抗腫瘤藥物研究與新藥篩選

提綱?化療藥物的發(fā)展?腫瘤的藥物治療?抗腫瘤新藥的發(fā)現(xiàn)和治療靶點(diǎn)?抗腫瘤藥物篩選及評價第一頁，共76頁。化療藥物的發(fā)展近代腫瘤化療學(xué)始于20世紀(jì)40年代。50年代通過動物篩選化療藥物發(fā)現(xiàn)了5FU、MTX、CTX等，化療學(xué)有了發(fā)展。60年代認(rèn)識到腫瘤細(xì)胞動力學(xué)及化療藥藥代動力學(xué)的重要性。大部分目前所用的抗癌藥已發(fā)現(xiàn)，有急淋、HD、睪丸癌等可化療治愈。第二頁，共76頁。70年代形成腫瘤內(nèi)科學(xué)，更多腫瘤有了比較成熟的化療方案。80年代研究以生物反應(yīng)修飾劑等藥物來提高化療療效，探索抗藥性產(chǎn)生的原因，5%腫瘤患者可治愈。90年代新抗癌藥進(jìn)入臨床，多藥耐藥基因發(fā)現(xiàn)，生物治療，基因治療輔助治療改善等，療效進(jìn)一步提高。第三頁，共76頁。第四頁，共76頁。1、細(xì)胞毒類抗腫瘤藥2、以細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物3、腫瘤新生血管生成抑制藥物4、腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑5、分化誘導(dǎo)劑6、基因調(diào)節(jié)藥物7、單克隆抗體藥物腫瘤的藥物治療第五頁，共76頁。a、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑b、胸苷酸合成酶抑制劑c、鉑類抗腫瘤藥物

1、細(xì)胞毒類抗腫瘤藥第六頁，共76頁。原理：真核細(xì)胞DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ（TopoⅠ)是生物體內(nèi)及其重要的細(xì)胞核內(nèi)酶，參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)等所有關(guān)鍵的核內(nèi)過程。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ已成為重要的抗腫瘤藥物研究新靶點(diǎn)。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑已成為高選擇性抗腫瘤藥物研究的一個主攻方向。代表藥物：喜樹堿類化合物對S期的毒性作用，這一作用需共價TopoI－DNA復(fù)合物的形成和DNA復(fù)制。TopoI抑制劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而非DNA斷裂是引起細(xì)胞最終死亡的原因。a、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑第七頁，共76頁。原理：胸苷酸合成酶（TS）把單磷酸脫氧尿嘧啶（DUMP）轉(zhuǎn)換成單磷酸胸腺嘧啶（TMP），在DNA復(fù)制和細(xì)胞生長過程中起著關(guān)鍵作用。是已知抗腫瘤藥物的重要有效靶點(diǎn)之一。胸苷酸合成酶抑制劑導(dǎo)致了DNA斷裂從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。代表藥物：培美曲塞它是一種結(jié)構(gòu)上含有核心為吡咯嘧啶基團(tuán)的抗葉酸制劑，通過破壞細(xì)胞內(nèi)葉酸依賴性的正常代謝過程，抑制細(xì)胞復(fù)制，從而抑制腫瘤的生長。體外研究顯示，培美曲塞能夠抑制胸苷酸合成酶、二氫葉酸還原酶和甘氨酰核苷酸甲酰轉(zhuǎn)移酶活性，這些酶都是合成葉酸所必需的酶。一旦培美曲塞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，它就在葉酰多谷氨合成酶的作用下轉(zhuǎn)化為多谷氨酸的形式。多谷氨酸存留于細(xì)胞內(nèi)成為胸苷酸合成酶和甘氨酰胺核苷酸甲酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑。多谷酸化在腫瘤細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)時間-濃度性過程，而在正常組織內(nèi)濃度很底。多谷氨酸化代謝物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的半衰期延長，從而也就延長了藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的作用時間。

