無菌檢查法及其驗(yàn)證

無菌檢查法概念指用于檢查藥典要求無菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)被微生物污染。無菌檢查法概念無菌檢查是通過目檢微生物在培養(yǎng)基中的生長來判斷結(jié)果。無菌檢驗(yàn)只能給出該批產(chǎn)品受污染的程度。無菌檢驗(yàn)合格只能說明被測(cè)樣品無菌，不能證明整批樣品無菌。無菌檢查的設(shè)施、環(huán)境、人員檢查環(huán)境應(yīng)在潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單項(xiàng)流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行，其全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。無菌檢查的設(shè)施、環(huán)境、人員無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識(shí)，并經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓(xùn)。

無菌隔離系統(tǒng)無菌隔離系統(tǒng)是一個(gè)不受外界環(huán)境影響的、可進(jìn)行無菌操作的獨(dú)立環(huán)境系統(tǒng)。使用隔離系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)：它能創(chuàng)造一個(gè)持續(xù)高效的高度無菌空間,保護(hù)產(chǎn)品免受外源性污染，包括操作人員、操作環(huán)境及外包裝等的污染，確保操作環(huán)境及實(shí)驗(yàn)物品表面能達(dá)到無菌要求，防止出現(xiàn)假陽性結(jié)果,保證無菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，從而實(shí)現(xiàn)一次檢出的要求；保護(hù)操作人員免受實(shí)驗(yàn)過程中的有害物質(zhì)帶來的污染；放置隔離器的環(huán)境潔凈度不需要特殊要求，移動(dòng)方便等優(yōu)點(diǎn)。HTY無菌隔離系統(tǒng)培養(yǎng)基的制備及裝量培養(yǎng)基可按處方制備，亦可使用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度1/2。供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層顏色不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否則，須經(jīng)100℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次。

培養(yǎng)基的儲(chǔ)存制備好的培養(yǎng)基應(yīng)該保存在2-25℃、避光的環(huán)境，若保存于非密閉容器中，一般在3周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，一般可在1年內(nèi)使用。

※應(yīng)結(jié)合實(shí)際情況進(jìn)行驗(yàn)證，以確定培養(yǎng)基有效期。培養(yǎng)基的適用性檢查本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時(shí)進(jìn)行。

無菌性檢查

①重要性：培養(yǎng)基無菌不合格將導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的假陽性結(jié)果。

②檢查：每批培養(yǎng)基隨機(jī)抽取不少于5支或5瓶，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置30-35℃培養(yǎng)，改良馬丁培養(yǎng)基置23-28℃培養(yǎng)，培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長。培養(yǎng)基的適用性檢查②菌種選擇的原則代表性、普遍性、易存活、低或非致病性、標(biāo)準(zhǔn)菌株(或該藥品中常見的污染菌)。金黃色葡萄球菌（代表革蘭氏陽性菌）、銅綠色假單胞菌（代表革蘭氏陰性菌）、枯草芽孢桿菌（代表藥品中最常見或最易污染的菌）、生孢梭菌（代表厭氧菌）、白色念珠菌（代表酵母菌）、黑曲霉（代表霉菌）。菌種的要求：不得超過5代。采用適宜的菌種保藏方法保存，以保證菌種的生物學(xué)特性。加菌量:＜100cfu。培養(yǎng)基的適用性檢查菌液制備

試驗(yàn)菌培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時(shí)間

金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯30-3518-24

銅綠假單胞菌

枯草芽孢桿菌生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體

白色念珠球菌改良馬丁培養(yǎng)基23-2824-48

黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面5-7天

③培養(yǎng)基的適用性檢查④培養(yǎng)基接種試驗(yàn)菌培養(yǎng)基每管裝量接種管數(shù)接種量培養(yǎng)時(shí)間金黃色葡萄球菌硫乙醇酸鹽12ml2支1ml3天銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌

白色念珠球菌改良馬丁培養(yǎng)基9ml2支1ml5天黑曲霉

※其中硫乙醇酸鹽及改良馬丁培養(yǎng)基均有1支不接種作為空白※接種量＜100cfu（不能多）培養(yǎng)基說明無菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基所能支持生長的微生物是有限的。微生物種類繁多，這些微生物有廣泛的生長要求，如：營養(yǎng)、溫度和氧等。無菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基不可能支持所有微生物的生長，選擇了支持那些最有可能污染藥品和在藥品中生長的微生物的營養(yǎng)的培養(yǎng)基。供試品的無菌檢查法無菌檢查法包括直接接種法和薄膜過濾法。只要供試品性狀允許，應(yīng)優(yōu)先采用薄膜過濾法。

進(jìn)行供試品無菌檢查時(shí)，所采用的檢查方法和檢驗(yàn)條件應(yīng)與驗(yàn)證的方法相同。薄膜過濾法可以提高無菌檢驗(yàn)的檢出率，特別是抑菌性供試品，采用薄膜過濾法可以有效消除供試品的抑菌性，提高檢出率。供試品的無菌檢查法--直接接種法樣品直接移入無菌培養(yǎng)基中。每個(gè)容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%。同時(shí)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。培養(yǎng)基的用量和高度同方法驗(yàn)證試驗(yàn)。每種培養(yǎng)基接種的管數(shù)同供試品的檢驗(yàn)數(shù)量。供試品的無菌檢查法檢驗(yàn)數(shù)量指一次檢驗(yàn)所用供試品最小包裝容器的數(shù)量采用薄膜過濾法應(yīng)增加1/2的最小檢驗(yàn)數(shù)量作為陽性對(duì)照；采用直接接種法應(yīng)增加供試品無菌檢查時(shí)每個(gè)培養(yǎng)基容器接種的樣品量作為陽性對(duì)照。檢驗(yàn)量指一次試驗(yàn)所用供試品總量（g或ml），若每支（瓶）供試品裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時(shí)，檢驗(yàn)量不應(yīng)少于直接接種法的供試品總量，只要供試品的特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾.無菌檢查的稀釋液、沖洗液

無菌檢驗(yàn)所用稀釋液、沖洗液種類應(yīng)對(duì)微生物無毒、無抑制作用。稀釋液用量、沖洗液沖洗次數(shù)及用量等應(yīng)當(dāng)與驗(yàn)證合格的方法一致。每張濾膜每次沖洗量為100ml，總沖洗量不宜過大（不超過1000ml），用量過多不僅容易破壞濾膜上截留的微生物，而且對(duì)濾膜造成損傷；但也不能太少，否則不能將供試品沖洗干凈，無法消除抑菌性。0.1%蛋白胨水溶液PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液

如需要可加入表面活性劑或中和劑,應(yīng)經(jīng)方法驗(yàn)證證明其有效性，并對(duì)細(xì)菌存活無影響。供試品溶液的制備

①水溶液供試品取規(guī)定量，直接過濾，或混合至含適量稀釋液的無菌容器內(nèi)，混勻，立即過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用適量的沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)不得少于三次。沖洗后，如用封閉式薄膜過濾器，分別將100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基加入相應(yīng)的濾筒內(nèi)。如果采用一般薄膜過濾器，取出濾膜，將其剪成3等份，分別置于含50ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基容器中，其中一份做陽性對(duì)照用。

④非水溶性制劑供試品取規(guī)定量，直接過濾或混合溶于含聚山梨酯80或其它適宜乳化劑的稀釋液中，充分混合，立即過濾。用含0.1%-1%聚山梨酯80的沖洗液沖洗濾膜至少3次。濾膜于含或不含聚山梨酯80的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基接種照水溶液供試品項(xiàng)下的方法操作。其他類供試品：⑤可溶于十四烷酸異丙酯的膏劑和粘性油劑供試品⑥無菌氣（噴）霧劑供試品⑦裝有藥物的注射器供試品

⑧具有導(dǎo)管的醫(yī)療器具(輸血、輸液袋等)供試品

供試品溶液的制備陽性對(duì)照試驗(yàn)?zāi)康模孩衮?yàn)證供試品經(jīng)滅活后或用其它方式（稀釋、沖洗等）處理后是否仍有抑菌或殺菌的作用，確保檢驗(yàn)條件符合要求，防止出現(xiàn)假陰性。②培養(yǎng)條件是否符合要求。

