人感染高致病性禽流感標(biāo)本采集及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方

附件2人感染高致病性禽流感標(biāo)本采集及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案為及時(shí)、科學(xué)地采集和運(yùn)送人禽流感病例或疑似污染環(huán)境等各種類型的標(biāo)本，規(guī)范實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)程序和檢測(cè)方法，提高檢測(cè)質(zhì)量，明確診斷或開展相關(guān)科學(xué)研究，特制定本方案。1采集對(duì)象人禽流感醫(yī)學(xué)觀察病例、疑似病例、臨床診斷病例及需要進(jìn)一步研究的確診病例。其它需要進(jìn)行人禽流感診斷或排除者。13需要采集的環(huán)境標(biāo)本。2采集要求從事人禽流感檢測(cè)標(biāo)本采集的技術(shù)人員必須經(jīng)過生物安全培訓(xùn)和具備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技能。在標(biāo)本采集過程中，采樣人員參照（附件5）規(guī)定的防護(hù)措施進(jìn)行安全防護(hù)。住院病例的標(biāo)本由所在醫(yī)院醫(yī)護(hù)人員在當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制機(jī)構(gòu)專業(yè)人員指導(dǎo)下采集。標(biāo)本采集具體種類和數(shù)量由現(xiàn)場(chǎng)工作組確定。密切接觸者標(biāo)本由當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)采集。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作的需要，結(jié)合病程再次采樣。3標(biāo)本種類每個(gè)病例應(yīng)盡可能同時(shí)采集上、下呼吸道標(biāo)本；需要排除人禽流感的死亡病例則依據(jù)《傳染病病人或疑似傳染病病人尸體解剖查驗(yàn)規(guī)定》（中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部令第43號(hào)）的規(guī)定采集尸體標(biāo)本，沒有條件進(jìn)行尸體解剖的，可采集呼吸道灌洗液或經(jīng)皮穿刺采集肺組織標(biāo)本。上呼吸道標(biāo)本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液、深咳痰液。最佳采集時(shí)間為發(fā)病后3天內(nèi)。下呼吸道標(biāo)本：包括呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺組織活檢標(biāo)本。尸檢標(biāo)本：病人死亡后應(yīng)依法盡早進(jìn)行解剖，在嚴(yán)格按照生物安全防護(hù)的條件下，進(jìn)行尸檢，主要采集肺、氣管組織標(biāo)本，條件允許下也可采集肝、腎、脾、心臟、腦、淋巴結(jié)等組織標(biāo)本。血清標(biāo)本：每一病例必須采集血清標(biāo)本，須采集急性期、恢復(fù)期雙份血清。第一份血清應(yīng)盡早（最好在發(fā)病后7天內(nèi)）采集，第二份血清應(yīng)在發(fā)病后第3~4周采集。采集量要求5ml,以空腹血為佳,建議使用真空采血管。其它標(biāo)本:如果病例有腹瀉癥狀，可在發(fā)病后采集糞便標(biāo)本；有胸水者可采集胸水標(biāo)本。4標(biāo)本采集方法咽拭子：用2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時(shí)擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將拭子頭浸入含3ml采樣液的管中，尾部棄去，旋要筲主鼻拭子：將1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處，停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)退出。取另一根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子以同樣的方法采集另一側(cè)鼻孔。上述兩根拭子浸入同一含3ml采樣液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負(fù)壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。將收集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采樣液沖洗收集器1次（亦可用小孩導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來替代收集器X咽漱液：用10ml不含抗菌素的采樣液漱口。漱口時(shí)讓患者頭部微后仰，發(fā)〃噢〃聲，讓洗液在咽部轉(zhuǎn)動(dòng)。然后將咽漱液收集于50ml無菌的螺口塑料管中。無條件的可用平皿或燒杯收集咽漱液并轉(zhuǎn)入10ml螺口采樣管中。深咳痰液：要求病人深咳后,將咳出的痰液收集于50ml含3ml采樣液的螺口塑料管中。呼吸道灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm深處）,注入5ml生理鹽水，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出。收集抽取的粘液，并用采樣液涮洗收集器1次（亦可用小孩導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來替代收集）。胸水:在B超定位下進(jìn)行胸腔穿刺,抽取胸水5ml,置于無菌#的塑料螺口管中。肺組織活檢標(biāo)本：在超聲或X線定位下,經(jīng)皮穿刺腳市組織活檢標(biāo)本，置于含3ml采樣液的塑料螺口管中。