b、胸苷酸合成酶抑制劑第八頁，共76頁。原理：鉑絡(luò)合物產(chǎn)生抗腫瘤活性的原因，是由于其與腫瘤細(xì)胞DNA結(jié)合，從而干擾DNA的復(fù)制，抑制腫瘤細(xì)胞的分裂。代表藥物：順鉑和奧沙利鉑

c、鉑類抗腫瘤藥物第九頁，共76頁。a、蛋白酪氨激酶（PTK）抑制劑b、表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑C、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑2、以細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物第十頁，共76頁。原理：PTK是一組酶系，能催化ATP上的磷酸基轉(zhuǎn)移到許多重要的蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上，使其殘基磷酸化，從而激活各種底物酶，通過一系列反應(yīng)影響細(xì)胞的生長、增殖和分化。代表藥物：依馬替尼

依馬替尼一種抑制Bcr-Abl酪氨酸激酶的蛋白酪氨酸激酶抑制劑，Bcr-Abl酪氨酸激酶是CML中由費(fèi)城異常染色體引起的異常酪氨酸激酶。它能抑制Bcr-Abl陽性細(xì)胞系和費(fèi)城染色體陽性CML新鮮白血病細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

a、蛋白酪氨激酶（PTK）抑制劑第十一頁，共76頁。原理：通過擴(kuò)散進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，與EGFR的胞內(nèi)段激酶結(jié)合區(qū)結(jié)合，從而抑制EGFR受體的磷酸化，阻斷受體下游信號通路的傳導(dǎo)，發(fā)揮抗腫瘤作用。

代表藥物：吉非替尼

研究表明吉非替尼的作用通過上調(diào)P27KIP1和P21CIP/WAF1的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞G1期阻滯或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

b、表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑第十二頁，共76頁。第十三頁，共76頁。原理：法尼基轉(zhuǎn)移酶是近年來發(fā)現(xiàn)的與Ras蛋白異戊二烯化修飾密切相關(guān)的一種必需酶。抑制法尼基轉(zhuǎn)移酶活性，阻止Ras蛋白的活化，可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖代表藥物：替匹法尼

c、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑第十四頁，共76頁。原理：原發(fā)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移是依賴于新生血管生成的，開發(fā)和研究能夠破壞或抑制血管生成、有效地抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的藥物（稱為TA抑制劑），是新型抗腫瘤藥物研究的活躍領(lǐng)域之一。

代表藥物：angiostatin和endostatinAvastinEndostatin可直接與血管內(nèi)皮細(xì)胞受體結(jié)合抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增生；

可與肝素樣的硫酸蛋白結(jié)合，抑制血管生成；

可抑制VEGF等血管生長因子，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與腫瘤的生長；

可抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x1,促使血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡加速。3、腫瘤新生血管生成抑制藥物第十五頁，共76頁。第十六頁，共76頁。第十七頁，共76頁。原理：根據(jù)腫瘤耐藥的特點(diǎn)可分為原藥耐藥(PDR)和多藥耐藥(MDR)兩大類。前者只對誘導(dǎo)藥物產(chǎn)生耐藥性而對其它藥物不產(chǎn)生交叉耐藥性，如抗代謝藥甲氨蝶呤(MTX)，5-氟尿嘧啶(5-Fu)等；后者則是指腫瘤細(xì)胞一旦對某種化療藥物產(chǎn)生耐藥性，同時對其它結(jié)構(gòu)上無關(guān)、作用機(jī)制各異的藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性，這是一種獨(dú)特的廣譜耐藥現(xiàn)象。許多天然來源的抗腫瘤藥物如秋水仙堿、紫杉醇等及蒽環(huán)類抗癌抗生素如阿霉素、柔紅霉素都極易發(fā)生MDR。腫瘤耐藥產(chǎn)生的可能原因是藥物代謝障礙、DNA修復(fù)機(jī)制障礙、DNA多聚酶活性改變等。另外，耐藥是凋亡抑制的表現(xiàn)。一些與凋亡抑制相關(guān)的癌基因(如bcl-2,bcr/abl,NF/KB等)的表達(dá)產(chǎn)物可阻斷或阻礙多種因素(如化療藥物、輻射、激素等)誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生耐藥性。研究表明MDR的產(chǎn)生是由于細(xì)胞內(nèi)藥物積聚發(fā)生障礙，此后研究證實(shí)細(xì)胞內(nèi)藥物積聚降低的同時，有一分子量約為170000細(xì)胞膜蛋白過度表達(dá)，稱之為P-糖蛋白(Pgp)代表藥物：鈣拮抗藥（維拉帕米及其衍生物）、鈣調(diào)蛋白拮抗藥（包括氯丙嗪等吩噻嗪類衍生物）、環(huán)孢素類（環(huán)孢素及其衍生物PSC833，SDZ280-466等）及抗雌激素類化合物（他莫昔芬）等。

