谷氨酸生產課件

第三章谷氨酸生產菌的特征、育種及擴大培養(yǎng)第三章

谷氨酸生產菌的特征、育種及擴大培養(yǎng)1谷氨酸生產菌的主要特征與菌學性質

現有谷氨酸生產菌主要是棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬及節(jié)桿菌屬中的細菌。

1.1棒狀桿菌屬(Corynebacterium)

直到微彎的桿菌，一端膨大呈棒狀，折斷分裂形成“八”字形或柵狀排列。G+1.2短桿菌屬(Brevibacterium)

短的不分枝直桿菌。G+1.3小桿菌屬(Microbacterium)桿狀，與棒桿菌相似。G+1.4節(jié)桿菌屬(Arthrobacterium)

培養(yǎng)過程中，球菌桿菌，桿菌球菌。G+G-,G-G+

第三章

谷氨酸生產菌的特征、育種及擴大培養(yǎng)2國內谷氨酸生產菌及其比較

2.1北京棒桿菌(AS1299)的形態(tài)和生理特征(1)形態(tài)特征

短桿至小棒狀，有時微彎曲，兩端鈍圓，不分枝，呈多種形態(tài)。

單個、成對及“V”字形排列。G+。胞內有橫隔。不運動。無芽孢。第三章

谷氨酸生產菌的特征、育種及擴大培養(yǎng)2國內谷氨酸生產菌及其比較

2.1北京棒桿菌(AS1299)的形態(tài)和生理特征(3)生理特征★對氧的要求：好氧及兼性厭氧?！锱c溫度的關系：菌株26~37℃培養(yǎng)生長良好，不耐高溫，41℃生長較弱。★pH的影響：Ph5~10均能生長，最適pH6~7.5。★還原硝酸鹽：反映強烈。★石蕊牛奶培養(yǎng)：7d后微產堿?！锊凰獾矸??！锊环纸饫w維素?！镫迕冈囼灒簭婈栃苑磻??！锂a酸物質的測定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖★生長因素試驗：生物素是必需生長因素。硫胺素明顯促生長。第三章

谷氨酸生產菌的特征、育種及擴大培養(yǎng)2國內谷氨酸生產菌及其比較

2.2鈍齒棒桿菌(AS1542)的形態(tài)和生理特征

(1)形態(tài)特征

短桿至棒狀，有時微彎曲，兩端鈍圓，不分枝。

單個、成對及“V”字形排列。

折斷分裂。G+。胞內有橫隔。不運動。無芽孢。第三章

谷氨酸生產菌的特征、育種及擴大培養(yǎng)2國內谷氨酸生產菌及其比較

2.2鈍齒棒桿菌(AS1542)的形態(tài)和生理特征

(2)培養(yǎng)特征★普通肉汁瓊脂斜面：中間劃直線培養(yǎng)，中度生長，菌胎線狀，近草黃色，表面濕潤、無光澤，無黏性，不產生水溶性色素?！锲胀ㄈ庵傊桨澹壕鋱A形，近草黃色，

表面濕潤、光滑，無光澤，邊緣頓齒狀，較薄，半透明，無黏性，不產生水溶性色素。★普通肉汁液體培養(yǎng)：稍渾濁，表面有薄菌膜，底部有較多沉渣。★普通肉汁瓊脂穿刺：表面及沿穿刺線生長，且不向四周擴散?！锩髂z穿刺培養(yǎng)：表面及沿穿刺線生長。不液化明膠。★馬鈴薯塊：培養(yǎng)三周仍不生長。第三章

谷氨酸生產菌的特征、育種及擴大培養(yǎng)2國內谷氨酸生產菌及其比較

2.3天津短桿菌(T613)的形態(tài)和生理特征(1)形態(tài)特征

典型的短桿狀，有時微彎曲，兩端稍鈍圓，不分枝。

單個、成對及“V”字形排列。

折斷分裂。G+。不運動。無芽孢。第三章

谷氨酸生產菌的特征、育種及擴大培養(yǎng)2國內谷氨酸生產菌及其比較

2.3天津短桿菌(T613)的形態(tài)和生理特征(2)培養(yǎng)特征★普通肉汁瓊脂斜面：中間劃直線培養(yǎng)，中度生長，菌胎線狀、隆起，淺黃色，表面濕潤、有光澤，不透明，不產生水溶性色素?！锲胀ㄈ庵傊桨澹壕鋱A形，淺黃色，

表面濕潤、光滑，隆起，邊緣整齊，較薄，半透明，無黏性，不產生水溶性色素?！锲胀ㄈ庵后w培養(yǎng)：渾濁，沒有菌蓋，表面沿管壁有一圈菌膜，底部有棉絮狀和粒狀沉渣?！锲胀ㄈ庵傊┐蹋罕砻姘l(fā)育良好，沿穿刺線生長較弱，且不向四周擴散?！锩髂z穿刺培養(yǎng)：表面發(fā)育良好，沿穿刺線生長不明顯，不液化明膠?！锺R鈴薯塊：培養(yǎng)15d仍不生長。第三章

