、NG、UU、HPV、HIV）的基因檢測(cè)優(yōu)生優(yōu)育項(xiàng)目診斷：人巨細(xì)胞病毒（HCMV）、單純皰疹病毒（HSV）、弓形蟲(chóng)（TOX）、風(fēng)疹病毒（RUB）其它病原體檢測(cè)：結(jié)核桿菌、肺炎支原體、EB病毒、傷寒桿菌、幽門螺旋桿菌等一病原體檢測(cè)現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五常規(guī)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法及不足1.痰涂片作抗酸染色：陽(yáng)性率低、費(fèi)時(shí)2.細(xì)胞培養(yǎng)“金標(biāo)準(zhǔn)”：周期太長(zhǎng)(4-8W)3.血清學(xué)診斷：

a.接種BCG可出現(xiàn)陽(yáng)性

b.不能區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和治愈后留下?lián)p傷灶的病人

c.交叉反應(yīng)，假陽(yáng)性不能早期診斷！容易漏診、誤診！現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五熒光定量PCR檢測(cè)TB-DNA的意義1.能穩(wěn)定檢測(cè)10copy的TB-DNA，靈敏度高，特異性強(qiáng)2.早期、快速、準(zhǔn)確地診斷結(jié)核病。痰液、肺及支氣管灌洗液——肺結(jié)核血液——播散性結(jié)核和各臟器的結(jié)核病腦脊液——中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病宮頸拭子、尿道拭子——泌尿生殖道結(jié)核病現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五3.熒光定量PCR檢出結(jié)核桿菌陽(yáng)性率顯著高于痰涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)法。

4.TB-DNA濃度可用于判斷療效：痰標(biāo)本中結(jié)核桿菌的數(shù)量呈逐漸下降趨勢(shì)，TB-DNA拷貝數(shù)下降。根據(jù)病原體DNA濃度，對(duì)藥物治療及療效觀察提供參考依據(jù)熒光定量PCR檢測(cè)TB-DNA的意義現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五二腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)：1、包括癌基因、抗癌基因2、腫瘤轉(zhuǎn)移基因3、轉(zhuǎn)移抑制基因三、熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五三遺傳病1、等位基因檢測(cè)2、多基因遺傳病的突變檢測(cè)3、基因表達(dá)異常所致遺傳病檢測(cè)三、熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五四其它應(yīng)用1.法醫(yī)學(xué)鑒定2.抗病毒藥物療效的觀察、指導(dǎo)3.縮短診斷的窗口期三、熒光定量PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五窗口期：所謂“窗口期”,是指從感染病原體開(kāi)始,直至用某種檢測(cè)方法能夠檢測(cè)到該病原體存在為止的這一段時(shí)間。美國(guó)90％以上輸血傳播HIV和HBV以及75％以上輸血HCV的危險(xiǎn)性均來(lái)自“窗口期”感染獻(xiàn)血。現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五

提供直接證據(jù)縮短“窗口期”PCR檢測(cè)的臨床意義項(xiàng)目ELISA窗口期項(xiàng)目NAT窗口期HBsAg50HBV20-25抗-HCV70HCV10-14抗-HIV15HIV10現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五RNA+Ab-P24+Ab-血清陽(yáng)轉(zhuǎn)后的方法RNAp24Ab血清陽(yáng)轉(zhuǎn)抗體檢測(cè)臨界值

特異性抗體比例時(shí)間反應(yīng)指標(biāo)感染

血清陽(yáng)轉(zhuǎn)前的方法怎樣檢測(cè)HIV早期感染?現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五

嬰幼兒感染HIV診斷：12月內(nèi)核酸檢測(cè)，13-17月先抗體，陽(yáng)性者檢測(cè)核酸，18個(gè)月以上抗體檢測(cè)現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五四、PCR檢測(cè)的標(biāo)本采集要求