4、腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑第十八頁，共76頁。EXTRACELLULAR INTRACELLULARATPPGP170 ATPDrugDrugPlasmaMembrane第十九頁，共76頁。

環(huán)胞菌素A(CsA)是一種從真菌屬中提取的天然藥物，具有選擇性的免疫抑制功能，廣泛用于器官移植后的抗排斥反應(yīng)及治療免疫性疾病。它能競爭性的和Pgp結(jié)合，阻斷Pgp泵出藥物的功能，提高胞內(nèi)藥物濃度，從而對抗MDR，通過進(jìn)一步研究表明，CsA的作用機(jī)制并非單一，除了通過結(jié)合Pgp而調(diào)節(jié)藥物濃度外，還可通過與細(xì)胞內(nèi)，靶結(jié)構(gòu)之間的相互作用而增加化學(xué)敏感因子自身的細(xì)胞毒性。CsA在MDR中可調(diào)節(jié)藥物的運(yùn)輸，使抗癌藥在細(xì)胞內(nèi)積累增加，外排減少，從而增加抗腫瘤藥物的敏感性。第二十頁，共76頁。原理：通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡達(dá)到腫瘤縮小、消退的目的已成為當(dāng)今腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。促進(jìn)惡性細(xì)胞向成熟分化的抗癌藥物稱分化誘導(dǎo)劑。代表藥物：維A酸類化合物咪唑衍生物利阿唑

5、分化誘導(dǎo)劑第二十一頁，共76頁。維A酸類化合物維甲酸類化合物(Retinoicacids)在調(diào)控細(xì)胞生長、分化、凋亡等生命活動中起重要作用。其在體內(nèi)的生理活性代謝產(chǎn)物包括全反式維甲酸(ATRA)、13-順維甲酸(13-cis-RA)和9-順維甲酸(9-cis-RA)，它們可通過核維甲酸受體(RAR)結(jié)合于DNA應(yīng)答元件，從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。

第二十二頁，共76頁。"Rightnowwelumppatientstogetherandtreatthemwiththesamedrugsandthendealwiththeirvariableresponsetotreatment.We'reessentiallytreatingdifferentdiseaseswiththesamemedicine.”RichardKlausner,1997第二十三頁，共76頁。a、反義藥物b、Decoy核酸C、RNA干擾