谷氨酸生產菌的特征、育種及擴大培養(yǎng)2國內谷氨酸生產菌及其比較

2.3天津短桿菌(T613)的形態(tài)和生理特征(3)生理特征★對氧的要求：好氧及兼性厭氧?！锱c溫度的關系：菌株26~37℃培養(yǎng)生長良好，75℃處理10min不再生長?！飌H的影響：pH6~10生長良好，pH5生長微弱，pH4和pH11已不能生長。★還原硝酸鹽：反映強烈?！锊凰獾矸邸！锊环纸饫w維素?！镫迕冈囼灒簭婈栃苑磻?。★產酸物質的測定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、水楊苷、七葉靈★生長因素試驗：生物素是必需生長因子。硫胺素是促生長作用。第三章

谷氨酸生產菌的特征、育種及擴大培養(yǎng)2國內谷氨酸生產菌及其比較

2.5天津短桿菌(T613)與鈍齒桿菌(B9)的比較

T613感染噬菌體時，不能換用B9，調換7338.第三章

谷氨酸生產菌的特征、育種及擴大培養(yǎng)2國內谷氨酸生產菌及其比較

2.6目前味精行業(yè)采用的主要菌株鈍齒棒桿菌B9和天津短桿菌TG-866是我國味精行業(yè)生產上的重要菌種。

二者融合子F263.

S9114華南理工大學

FD415上海復旦大學

TG961天津科技大學第三章

谷氨酸生產菌的特征、育種及擴大培養(yǎng)3谷氨酸生產菌在發(fā)酵過程中的形態(tài)變化

3.1種子的菌體形態(tài)

斜面和一、二級種子在不同培養(yǎng)條件下，細胞形態(tài)基本相似。斜面培養(yǎng)的菌體較細小,一、二級種子比斜面菌體大而粗壯,革蘭氏染色深。多為短桿至棒桿狀,有的微呈彎曲狀,兩端鈍圓,無分枝;細胞排列呈單個、成對及“V”字形,有柵狀或不規(guī)則聚塊;分裂的細胞大小為0.7～0.9*1.0～3.4um。由于生物素充足,繁殖的菌體細胞均為谷氨酸非積累型細胞。

第三章

谷氨酸生產菌的特征、育種及擴大培養(yǎng)3谷氨酸生產菌在發(fā)酵過程中的形態(tài)變化

3.3谷氨酸發(fā)酵感染噬菌體后的菌體形態(tài)

發(fā)酵前期感染噬菌體后,菌體細胞明顯減少,細胞不規(guī)則,發(fā)圓、發(fā)胖,缺乏"Ｖ"字形排列,有明顯的細胞碎片,嚴重時出現拉絲、拉網,互相堆在一起,幾乎找不到完整的菌體細胞,類似蛛網或魚翅狀。

在發(fā)酵中、后期感染噬菌體后,菌體細胞形態(tài)不規(guī)則,邊緣不整齊,有的邊緣似乎有許多毛刺狀的東西,有細胞碎片

。第三章

谷氨酸生產菌的特征、育種及擴大培養(yǎng)4谷氨酸發(fā)酵的代謝控制育種

4.1日常菌種工作

定期分純小劑量誘變刺激高產菌制作安瓿管4.2選育耐高滲透壓菌種

耐高糖突變株耐高谷氨酸突變株耐高糖、高谷氨酸突變株

第三章

谷氨酸生產菌的特征、育種及擴大培養(yǎng)4谷氨酸發(fā)酵的代謝控制育種

4.3選育不分解利用谷氨酸的突變株

4.4選育細胞膜滲透性好的突變株

生物素亞適量、吐溫-60、青霉素、溫度敏感株4.5選育強化CO2固定反應的突變株

CO2固定產四碳二羧酸，則糖酸轉化率81.7%4.6選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株

4.7選育強化三羧酸循環(huán)中從檸檬酸到α-酮戊二酸代謝的突變株

4.8選育解除谷氨酸對谷氨酸脫氫酶反饋調節(jié)的突變株

耐谷氨酸、谷氨酸結構類似物、谷氨酰胺抗性突變株4.9選育強化能量代謝的突變株2.解除菌體自身的反饋調節(jié)

⑴選育耐高滲透壓突變株

要使菌種能高產谷氨酸,首先要使菌種具備在高糖、高谷氨酸的培養(yǎng)基中仍能正常生長、代謝的能力，即在高滲培養(yǎng)基中菌體的生長和谷氨酸的合成不受影響或影響很小。這可通過選育耐高糖、耐高谷氨酸及耐高糖+高谷氨酸突變株來實現。