尸檢標(biāo)本：每一采集部位分別使用不同消毒器械，以防交叉污染；每種組織應(yīng)多部位取材，各部位應(yīng)取20~50g,淋巴結(jié)取2個(gè)。糞便標(biāo)本：采集5~10g糞便置于含5~10ml采樣液無菌螺口管中，嚴(yán)格密封。血清標(biāo)本：用真空負(fù)壓采血管采集血液標(biāo)本5ml,室溫靜置30分鐘,1500~2000rpm離心10分鐘，收集血清于2ml無菌螺口塑料管中。注：常用的采樣液配方為：pH7.4~7.6的Hanks氏液或MEM/DMEM液。在采樣液中需加入抗菌素,可用青霉素（終濃度為100U/ml）、慶大霉素（終濃度為lmg/ml）和抗真菌藥物（終濃度為2|ig/ml）。5標(biāo)本包裝標(biāo)本采集后在生物安全口級(jí)實(shí)驗(yàn)室生物安全柜內(nèi)分裝成一式三份（分裝標(biāo)本的生物安全柜不能用于提取核酸）0一份當(dāng)?shù)貦z測(cè)用，一份送中國(guó)疾病預(yù)防控制中心檢測(cè)，一份保存以備復(fù)核。所有標(biāo)本應(yīng)放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有墊圈、耐冷凍的塑料管里，擰緊。容器外注明樣本編號(hào)、種類、姓名及采樣日期。將密閉后的標(biāo)本放入大小合適的塑料袋內(nèi)密封，每袋裝一份標(biāo)本。標(biāo)本有關(guān)信息填寫〃疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺炎病例標(biāo)本送檢單〃見《疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺炎病例標(biāo)本送檢、接收、檢測(cè)和結(jié)果報(bào)告反饋工作流程》（中疾控疾發(fā)[2005]526號(hào)），用另一塑料袋密封。6標(biāo)本保存用于病毒分離和核酸檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)盡快進(jìn)行檢測(cè),24小時(shí)內(nèi)能檢測(cè)的標(biāo)本可置于4（保存，24小時(shí)內(nèi)無法檢測(cè)的標(biāo)本則應(yīng)置于-7CTC或以下保存。如無-7CTC保存條件，則于-20（冰箱暫存。血清可在4℃存放3天、-2CTC以下長(zhǎng)期保存。標(biāo)本運(yùn)送期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。標(biāo)本應(yīng)設(shè)立專庫(kù)或?qū)９駟为?dú)保存。7標(biāo)本送檢上送標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性或可疑的原始標(biāo)本或分離物應(yīng)及時(shí)送中國(guó)疾病預(yù)防控制中心復(fù)核和進(jìn)一步檢測(cè)；省級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)陰性，且有明確流行病學(xué)證據(jù)的病例的標(biāo)本送中國(guó)疾病預(yù)防控制中心進(jìn)一步檢測(cè)。標(biāo)本運(yùn)送的生物安全要求按照《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》（國(guó)務(wù)院424號(hào)令）和《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》（中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部第45號(hào)令）等有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。標(biāo)本送檢的程序各市、州需要向省疾病預(yù)防控制中心送檢標(biāo)本時(shí)，應(yīng)事先與省疾病預(yù)防控制中心應(yīng)急辦公室聯(lián)系。具體要求見《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》（中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部第45號(hào)令）、《疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺炎病例標(biāo)本送檢、接收、檢測(cè)和結(jié)果報(bào)告反饋工作流程》（中疾控疾發(fā)[2005]526號(hào)）室生物安全從事人禽流感檢測(cè)的技術(shù)人員必須經(jīng)過生物安全培訓(xùn)和具備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技能，在檢測(cè)的過程中必須采取生物安全ni級(jí)防護(hù)。不同的標(biāo)本檢測(cè)生物安全級(jí)別要求如下。標(biāo)本的分裝和核酸提取在生物安全I(xiàn)I級(jí)實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，病毒培養(yǎng)物的核酸提取必須在生物安全ni級(jí)實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。標(biāo)本的抗原快速檢測(cè)在生物安全n級(jí)實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。人禽流感病毒的分離、鑒定必須在生物安全m級(jí)實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行。采用滅活抗原進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)血清抗體時(shí)，要求在生物安全n級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作。