6、基因治療第二十四頁，共76頁。a、反義藥物反義藥物又稱反義寡核苷酸藥物（AODNs），是指人工合成長度為10～30個堿基的DNA分子及其類似物。根據(jù)核苷酸雜交原理，反義藥物能與特定的基因雜交，在基因水平上干擾致病蛋白質(zhì)的產(chǎn)生過程。AODNs可以與其靶RNA鏈互補(bǔ)結(jié)合，形成RNA-DNA雜交雙鏈。形成的雜交雙鏈可以被RNA酶H識別并消化RNA鏈，由此釋放出的AODN可以繼續(xù)與靶RNA鏈結(jié)合，最終導(dǎo)致編碼基因沉默。由此可推RNA酶H過多表達(dá)可增強(qiáng)各種AODNs效應(yīng)，反之RNA酶H受抑則降低其作用。有些AODNs并不能激活RNA酶H，相反與翻譯元件競爭空間因此可抑制RNA翻譯。另外，AODNs如果和mRNA結(jié)合可作用于內(nèi)含子外顯子接合處以中斷其拼接過程。AODNs還可以占領(lǐng)校正RNA細(xì)胞內(nèi)定位的蛋白－RNA作用序列，從而擾亂RNA運(yùn)輸，藥物：Vitravenea、反義藥物第二十五頁，共76頁。5’-ACGCT-3’3’-TGCGA-5’mRNARNAseHAntisenseDNA第二十六頁，共76頁。Decoy核酸是與靶轉(zhuǎn)錄因子具有高親和性的雙鏈寡聚核酸,通過競爭性抑制轉(zhuǎn)錄因子與調(diào)控區(qū)域的結(jié)合,調(diào)控轉(zhuǎn)錄來改變下游基因的異常表達(dá),從而抑制腫瘤惡性增殖.體外篩選結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子AP2的decoy核酸藥物,結(jié)果K102對多種腫瘤細(xì)胞生長有顯著的抑制作用,在異植人腫瘤細(xì)胞NCI－H460的裸鼠模型中,靜脈注射高中低三劑量組的decoy核酸K102,抑瘤率分別達(dá)71.8%、64.4%及57.3%.通過凝膠阻抑試驗(yàn),驗(yàn)證了K102與轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生特異性結(jié)合.實(shí)驗(yàn)結(jié)果為decoy核酸轉(zhuǎn)錄調(diào)控藥物的研究提供了依據(jù)。b、Decoy核酸第二十七頁，共76頁。DesignoligoswhichcanspecificallybindtothetranscriptionfactorJUN/ATFandblockdownstreanmultipleoncogenesexpression第二十八頁，共76頁。

RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是由雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因靜默機(jī)制.RNAi是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動、調(diào)控基因表達(dá)的監(jiān)控機(jī)制。由于RNA干擾是針對轉(zhuǎn)錄后階段的基因沉默，相對于傳統(tǒng)基因治療對基因水平上的敲除，整個流程設(shè)計(jì)更簡便，且作用迅速，效果明顯，為基因治療開辟了新的途徑。其總體思路是通過加強(qiáng)關(guān)鍵基因的RNAi機(jī)制，控制疾病中出現(xiàn)異常的蛋白合成進(jìn)程或外源致病核酸的復(fù)制及表達(dá)。c、RNA干擾第二十九頁，共76頁。單克隆抗體(單抗)藥物就是通過淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)或基因工程技術(shù)制備的抗體。起初用于診斷劑或檢測劑，后來用于治療腫瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾病。治療腫瘤的優(yōu)越性：（1）單抗藥物對腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用（2）單抗藥物具有更高的療效（3）單抗藥物對腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)的特異性作用其研究重點(diǎn)主要集中在將抗體與化學(xué)藥物、酶、放射性核素、毒素和生物誘導(dǎo)劑等耦聯(lián)后直接殺傷腫瘤或者利用抗體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤血管生成等方面。目前，國際上與腫瘤治療相關(guān)的抗體研究主要集中在將抗體與耦聯(lián)物作用后直接殺傷腫瘤細(xì)胞，利用抗體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤血管生成等方面。7、單克隆抗體藥物第三十頁，共76頁。第三十一頁，共76頁。代表藥物：曲妥珠單抗（trastuzumab，Herceptin