應(yīng)根據(jù)供試品的特性選擇陽性對(duì)照菌。①無抑菌及抗革蘭陽性-金黃色葡萄球菌②抗革蘭陰性-大腸埃希菌③抗厭氧菌-生孢梭菌④抗真菌-白色念珠菌陽性對(duì)照菌加量：＜100cfu陽性對(duì)照培養(yǎng)48-72h應(yīng)生長良好。結(jié)果判斷

前提:陽性對(duì)照為陽性，陰性對(duì)照為陰性，無菌檢驗(yàn)方有效。若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定。若供試品中任何1管顯混濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。除非能充分證明，生長的微生物非供試品所含。當(dāng)符合下列至少一個(gè)條件時(shí)，方可判試驗(yàn)結(jié)果無效：對(duì)無菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求；回顧無菌試驗(yàn)過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素；供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證有微生物生長是因無菌試驗(yàn)中所使用的物品和（或）無菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。試驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無效，應(yīng)重試。重試時(shí)，重新取同量供試品，依法重試，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定，若有菌生長判供試品不符合規(guī)定。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)被微生物污染。所有供試品管均無菌生長，方可判供試品符合規(guī)定。以一次檢出為準(zhǔn)，除非有證據(jù)充分證明檢出的微生物非供試品本身所致，原檢驗(yàn)結(jié)果無效，應(yīng)重試。無菌檢驗(yàn)的局限性本版藥典無菌檢查法指出：若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)被微生物污染。藥品要么是無菌的，要么就是非無菌的。藥品是否無菌的結(jié)論一直是以藥典規(guī)定的無菌檢查抽樣和試驗(yàn)方法的結(jié)果作為判斷依據(jù)。無菌檢查存在著很多局限性，最明顯的是無菌檢查方法本身。不管樣品是否有好的代表性，它的結(jié)果總是存在不確定性。它是一個(gè)破壞性的試驗(yàn)，它與整個(gè)批的一個(gè)隨機(jī)樣品的統(tǒng)計(jì)選擇性有關(guān)。無菌檢驗(yàn)的局限性

從理論上來說，要確定某批產(chǎn)品的無菌性，應(yīng)對(duì)每個(gè)容器進(jìn)行無菌檢查。但是無菌試驗(yàn)對(duì)樣品是破壞性的，因此不可能對(duì)每一最小包裝的產(chǎn)品進(jìn)行檢查。統(tǒng)計(jì)概率的局限性：對(duì)于低污染水平的產(chǎn)品，其局限性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上更為明顯。檢驗(yàn)條件的局限：樣品中污染的微生物的檢出受多種因數(shù)的影響，只有在各檢驗(yàn)條件符合污染微生物的修復(fù)和生長時(shí)，才能保證被檢樣品的無菌檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。污染的檢出率要比實(shí)際產(chǎn)品的污染率低

無菌檢查存在檢查失誤的可能性：這可能是因?yàn)槲廴揪鷿舛忍?，或是污染菌生長太慢，或是因?yàn)榕囵B(yǎng)基不良等原因，在培養(yǎng)期間污染菌根本就不生長。產(chǎn)品的染菌率愈小，錯(cuò)判合格的可能性就愈大。無菌檢查的另外一個(gè)弊端，即當(dāng)無菌檢查發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果時(shí)，按照規(guī)定可以重新復(fù)查（這也是應(yīng)該的）。復(fù)查時(shí)盡管已經(jīng)適當(dāng)?shù)丶哟罅藰颖緮?shù)量，但再檢出的幾率就更低了。所以在評(píng)價(jià)某個(gè)無菌制品的某個(gè)批的無菌狀態(tài)時(shí)，僅依靠最終產(chǎn)品的無菌檢查是不充分的，局限性較大。對(duì)無菌制品來說，生產(chǎn)最終產(chǎn)品的所有系統(tǒng)的工藝才是最重要的。抽樣