⑵選育解除谷氨酸對谷氨酸脫氫酶反饋調節(jié)的突變株

當谷氨酸合成達到一定量時，谷氨酸就會反饋抑制和阻遏谷氨酸脫氫酶，使谷氨酸的合成停止，使代謝轉向天冬氨酸的合成。若解除了谷氨酸對谷氨酸脫氫酶的反饋調節(jié)，菌體就會不斷的合成谷氨酸。這可通過選育酮基丙二酸抗性、谷氨酸結構類似物抗性（如谷氨酸氧肟酸鹽）、谷氨酰胺抗性突變株來實現。

GOBACK3.增加前體物的合成

⑴選育強化三羧酸循環(huán)中從檸檬酸到α-酮戊二酸代謝的突變株

這可通過選育檸檬酸合成酶活力強突變株及抗氟乙酸、氟化鈉、重氮絲氨酸、氟檸檬酸等突變株來實現。

⑵選育強化CO2固定反應的突變株

這可通過選育以琥珀酸或蘋果酸為唯一碳源生長良好的突變株、氟丙酮酸敏感突變株以及丙酮酸或天冬氨酸缺陷突變株來實現。

GOBACK4.提高細胞膜的滲透性

⑴選育抗Vp類衍生物突變株

選育抗Vp類衍生物，如香豆素、盧丁等突變株，都能遺傳性的改變細胞膜的滲透性。

⑵選育溶菌酶敏感突變株。

⑶選育二氨基庚二酸缺陷突變株。

⑷選育溫度敏感突變株

谷氨酸溫度敏感突變株的突變位置是在決定與谷氨酸分泌有密切關系的細胞膜結構基因上，發(fā)生堿基的轉換或顛換，一個堿基為另一個堿基所置換，這樣為該基因所指導的酶，在高溫下失活，導致細胞膜某些結構的改變。當控制培養(yǎng)溫度為最適生長溫度時，菌體正常生長；當溫度提高到一定程度時，菌體便停止生長而大量產酸。

GOBACK6.其它遺傳標記

據報道，選育異亮氨酸缺陷、蛋氨酸缺陷、苯丙氨酸缺陷、AEC抗性、AHV抗性、棕櫚酰谷氨酸敏感等突變株，都可不同程度的提高谷氨酸的產酸率。

GOBACK

⑴優(yōu)先合成

谷氨酸比天冬氨酸優(yōu)先合成，谷氨酸合成過量后，抑制和阻遏自身的合成途徑，使代謝轉向合成天冬氨酸。

⑵谷氨酸脫氫酶(GDH)的調節(jié)

谷氨酸對谷氨酸脫氫酶存在著反饋阻遏和反饋抑制。

⑶檸檬酸合成酶的調節(jié)

檸檬酸合成酶受能荷調節(jié)、谷氨酸的反饋阻遏和順烏頭酸的反饋抑制。

⑷異檸檬酸脫氫酶的調節(jié)

細胞內α-酮戊二酸的量與異檸檬酸的量需維持平衡。當α-酮戊二酸過量時,將對異檸檬酸脫氫酶發(fā)生反饋抑制作用,停止合成α-酮戊二酸。

⑸α-酮戊二酸脫氫酶在谷氨酸產生菌中先天性的喪失或微弱。

⑹磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反饋抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反饋阻遏。

GOBACK第三章

谷氨酸生產菌的特征、育種及擴大培養(yǎng)5利用生物工程新技術選育谷氨酸生產菌

5.1原生質體融合5.1.1操作步驟⑴標記菌株的選擇⑵原生質體的制備⑶原生質體的再生⑷原生質體的融合⑸融合子的選擇⑹實用性菌株的篩選第三章

谷氨酸生產菌的特征、育種及擴大培養(yǎng)5利用生物工程新技術選育谷氨酸生產菌

5.1原生質體融合5.1.2成功實例⑴融合子F263

鈍齒棒桿菌B9(細胞個體大、易于提?。划a酸率低)天津短桿菌TG-866(產酸率高)

融合子F263(細胞個體大、產酸率高)⑵融合子FTN9108T613NTG誘變TN63(寡霉素抗性)TN115(氟乙酸抗性)融合子FTN9108(穩(wěn)定、產酸率提高)第三章

谷氨酸生產菌的特征、育種及擴大培養(yǎng)5利用生物工程新技術選育谷氨酸生產菌

5.2轉化法受體細胞直接吸收供體細胞的DNA片段，并將它整合到自己的基因組中，從而獲得了供體細胞部分遺傳性狀的現象。5.3轉導法通過溫和型噬菌體為媒介，將供體細胞中的DNA片段攜帶到受體細胞中，從而獲得了供體細胞部分遺傳性狀的現象。第三章

谷氨酸生產菌的特征、育種及擴大培養(yǎng)5利用生物工程新技術選育谷氨酸生產菌

5.4重組DNA技術（基因工程）操作