）Trastuzumab為靶向結(jié)合HER2的人IgG1類單抗，HER2為酪氨酸激酶受體，在約20%～25%的進(jìn)展期乳腺癌患者過表達(dá)。HER2分子具有以下的特點(diǎn)，因此成為乳腺癌治療的靶分子：①HER2的表達(dá)水平與乳腺癌的發(fā)病機(jī)理及預(yù)后相關(guān)；②腫瘤的HER2表達(dá)水平及基因拷貝數(shù)遠(yuǎn)高于正常組織，有效的減輕了HER2靶向治療藥物的毒性；③HER2表達(dá)陽性的腫瘤細(xì)胞比例很高，而且在腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，因此在患者體內(nèi)可以靶向大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞；④HER2在原發(fā)腫瘤及轉(zhuǎn)移灶均有表達(dá)，因此HER2靶向治療對原發(fā)及轉(zhuǎn)移病灶均有效。第三十二頁，共76頁。曲妥珠單抗（trastuzumab）的作用機(jī)制：①抑制受體信號傳導(dǎo)。HER2可以活化多種信號傳導(dǎo)通路，包括PI3K、MAPK等。Trastuzumab減少了這些信號通路的傳導(dǎo)，將細(xì)胞阻滯于調(diào)定點(diǎn)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。受體信號傳導(dǎo)的降低是由于trastuzumab介導(dǎo)的HER2受體內(nèi)化及降解。②通過調(diào)節(jié)p27kipl阻滯細(xì)胞于G1調(diào)定點(diǎn)。Trastuzumab處理的細(xì)胞被阻滯于G1調(diào)定點(diǎn)，細(xì)胞增殖減少。細(xì)胞阻滯于G1調(diào)定點(diǎn)與細(xì)胞周期依賴的激酶抑制蛋白p27kipl相關(guān)。③誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。體內(nèi)研究表明trastuzumab可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，凋亡的發(fā)生與Ki67的表達(dá)無關(guān)。④抑制血管形成。高表達(dá)HER2的腫瘤細(xì)胞新生血管及VEGF的表達(dá)顯著增加。體內(nèi)研究結(jié)果顯示trastuzumab處理后，乳腺癌腫瘤體積減小，微血管密度降低；體外研究表明trastuzumab處理后，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力下降。⑤抑制DNA修復(fù)。體外研究顯示可與許多化療藥物產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。Trastuzumab或聯(lián)合化療藥物促進(jìn)DNA損傷，并抑制DNA的修復(fù)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。第三十三頁，共76頁。第三十四頁，共76頁?？鼓[瘤新藥發(fā)現(xiàn)第三十五頁，共76頁。MathematicalmodelCellBiologyTargetselectionDrugdesign(Pre)clinicaltesting第三十六頁，共76頁。Howmanydrugtargetsarethere?~8,000targetsofpharmacologicalinterest,ofwhichnearly5,000couldbepotentiallyhitbytraditionaldrugsubstances,nearly2,400byantibodiesand~800byproteinpharmaceuticals.第三十七頁，共76頁。DrugTarget:Enzymes第三十八頁，共76頁。DrugTarget:EnzymesII第三十九頁，共76頁。DrugTarget:EnzymesIII第四十頁，共76頁。DrugTarget:EnzymesIII第四十一頁，共76頁。DrugTarget:ReceptorsI第四十二頁，共76頁。DrugTarget:ReceptorsII第四十三頁，共76頁。DrugTarget:ReceptorsIII第四十四頁，共76頁。DrugTarget:ReceptorsIII第四十五頁，共76頁。DrugTarget:Ionchannels第四十六頁，共76頁。DrugTarget:Transportproteins第四十七頁，共76頁。DrugTarget:DNA/RNAandtheribosome第四十八頁，共76頁。DrugTarget:Targetsofmonoclonalantibodies第四十九頁，共76頁。DrugTarget:Variousphysicochemicalmechanisms第五十頁，共76頁?？鼓[瘤藥物的篩選和評價抗腫瘤藥的臨床前藥理研究包括藥效學(xué)和毒性研究兩部分抗腫瘤藥物藥效學(xué)需研究內(nèi)容：體外抗腫瘤試驗(yàn)體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)

評價藥物的抗癌活性時，以體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果為主，同時參考體外試驗(yàn)結(jié)果以做出正確的結(jié)論。