項(xiàng)目標(biāo)本采集所需容器CT男性：尿道分泌物：細(xì)小棉拭子伸入尿道約2～4厘米，旋轉(zhuǎn)數(shù)圈取出分泌物（應(yīng)略帶粘膜），前列腺液、精液。女性：陰道分泌物：用無(wú)菌生理鹽水洗去宮頸外分泌物，再用無(wú)菌棉拭子插入宮頸內(nèi)，停5秒后旋動(dòng)棉拭子采取分泌物。尿道分泌物：同上一次性無(wú)菌帶蓋的試管。NGUUTPHPVHSV現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五項(xiàng)目標(biāo)本采集HBV無(wú)菌注射器抽取2毫升靜脈血或其它體液注入無(wú)菌試管或抗凝管。HCVEB1.鼻咽拭子或體液標(biāo)本。2.也可取抗凝血標(biāo)本,但一般不推薦。CMV1.尿液：中段晨尿20ml于加蓋試管。其他體液標(biāo)本或咽拭子。也可取抗凝血標(biāo)本,但一般不推薦。TB1.痰液：患者深部咳痰1～3ml于無(wú)菌加蓋試管。2.其他組織標(biāo)本：留于無(wú)菌試管。3.也可取抗凝血標(biāo)本,但需分離單個(gè)核細(xì)胞檢測(cè)，陽(yáng)性率才會(huì)高。（于發(fā)熱時(shí)抽?。㎝P

咽拭子現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五五、NAT（核酸檢測(cè)）技術(shù)類型：現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（SAT）實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（SAT）是將核酸恒溫?cái)U(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)相結(jié)合的一種新型核酸檢測(cè)技術(shù)。國(guó)內(nèi)公司（上海仁度生物科技有限公司）自主研發(fā)，擁有一整套自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)和核心技術(shù)?，F(xiàn)在是27頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五（SAT）技術(shù)原理：

同一溫度下（42℃），以RNA為起始模板，通過(guò)M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生一個(gè)雙鏈DNA拷貝，然后利用T7RNA多聚酶從DNA拷貝上產(chǎn)生多個(gè)（100～1000個(gè)）RNA拷貝；每一個(gè)RNA拷貝再?gòu)姆崔D(zhuǎn)錄開(kāi)始進(jìn)入下一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；同時(shí)，帶有熒光標(biāo)記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。該熒光信號(hào)可由熒光檢測(cè)儀器實(shí)時(shí)捕獲，直觀反映擴(kuò)增循環(huán)情況?，F(xiàn)在是28頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五SAT檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)：檢測(cè)靶標(biāo)：RNA靈敏度高，特異性強(qiáng)，易鑒別死菌、活菌，適合臨床判愈;擴(kuò)增產(chǎn)物：RNA高效擴(kuò)增，低污染;核酸提取：磁珠法提取純度高結(jié)果準(zhǔn)確;檢測(cè)方法：實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，擴(kuò)增、檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行全程監(jiān)控;擴(kuò)增方式：42℃恒溫?zé)o需熱循環(huán)，設(shè)備成本低?，F(xiàn)在是29頁(yè)\一共有32頁(yè)\編輯于星期五總結(jié)

分子診斷技術(shù)經(jīng)歷近30年的快速發(fā)展，已經(jīng)形成了主要以雜交、測(cè)序和擴(kuò)增三種反應(yīng)模式為主的測(cè)試技術(shù)群，并且在臨床診斷中獲得了廣泛的應(yīng)用。原位雜交為主的技術(shù)對(duì)于檢測(cè)基因表達(dá)異常的遺傳性疾病具有明顯的優(yōu)勢(shì)，已成為細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室最有力的檢測(cè)工具之一。而全基因組測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，使得高通量的測(cè)序方式來(lái)檢測(cè)全基因的表達(dá)差異或突變檢測(cè)的成本均大大降低，而且測(cè)試速度將逐漸適合臨床的需求，因此對(duì)于大量基因的表達(dá)和突變檢測(cè)，高通量測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)將會(huì)越趨明顯。另一方面，RT-PCR、STA等PCR技術(shù)對(duì)于感染性疾病、低突變位點(diǎn)或變異的檢測(cè)，在成本上明顯優(yōu)于前兩者，因此PCR技術(shù)可能在臨床上擁有更好的應(yīng)用空間。不同的技術(shù)平臺(tái)有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，我們要針對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本對(duì)象及需求,選擇適合的技術(shù)方法，力求在“高效,高質(zhì)量,低成本”這三者間找到合適的