由于無菌檢查法的統(tǒng)計(jì)學(xué)局限性，對(duì)于同一批的無菌分裝的產(chǎn)品，應(yīng)盡量抽取批生產(chǎn)開始和結(jié)束或生產(chǎn)過程出現(xiàn)異常情況下的產(chǎn)品組成樣本進(jìn)行檢驗(yàn)。對(duì)于采用最終滅菌的產(chǎn)品，應(yīng)抽取每一滅菌柜中經(jīng)驗(yàn)證過的可能存在滅菌不徹底的點(diǎn)的產(chǎn)品組成樣本進(jìn)行檢驗(yàn)。如果試驗(yàn)結(jié)果判為無效，那么重試試驗(yàn)的樣品應(yīng)盡量取與初試同一時(shí)間分裝或同一滅菌位置的樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。休息一下關(guān)于方法驗(yàn)證試驗(yàn)為什么驗(yàn)證？驗(yàn)證什么？怎么驗(yàn)證？為什么驗(yàn)證采用經(jīng)過驗(yàn)證的方法，是分析測(cè)量科學(xué)的基本要求，是各種法規(guī)遵循工作的基礎(chǔ)。藥品微生物檢查作為藥品質(zhì)量體系中的一個(gè)環(huán)節(jié)，應(yīng)與其他檢驗(yàn)項(xiàng)目一樣，對(duì)方法和條件進(jìn)行考察，以保證結(jié)果的科學(xué)性，如鑒別、含量測(cè)定。驗(yàn)證的思想其實(shí)早已貫徹于微生物檢測(cè)的諸多方面：無菌環(huán)境驗(yàn)證（塵埃粒子、浮游菌、沉降菌檢測(cè)）、滅菌器的驗(yàn)證、培養(yǎng)基靈敏度檢測(cè)、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照等。為什么驗(yàn)證藥典充分借鑒發(fā)達(dá)國家經(jīng)驗(yàn)，將微生物檢查方法的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了更加系統(tǒng)化的規(guī)定和要求。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)伴隨著整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程，實(shí)驗(yàn)過程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)均應(yīng)有合理的證明（驗(yàn)證），保證其對(duì)結(jié)果判斷沒有影響。有了系統(tǒng)的方法驗(yàn)證，可以避免以往因?yàn)殛栃跃x擇不合理、方法不合理而造成的漏檢、誤判，以保證結(jié)果的科學(xué)可靠，這一點(diǎn)無論對(duì)于當(dāng)前無菌檢查的一次性報(bào)告，還是對(duì)于實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證認(rèn)可、以及新的藥品注冊(cè)管理辦法的要求都是相一致的。為什么驗(yàn)證驗(yàn)證的意義：保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠性及檢驗(yàn)方法的完整性。驗(yàn)證什么微生物檢驗(yàn)：

某種樣品采用某種方法得到一個(gè)檢查結(jié)果。供試品影響方法的有效性驗(yàn)證什么驗(yàn)證試驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)需滿足兩方面的要求：一方面，樣品的預(yù)處理方式能有效消除（或中和）樣品的抑菌性；另一方面，樣品的預(yù)處理方式和檢測(cè)過程以及培養(yǎng)條件等均不會(huì)影響樣品中的微生物生長。驗(yàn)證藥品微生物檢查方法驗(yàn)證的一般程序與環(huán)節(jié)需前處理不需前處理去除抑菌作用有抑菌作用無抑菌作用樣品可以通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)判斷驗(yàn)證抑菌活性去除的有效性，以及去除方法對(duì)污染菌生長、檢出影響驗(yàn)證前處理方法對(duì)污染菌生長、檢出影響樣品有抑菌作用無抑菌作用有抑菌作用去除抑菌作用驗(yàn)證抑菌活性去除的有效性，以及去除方法對(duì)污染菌生長、檢出影響去除抑菌作用樣品驗(yàn)證抑菌活性去除的有效性，以及去除方法對(duì)污染菌生長、檢出影響去除抑菌作用樣品不需前處理樣品需前處理不需前處理樣品需前處理不需前處理樣品需前處理不需前處理樣品無抑菌作用有抑菌作用需前處理不需前處理樣品無抑菌作用有抑菌作用需前處理不需前處理樣品需要驗(yàn)證的重點(diǎn)環(huán)節(jié)驗(yàn)證實(shí)際上伴隨著整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程，實(shí)驗(yàn)過程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)均應(yīng)有合理的證明（驗(yàn)證），保證其對(duì)結(jié)果判斷沒有影響。前處理方法直接影響后續(xù)步驟的效果和重現(xiàn)性，應(yīng)在驗(yàn)證范圍內(nèi)。已有標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程（SOP）和充足實(shí)驗(yàn)證明的前處理方法可以直接采用，但出現(xiàn)疑問應(yīng)進(jìn)一步研究提高。供試品中抗菌活性的去除是當(dāng)前驗(yàn)證工作的重點(diǎn)。尤其強(qiáng)調(diào)應(yīng)充分驗(yàn)證供試品本身對(duì)微生物生長的影響。驗(yàn)證的類型