第五十一頁，共76頁。體外抗腫瘤活性試驗(yàn)?zāi)康模簩蜻x化合物進(jìn)行初步篩選；了解候選化合物的抗瘤譜；為隨后進(jìn)行的體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)提供參考，如劑量范圍、腫瘤類別等。第五十二頁，共76頁。體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法體外試驗(yàn)常用方法有：染料排斥法四氮唑鹽還原法阿拉馬藍(lán)法磺酰羅丹明染色法集落形成法生長曲線測定法。藥物與細(xì)胞共培養(yǎng)時間一般為48-72小時，貼壁細(xì)胞需先貼壁24小時后再給藥。試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陽性及陰性對照組，陽性對照用一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗腫瘤藥，陰性對照為溶媒對照

第五十三頁，共76頁。體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法染料排斥法（dyeexclusionassay）試驗(yàn)原理：活細(xì)胞有排斥某些染料如伊紅、臺盼藍(lán)、苯胺黑等的能力，而死細(xì)胞由于膜完整性的破壞，可被著色。因此培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中加入這些染料，一定時間后，對著色和未著色的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，即可算出被殺死的細(xì)胞比例。方法要點(diǎn)：向一定容積的待檢細(xì)胞懸液加入定量的某種染液，最常用的是0.4%臺盼藍(lán)液，混勻，室溫染色5-15min，將已染色的細(xì)胞懸液滴加至血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，直接在光鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)。觀測指標(biāo)：按（未染色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）X100%計(jì)算活細(xì)胞率，對照組活細(xì)胞率應(yīng)在90%以上。根據(jù)活細(xì)胞率計(jì)算受試樣品的半數(shù)致死劑量（IC50）作為藥物抗腫瘤活性的指標(biāo)。第五十四頁，共76頁。體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法阿拉馬藍(lán)法（alamarblueassay）試驗(yàn)原理：非熒光性藍(lán)色底物阿拉馬藍(lán)可被活細(xì)胞中的線粒體內(nèi)的NADPH相關(guān)的脫氫酶類還原為強(qiáng)熒光性粉紅色底物，采用微培養(yǎng)板自動讀數(shù)儀在激發(fā)與發(fā)射波長分別為530nm和590nm處讀取熒光強(qiáng)度值，與活細(xì)胞數(shù)呈良好的線性關(guān)系。方法要點(diǎn)：細(xì)胞經(jīng)受試樣品處理后，加入10-20ul阿拉馬藍(lán)染液，繼續(xù)培養(yǎng)一定時間，用微培養(yǎng)板自動讀數(shù)儀在激發(fā)與發(fā)射波長分別為530nm和590nm處讀取熒光強(qiáng)度值。觀測指標(biāo)：根據(jù)熒光強(qiáng)度可以計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，適當(dāng)時可進(jìn)一步計(jì)算IC50值。第五十五頁，共76頁。體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法集落形成法（clonogenicassay）試驗(yàn)原理：克隆原細(xì)胞具有持續(xù)增殖能力，當(dāng)單個細(xì)胞分裂6代或6代以上時，其后代所組成的群體(集落)便含50個以上細(xì)胞。通過集落計(jì)數(shù)可對克隆原細(xì)胞作定量分析。它反映了單個細(xì)胞的增殖潛力，故能較靈敏地測定抗癌藥的活性，日前被認(rèn)為是一種較理想的檢測方法。方法要點(diǎn)：將濃度為500個細(xì)胞/ml的對數(shù)生長期細(xì)胞懸液2ml種至35ml的培養(yǎng)皿，并加受試樣品適量，培養(yǎng)7d或更長時間，姬姆薩染色，解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)含50細(xì)胞以上的集落。觀測指標(biāo)：根據(jù)集落數(shù)計(jì)算集落形成率，對照組集落形成率不應(yīng)低于40%，再計(jì)算用藥組的集落形成抑制率，根據(jù)情況可進(jìn)一步采用Logit法計(jì)算受試樣品的IC50值。集落形成率=集落數(shù)/細(xì)胞接種數(shù)X100%集落形成抑制率=（1-用藥組集落形成率）/對照組集落形成率X100%第五十六頁，共76頁。體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法生長曲線測定法（growth-curvedetermination）試驗(yàn)原理：在最適條件下，腫瘤細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈指數(shù)生長，如取細(xì)胞數(shù)的對數(shù)與培養(yǎng)時間作圖可得一條直線，故稱此時為對數(shù)生長期。隨著細(xì)胞密度不斷增高，由于代謝產(chǎn)物的積聚及營養(yǎng)物的消耗，細(xì)胞生長逐漸減慢以致停止，此時稱高坪期或穩(wěn)定期。因此藥物對細(xì)胞生長的影響可通過生長曲線反映出來。方法要點(diǎn)：將濃度為10000個細(xì)胞/ml的對數(shù)生長期細(xì)胞懸液按每瓶5ml種至25ml的培養(yǎng)瓶，或按每孔100微升種至96孔板，并加受試樣品適量，培養(yǎng)后分別于即刻和1、2、3、4、5、6、7d進(jìn)行檢測。前者可采用臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，后者可采用MTT法或SRB法讀取OD值，并據(jù)此進(jìn)行作圖與計(jì)算。觀測指標(biāo)1、倍增時間(TD),將實(shí)際生在曲線進(jìn)行直線回歸求出0和t時刻的理論細(xì)胞數(shù)N0和Nt，據(jù)此計(jì)算：TD=0.301t/（logNt—logN0）；2增殖細(xì)胞殺傷率（%）=(N0—N0’)/N0×100%；3細(xì)胞生長飽和密度（Ns），代表高坪期每毫升細(xì)胞數(shù)的均數(shù)。