采用微量中和試驗(yàn)進(jìn)行血清抗體檢測(cè)必須在生物安全in級(jí)實(shí)驗(yàn)室操作。陽(yáng)性標(biāo)本和分離物的保存及銷毀應(yīng)按照《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》（國(guó)務(wù)院第424號(hào)令）執(zhí)行。9標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)核酸檢測(cè)：方法包括RT-PCR和Real-TimePCR,建議使用國(guó)家流感中心或世界衛(wèi)生組織推薦的引物和探針。抗原快速檢測(cè)方法包括ELISA法和金標(biāo)法,本方法僅具參考價(jià)值，不作為診斷依據(jù)。病毒分離及鑒定：采用SPF雞胚和MDCK細(xì)胞分離方法。病毒的鑒定采用血凝抑制試驗(yàn)、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)或序列測(cè)定。血清學(xué)檢測(cè)：方法包括微量中和試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)、單擴(kuò)溶血試驗(yàn)。以上實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法詳見《全國(guó)流感/人感染高致病性禽流感監(jiān)測(cè)實(shí)施方案》。10檢測(cè)結(jié)果的判斷和報(bào)告各檢測(cè)項(xiàng)目陽(yáng)性報(bào)告H5基因核酸檢測(cè)：A型特異性引物能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的產(chǎn)物，兩對(duì)H5亞型特異性引物都能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的產(chǎn)物。抗原快速檢測(cè)：按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果判斷為陽(yáng)性。病毒分離及鑒定：分離出病毒,并經(jīng)鑒定為H5亞型或H5N1迪。血清學(xué)檢測(cè)：雙份血清抗體滴度4倍或以上增高有診斷意義。各檢測(cè)項(xiàng)目陰性報(bào)告H5基因核酸檢測(cè)：兩對(duì)H5亞型特異性引物均不能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的產(chǎn)物。抗原快速檢測(cè)：按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果判斷為陰性。病毒分離：培養(yǎng)物紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)陰性。血清學(xué)檢測(cè)：血清抗體滴度＜1:20為陰性。

H5基因核酸檢測(cè)不一致兩對(duì)H5亞型特異性引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果不一致時(shí),則對(duì)陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，如果為H5N1病毒序歹I」，則判斷為陽(yáng)性。標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果有關(guān)信息填寫〃人感染高致病性禽流感標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果反饋表〃（具體見《疑似人感染高致病性禽流感/不明原因肺炎病例標(biāo)本送檢、接收、檢測(cè)和結(jié)果報(bào)告反饋工作流程》中疾控疾發(fā)[2005]526號(hào)）11實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)流程應(yīng)采集人禽流感檢測(cè)對(duì)象上呼吸道標(biāo)本和下呼吸道標(biāo)本進(jìn)行禽流感病毒的核酸檢測(cè)和病毒分離，同時(shí)要采集病例的急性期和恢復(fù)期血清標(biāo)本進(jìn)行H5N1亞型特異性抗體檢測(cè)。原則上，先由省級(jí)及以下疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)進(jìn)行初步檢測(cè)，陽(yáng)性標(biāo)本送中國(guó)疾病預(yù)防控制中心復(fù)核；省級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)陰性，且有明確流行病學(xué)證據(jù)的病例標(biāo)本送中國(guó)疾病預(yù)防控制中心進(jìn)一步檢測(cè)。具體步驟見人感染高致病性禽流感標(biāo)本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)流程圖。12省疾病預(yù)防控制中心人禽流感實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)職責(zé)對(duì)轄區(qū)內(nèi)人禽流感標(biāo)本的采集工作提供技術(shù)指導(dǎo)和物質(zhì)支持，必要時(shí)直接參與標(biāo)本的采集。按照生物安全要求，對(duì)采集到的標(biāo)本進(jìn)行禽流感病毒的核酸檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)和抗原檢測(cè)。獲得國(guó)家認(rèn)證的生物安全m級(jí)實(shí)驗(yàn)室才可開展病毒分離和微量中和試驗(yàn)。12.3按照生物安全要求妥善保存原始標(biāo)本或￥與流感病毒株。12.3按照生物安全要求妥善保存原始標(biāo)本或￥與流感病毒株。符合上送條件的標(biāo)本或毒株按規(guī)定及時(shí)送中國(guó)疾病預(yù)防控制中心。及時(shí)向省衛(wèi)生廳和中國(guó)疾病預(yù)防控制中心上報(bào)人禽