前驗(yàn)證:建立藥品的無菌檢查法時(shí)，需對(duì)供試品的抑細(xì)菌和抑真菌特性及無菌檢查方法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證再驗(yàn)證:修訂的檢驗(yàn)方法;供試品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，應(yīng)重新驗(yàn)證；定期的方法驗(yàn)證.供試品中抗菌活性的去除稀釋法：降低供試品的相對(duì)濃度薄膜法：利用體積差異分離中和法：利用化學(xué)（生物）專屬性滅活離心法：利用沉降系數(shù)差異分離抗菌活性去除效果的檢驗(yàn)應(yīng)根據(jù)供試品的特點(diǎn)，選擇敏感菌株，對(duì)供試品抗菌活性去除效果加以檢驗(yàn)再按藥典要求全面驗(yàn)證，提高效率。選擇敏感菌株間接方法：文獻(xiàn)、技術(shù)資料（可靠）直接方法：預(yù)實(shí)驗(yàn)（個(gè)體抑菌實(shí)驗(yàn)）參考選擇：一般中藥選擇枯草和金黃；抗生素根據(jù)抗菌譜選擇。選擇適宜的方法可靠、穩(wěn)定、簡便參考方法：在樣品許可的條件下薄膜過濾，沖洗

什么時(shí)候不驗(yàn)證已經(jīng)驗(yàn)證過的、體系中沒有變化因素的不用驗(yàn)證的參照質(zhì)量體系中其他項(xiàng)目的執(zhí)行情況驗(yàn)證以后怎么辦按驗(yàn)證確立的方法進(jìn)行供試品的無菌檢查。驗(yàn)證資料的審查、復(fù)核與采納。方法驗(yàn)證與無菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)建設(shè)。結(jié)果總結(jié)與報(bào)告綜合分析實(shí)驗(yàn)中遇到的所有情況，最終形成一份詳細(xì)、嚴(yán)謹(jǐn)、具有可操作性的驗(yàn)證報(bào)告。給出該品種的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)規(guī)程，以及各方法操作的關(guān)鍵點(diǎn)，以供檢驗(yàn)參考。方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)報(bào)告—標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)文件。下次見！無菌檢查方法的驗(yàn)證

驗(yàn)證的目的:

在于確認(rèn)（尋找）一種有效的檢驗(yàn)方法，如果樣品（藥品）中有一定數(shù)量的微生物存在，那么采用此法可以使得樣品（藥品）中的微生物得以檢出。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)條件檢驗(yàn)方法

樣品量

檢驗(yàn)規(guī)程稀釋液種類及體積SOP

中和劑

培養(yǎng)基

培養(yǎng)時(shí)間

培養(yǎng)溫度影響無菌檢驗(yàn)的因素樣品/藥品本身的特殊性樣品/藥品中添加的防腐/抑菌劑培養(yǎng)基的特性培養(yǎng)條件人員因素驗(yàn)證試驗(yàn)可在供試品的無菌檢查之前或與供試品的無菌檢查同時(shí)進(jìn)行。當(dāng)同時(shí)進(jìn)行時(shí)，若驗(yàn)證試驗(yàn)失敗，那么供試品的無菌檢查結(jié)果是不成立的。菌種的要求：不得超過5代。采用適宜的方法保存。驗(yàn)證用菌株：金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉。選擇的原則:代表性,普遍性,易存活、低或非致病性,標(biāo)準(zhǔn)菌株(或該藥品中常見的污染菌)。菌液制備：同培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)方法加菌量:＜100cfu。驗(yàn)證方法：薄膜過濾法