第五十七頁，共76頁。體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法磺酰羅丹明染色法（sulforhodamineBassay）試驗(yàn)原理：SRB是一種蛋白質(zhì)結(jié)合染料，粉紅色，可溶于水。SRB可與生物大分子中的堿性氨基酸結(jié)合。其在515nm波長的OD讀數(shù)與細(xì)胞數(shù)呈良好的線性關(guān)系。故可用作細(xì)胞數(shù)的定量。MTT法的一個缺點(diǎn)是OD值可隨放置時間而變，而SRB法無此現(xiàn)象。因此更適用于進(jìn)行大規(guī)模的試驗(yàn)。方法要點(diǎn)：用10%冷三氯乙酸與4℃固定已經(jīng)受試樣品處理的細(xì)胞1h，洗滌，干燥；加入4mg/mlSRB液100微升/孔染色15min，1%冰醋酸洗滌，干燥；最后加入150微升/孔的Tris溶液，在酶標(biāo)儀上與515nm波長處檢測OD值。觀測指標(biāo)同MTT法。另外，NCI目前采用以下指標(biāo)評價化合物的體外抗腫瘤活性。測定的OD值包括對照組、加藥組及加藥時的細(xì)胞的OD值C、T、和T0。據(jù)此計(jì)算：生長抑制率（%）=（T－T0）/（C—T0）×100%；細(xì)胞死亡率（%）=（T—T0）/T0×100%。按生長抑制率或細(xì)胞死亡率對樣品濃度繪出量效關(guān)系曲線圖，并求出：GI50，即生長抑制率為50%時的樣品濃度；TGI，即生長抑制率為100%時的樣品濃度：LC50，即細(xì)胞死亡率為50%時的樣品濃度。第五十八頁，共76頁。體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法四氮唑鹽還原法（tetrazolinmsaltreductionassay）試驗(yàn)原理：四氮唑[MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide]是一種能接受氫原子的染料。活細(xì)胞線粒體中與NADP相關(guān)的脫氫酶在細(xì)胞內(nèi)可將黃色的MTT轉(zhuǎn)化成不溶性的藍(lán)紫色的甲[月替](formazan)，而死的細(xì)胞則無此功能。用二甲基亞諷(DMSO)溶解甲[月替]后，在一定波長下用酶標(biāo)儀測定光密度值，即可定量測出細(xì)胞的存活率。方法要點(diǎn)：受試樣品處理細(xì)胞結(jié)束后，加入5mg/mlMTT液20微升/孔，繼續(xù)培養(yǎng)四小時。再加三聯(lián)液并培養(yǎng)過夜。在酶標(biāo)儀上于570nm波長處檢測OD值。觀測指標(biāo)直接指標(biāo)為96孔板上各被測孔的OD值；然后按公式（對照組OD值-治療組OD值）/對照組OD值×100%計(jì)算出相應(yīng)的細(xì)胞生長抑制率；劇情況可進(jìn)一步采用Logit法計(jì)算50%生長抑制濃度IC50值。第五十九頁，共76頁。體外抗腫瘤活性試驗(yàn)體外篩選方法的優(yōu)點(diǎn)：操作簡單用藥量少取材可直接用于人體腫瘤得出結(jié)果快速第六十頁，共76頁。Case:Activityof20compoundsonthegrowthofthreecancercelllinesProvider:CBiotechCompany第六十一頁，共76頁。HumanNCI-H460lungcancercellwithouttreatmentHumanNCI-H460lungcancercellWithCompoundAtreatment第六十二頁，共76頁。體外抗腫瘤活性試驗(yàn)體外篩選方法的缺陷：1、細(xì)胞毒性易顯陽性，有毒物質(zhì)也常常顯陽性，故假陽性率高2、非直接對腫瘤細(xì)胞作用的藥物顯示假陰性3、體外細(xì)胞并不能完全代表體內(nèi)腫瘤的惡性細(xì)胞第六十三頁，共76頁。體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)1、自發(fā)性腫瘤2、誘發(fā)的腫瘤3、移植性腫瘤（a）皮下腫瘤模型（b）腹水瘤模型（c）原位接種模型第六十四頁，共76頁。體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)小鼠腫瘤模型

淋巴細(xì)胞白血病腹水瘤L1210和P388、白血病L-615、宮頸癌U14、肝癌H22、Lewis肺癌、黑色素瘤B16、網(wǎng)織細(xì)胞瘤M5076、腸癌26、腸腺癌38、乳腺癌CD8F1、艾氏腹水瘤（EAC）、肉瘤-180等，以及各種小鼠腫瘤的亞型和耐藥株等。

人癌裸小鼠移植瘤模型

應(yīng)選用體外試驗(yàn)敏感細(xì)胞株進(jìn)行體內(nèi)抗人癌裸小鼠移植瘤試驗(yàn)。模型建立和使用應(yīng)注意：

(1)移植瘤一般由相應(yīng)的細(xì)胞株移植而建立，對細(xì)胞株和移植瘤的化療敏感性應(yīng)予了解。

(2)移植瘤復(fù)蘇后一般應(yīng)傳2-3代后再用于體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)。

(3)對模型生長情況應(yīng)全面了解，尤其是生長快的模型

(4)為了保持移植瘤的生物學(xué)特性和遺傳特性，復(fù)蘇后移植瘤體內(nèi)傳代應(yīng)少于15-20代第六十五頁，共76頁。體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)接種：

腫瘤接種方法主要有皮下接種、腹腔接種和原位接種。

第六十六頁，共76頁。體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)皮下腫瘤模型

選擇腫瘤生長旺盛且無潰破的荷瘤小鼠，頸椎脫臼處死，在無菌條件下（超凈臺或接種罩），用碘酒、酒精或新潔爾滅消毒動物皮膚，切開皮膚，剝離腫瘤。將瘤組織剪成1.5mm3左右，用套管針接種于動物一側(cè)或雙側(cè)腋窩皮下；或制成細(xì)胞懸液，然后按一定比例加入無菌生理鹽水，一般每只小鼠接種腫瘤細(xì)胞數(shù)量為（1-5）×106。

第六十七頁，共76頁。HumanlungcancerNCI-H460xenograftedinnudemicewithouttreatmentHumanlungcancerNCI-H460xenograftedinnudemicewithCompoundCtreatment第六十八頁，共76頁。體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)

腹水瘤模型

無菌條件下，消毒動物皮膚，吸取生長良好的動物腹水，以生理鹽水按一定比例稀釋后接種于動物腹腔，接種細(xì)胞數(shù)量一般為（1-5）×106。