將規(guī)定量的供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗(yàn)菌、過濾。取出濾膜接種至相應(yīng)的培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積相同培養(yǎng)基的容器，加入等量的試驗(yàn)菌，作為陽性對(duì)照，按規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5天。各試驗(yàn)菌同法操作。結(jié)果判斷：與對(duì)照管比較，如含供試品各管中的試驗(yàn)菌均生長良好，則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用。按此法進(jìn)行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用?？刹捎迷黾記_洗量，增加培養(yǎng)基的用量，使用中和劑或滅活劑；更換濾膜品種等方法消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。無菌操作過程對(duì)消除抑菌有很大關(guān)系各方法組合運(yùn)用，效果更佳！樣品處理

主要強(qiáng)調(diào)固體樣品的溶解、轉(zhuǎn)移、均勻分配問題。通常將規(guī)定取樣量全部轉(zhuǎn)移到400～500ml稀釋劑或者適宜溶液，再進(jìn)行分配。沖洗方法

強(qiáng)調(diào)少量多次：50ml/次；強(qiáng)調(diào)充分振搖；操作細(xì)節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，如集菌儀轉(zhuǎn)速、沖洗過程中蓋還是不蓋濾筒下口等等。菌液加入

菌液組、供試品加菌液組嚴(yán)格一致。

無菌檢查法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)中和劑加入

不同中和劑加入方式可能效果不一樣。直接加入培養(yǎng)基中效果最好。但如果某些中和劑對(duì)微生物生長不利可考慮其他步驟加入。菌液加入按規(guī)定應(yīng)在最后一次沖洗液中加入陽性菌液，主要是考慮過濾器的有效性。而驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)主要考慮濾膜/濾器殘留抗菌物質(zhì)對(duì)陽性菌生長的影響，可以與對(duì)照濾筒比較而做出判斷，所以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中加菌時(shí)機(jī)與方式只要與對(duì)照一致即可。無菌檢查方法驗(yàn)證

通過驗(yàn)證最終確定：樣品檢驗(yàn)量，稀釋液類型、用量及樣品濃度，薄膜過濾器類型，沖洗液類型及沖洗次數(shù)，酶的濃度、加酶量及加酶方式，陽性對(duì)照菌，培養(yǎng)基生產(chǎn)單位、配制、消毒及用量，培養(yǎng)溫度與時(shí)間等。無菌檢查方法驗(yàn)證為了考察檢驗(yàn)方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，驗(yàn)證時(shí)，至少需準(zhǔn)備3個(gè)不同批次的同類樣品，3名不同實(shí)驗(yàn)人員分別進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)。一旦驗(yàn)證合格，無菌檢查方法必須嚴(yán)格按照驗(yàn)證合格的程序進(jìn)行，涉及到培養(yǎng)基的生產(chǎn)單位、配制、滅菌及用量，稀釋液、沖洗液的種類、配制、滅菌及用量，青霉素酶的濃度、加入量、加入方式，菌液制備及計(jì)數(shù)方式，集菌器的規(guī)格型號(hào)、生產(chǎn)單位，集菌儀，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時(shí)間等均應(yīng)與驗(yàn)證時(shí)所用的儀器設(shè)備及物料一致。驗(yàn)證試驗(yàn)應(yīng)注意的問題樣品的選擇（是否有抑菌性）樣品必須無菌合格供試液濃度的選擇（濃度不能太高）充分振蕩試驗(yàn)菌株測(cè)試的順序（先驗(yàn)證敏感菌）菌液的加法（最后一次沖洗液加入）培養(yǎng)基的用量三次平行試驗(yàn)驗(yàn)證試驗(yàn)記錄總的要求：詳細(xì)、嚴(yán)謹(jǐn)、可操作性供試品信息檢驗(yàn)數(shù)量和檢驗(yàn)量：按照無菌檢查的量確定供試品處理、供試品溶液的制備檢驗(yàn)方法（選擇直接接種法說明理由）實(shí)驗(yàn)用菌：代數(shù)、稀釋級(jí)、計(jì)數(shù)培養(yǎng)基信息檢驗(yàn)條件：主要是沖洗條件（沖洗液、沖洗次數(shù)、量，必要時(shí)說明濾膜材質(zhì)、儀器、泵速等條件）。需要中和、酶處理等特殊處理方法的需說明逐日記錄各菌的生長情況驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)論采用的方法：薄膜過濾法/直接接種法供試品檢驗(yàn)量及處理、制備情況關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)點(diǎn)：如沖洗條件、中和、酶處理等因素。陽性對(duì)照菌的選擇薄膜過濾法加菌的時(shí)機(jī)按規(guī)定應(yīng)在最后一次沖洗液中加入陽性菌液，而驗(yàn)證試驗(yàn)主要考慮濾膜/濾器殘留抗菌物質(zhì)對(duì)陽性菌的生長的影響，可以與對(duì)照濾器比較而作出判斷，所以驗(yàn)證試驗(yàn)中加菌時(shí)機(jī)與方式只要與對(duì)照一致即可。驗(yàn)證及資料中常見的問題薄膜過濾法濾膜材質(zhì)選擇普通濾膜有機(jī)膜低吸附濾膜1.根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。2.應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。3.采用全封閉過濾器注意觀察膜的狀態(tài)，某些油性供試品或采用蓖麻油等作為溶媒的供試品可以損傷普通濾膜。敏感菌株與陽性對(duì)照菌陽性對(duì)照菌不是驗(yàn)證試驗(yàn)選定的敏感菌株問題：降低了陽性對(duì)照菌的意義，實(shí)際工作中抑制枯草芽孢桿菌的樣品很多（敏感菌株），但陽性對(duì)照只能選擇金黃色葡萄球菌。稀釋液選擇的問題藥典附錄無菌檢查法規(guī)定的稀釋液和沖洗液只有2種，即0.1%蛋白胨水溶液和PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液。但各藥品項(xiàng)下卻規(guī)定用0.9%的氯化鈉溶液做為稀釋液，采用經(jīng)驗(yàn)證合格的適宜的溶液作為稀釋劑、沖洗液。理論上使用0.1%蛋白胨水溶液和PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液做為稀釋液和沖洗液效果更好，因?yàn)檫@2種溶液具有修復(fù)已損傷的微生物的作用，可以提高檢出率。薄膜過濾法和直接接種法如：一般供試品（無特殊說明）采用直接接種法某廠家胸腺五肽注射液為普通注射劑，完全可以采用薄膜過濾法，生產(chǎn)單位進(jìn)行的無菌檢查驗(yàn)證法為直接接種法。也有的廠家把兩種方法的驗(yàn)證都寫上，結(jié)論中也沒有說明采用那種方法。無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法，只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過濾法。修訂：改為薄膜過濾法重新進(jìn)行驗(yàn)證。問題：方法選擇錯(cuò)誤問題：沖洗條件、沖洗量的選擇有些驗(yàn)證資料中，對(duì)非抑菌性供試品也采用大量的沖洗，100ml/次*10次/膜，增加了出現(xiàn)誤差的機(jī)會(huì)。1.對(duì)膜的損傷2.檢驗(yàn)方法繁瑣，大大增加檢驗(yàn)人員的工作量（檢驗(yàn)要按照已經(jīng)驗(yàn)證的方法進(jìn)行）3.驗(yàn)證試驗(yàn)方法選擇總的原則是由易到難沖洗不一定為100ml/次，可少量多次，如50ml/次，注意充分振搖。對(duì)于抑菌性較強(qiáng)的供試品，可以先用適宜的稀釋液稀釋后再過濾，以減少膜的吸附,減少?zèng)_洗量。如：抗生素品種取規(guī)定量，混合至含適量稀釋液（如500ml等)的無菌容器中，然后再過濾。對(duì)于抑菌性較強(qiáng)的注射用無菌粉末或固體原料，一定要充分溶解、混合均勻。抗菌藥可以根據(jù)其抗菌譜選擇敏感菌先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，找到合適的條件再進(jìn)行其他菌的實(shí)驗(yàn)。采用開放式薄膜過濾器：濾膜分成幾份與取樣量、沖洗條件的選擇有關(guān)，建議盡量與無菌檢查法一致（最常見為3等分）。方法描述不夠詳細(xì)，沒有可操作性如：某產(chǎn)品驗(yàn)證資料內(nèi)容“將規(guī)定量的供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入小于100CFU的試驗(yàn)菌，過濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)集中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒中”。驗(yàn)證的目的是為了“照此檢查法和檢查條件進(jìn)行供試品的無菌檢查”，方法確立后，以后該產(chǎn)品就可以采用該方法進(jìn)行檢驗(yàn)。修訂：應(yīng)記錄取樣量、（稀釋方法）、沖洗液、沖洗量（沖洗條件）等。無菌檢查方法驗(yàn)證操作過程

供試品溶液制備：取無菌供試品約10g，用無菌注射器吸取適量pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液將其溶解，全量移至500ml的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，充分溶解搖勻后制成2%青霉素鈉供試品溶液。無菌檢查方法驗(yàn)證操作過程沖洗量確定：根據(jù)供試品的特性首先選擇對(duì)供試品敏感的菌確定沖洗量，同時(shí)確定陽性對(duì)照菌。將供試品溶液按薄膜過濾法過濾，并用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗量約為100ml，共沖洗3次，并在最后一次沖洗液中加入小于100cfu的菌，然后在濾筒中加入100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，放置30-35℃恒溫室培養(yǎng)5天觀察結(jié)果；另取上述供試品溶液，按以上方法操作，但沖洗次數(shù)為4次（每次100ml），同時(shí)進(jìn)行陽性對(duì)照。無菌檢查方法驗(yàn)證操作過程沖洗量（ml）培養(yǎng)時(shí)間（天）123450

300

400

陽性對(duì)照

-+-+----++++++++++++

無菌檢查方法驗(yàn)證操作過程

A組（試驗(yàn)組）將供試品溶液按薄膜過濾法過濾，并用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗量約為100ml，共沖洗4次，并在最后一次沖洗液中逐一加入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、生孢梭菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉，最后在4個(gè)加有細(xì)菌的濾筒中分別加入100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，放置30-35℃恒溫室培養(yǎng)5天觀察結(jié)果；在2個(gè)加有真菌的濾筒中分別加入100ml改良馬丁培養(yǎng)基，放置23-28℃恒溫室培養(yǎng)5天觀察結(jié)果。培養(yǎng)基中加青霉素酶，每100ml培養(yǎng)基加2ml酶。無菌檢查方法驗(yàn)證操作過程

B組（緩沖液對(duì)照組）不加供試品，用等量500mlpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試品溶液，操作同A組（試驗(yàn)組）。C組（陽性對(duì)照組）

取4個(gè)裝有100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的濾筒，逐一加入與A組（試驗(yàn)組）等量的金黃色葡萄球菌、生孢梭菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌，放置30-35℃恒溫室培養(yǎng)5天觀察結(jié)果；取2個(gè)裝有100ml改良馬丁培養(yǎng)基的濾筒，逐一加入與等A組（試驗(yàn)組）量的白色念珠菌、黑曲霉，放置23-28℃恒溫室培養(yǎng)5天觀察結(jié)果。D組（陰性對(duì)照組）同供試品無菌檢查，陰性對(duì)照均應(yīng)無菌生長。驗(yàn)證時(shí)為了保證實(shí)驗(yàn)的成功率，最好首先進(jìn)行B組（緩沖液對(duì)照組），C組（陽性對(duì)照組），D組（陰性對(duì)照組）三組實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證因?yàn)橄♂寗?duì)照組實(shí)驗(yàn)不符合要求，那么試驗(yàn)組也就沒意義了，所以必須是稀釋劑對(duì)照組符合要求后，試驗(yàn)組才能進(jìn)行。

無菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果分析結(jié)果分析：陰性對(duì)照均呈陰性，驗(yàn)證方有效。說明本次驗(yàn)證所用供試品及相關(guān)物品均無菌，且驗(yàn)證操作正確，無污染事件發(fā)生。如果A組與B組的微生物生長數(shù)量和生長時(shí)間一致，表明該樣品的預(yù)處理方式能有效消