SARS病原與檢測課件

SARS病原與檢測中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所闞飆SARS病原與檢測中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所闞飆引起肺炎的病原體細菌肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、甲型溶血性鏈球菌、肺炎克雷白桿菌、流感嗜血桿菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、腸桿菌屬一些細菌、變形桿菌、軍團菌、棒狀桿菌、梭狀桿菌等病毒腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、麻疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒、漢坦病毒、禽流感病毒、尼巴病毒、冠狀病毒等支原體肺炎支原體衣原體肺炎衣原體、鸚鵡熱衣原體真菌白色念珠菌、曲菌、放線菌等其它立克次體（Q熱立克次體等）、弓形蟲（鼠弓形蟲等)、原蟲（卡氏肺孢子蟲等）、寄生蟲類（肺包蟲、肺吸蟲、肺血吸蟲等）冠狀病毒屬血清分學分組及所致疾病血清分組病毒種和株宿主呼吸道疾病腸道疾病肝炎神經(jīng)系統(tǒng)感染其它HCoV-229E（人冠狀病毒229E株）人＋？TGEV（豬傳染性胃腸炎病毒）豬＋＋＋

ICCoV（犬冠狀病毒）狗＋FECoV（貓冠狀病毒）貓＋FIPV（貓傳染性腹膜炎病毒）貓＋＋＋＋RbCoV（兔冠狀病毒）兔＋＋HCoV-OC43（人冠狀病毒OC43株）人＋？？MHV（鼠肝炎病毒）小鼠＋＋＋＋

IIBCoV（牛冠狀病毒）牛＋＋TCoV（火雞冠狀病毒）火雞＋＋HEV豬＋＋＋

IIITCoV（火雞冠狀病毒）火雞＋＋IBV雞＋＋

SARS-CoV

引自賀福初主編.嚴重急性呼吸綜合征.科學出版社，2003.SARS病原體的發(fā)現(xiàn)與確證2002年11月，廣東出現(xiàn)SARS病人2003年3月15日，WHO組織國際研究網(wǎng)絡實驗室3月18日－20日，觀察到副粘病毒顆粒以及獲得相關序列3月21日，猴腎細胞培養(yǎng)獲得病毒分離物，并排除甲乙型流感病毒病毒、、呼吸道合胞病毒、副流感病毒1、2、3型、腺病毒、鼻病毒、腸道病毒、人間質(zhì)肺炎病毒等，報告發(fā)現(xiàn)衣原體顆粒3月22日，發(fā)現(xiàn)冠狀病毒樣顆粒3月23日，明確發(fā)現(xiàn)冠狀病毒顆粒和核酸片段，開始靈長類動物實驗3月24－4月11日，獲得更多的SARS病毒分離物、核酸片段序列，抗體檢測4月12日、14日，SARS冠狀病毒的全基因組序列公布4月16日，WHO宣布確認一種變異冠狀病毒引起SARS4月17日，利用動物實驗按科赫原則確定SARS病原體－SARScoronavirus“SARS的研究速度令人驚訝。由于全世界各國實驗室之間非同尋常的合作，我們現(xiàn)在肯定地知道誰是SARS的元兇?！保╓HO傳染病規(guī)劃執(zhí)行主任DavidHeymann博士）2003,348:1953-1966冠狀病毒顆粒結構FromNEnglJMed,2003,348:1948-1951.2003,348:1953-1966SARS病毒變異變異的意義？變異的方向？追蹤變異的意義病原基本特征結合流行病學分析尋找傳播鏈預測新的流行？疫苗設計標本運輸與儲存臨床采集的標本，宜盡快送至專業(yè)檢測實驗室，在運送抵達前的24-48小時內(nèi)，標本可4C冷藏（非福爾馬林固定的尸檢標本冷凍保存）。檢測實驗室內(nèi)長期保存，血液標本-20C冷凍保存，其它-70C保存。標本的生物安全操作采集與運輸標本管：螺旋蓋、密封，貼生物危險性提示標簽運輸過程中保證密封處理任何可能產(chǎn)生氣溶膠的操作均應在生物安全柜內(nèi)進行。操作者個人防護。二級生物安全（BSL-2）裝備內(nèi)進行的操作：血清和血標本的各種常規(guī)診斷性檢查。三級生物安全（BSL-2）室內(nèi)進行的操作：SARS病原體分離培養(yǎng)、濃縮標本中核酸提取動物接種醫(yī)務人員對SARS或疑似病人采樣時的個人防護口罩（符合N,R,P95/99/100,FFP2/3標準）、護目鏡、手套、隔離衣在沒有把握控制病毒泄漏（包括產(chǎn)生氣溶膠）的情況下，不能進行標本的操作SARS檢測及結果解釋檢測方法抗體（IgG/IgM)：－

ELISA(EnzymeLinkedImmunoSorbantAssay)酶聯(lián)免疫吸附實驗－IFA

(IndirectImmunoFluorescenceAssay)間接免疫熒光實驗核酸（RNA）：－RT-PCR（Reversedtranscription-PloymeraseChainReaction）

NestedPCR

real-timePCR－genechip病毒分離－細胞培養(yǎng)LaboratorycasedefinitionofSARS

ApersonwithsymptomsandsignsthatareclinicallysuggestiveofSARSANDwithpositivelaboratoryfindingsforSARS-CoVbasedononeormoreofthefollowingdiagnosticcriteria:a)PCRpositiveforSARS-CoV

PCRpositiveusingavalidatedmethodfrom:Atleasttwodifferentclinicalspecimens(egnasopharyngealandstool)OR

Thesameclinicalspecimencollectedontwoormoreoccasionsduringthecourseoftheillness(egsequentialnasopharyngealaspirates)OR

TwodifferentassaysorrepeatPCRusinganewRNAextractfromtheoriginalclinicalsampleoneachoccasionoftesting.b)SeroconversionbyELISAorIFANegativeantibodytestonacuteserumfollowedbypositiveantibodytestonconvalescentphaseserumtestedinparallelOR

Fourfoldorgreaterriseinantibodytitrebetweenacuteandconvalescentphaseseratestedinparallel.c)VirusisolationIsolationincellcultureofSARS-CoVfromanyspecimenANDPCRconfirmationusingavalidatedmethod.TestingshouldonlybeundertakeninanationalorregionalreferencelaboratoryasperWHOrecommendations(UseoflaboratorymethodsforSARSdiagnosis).WHOwillassistresourcepoorcountriestoconfirmtheirfirstcasesofSARSthroughlaboratorycollaboration.Alert,verificationandpublichealthmanagementofSARSinthepost-outbreakperiod-WHORecommendationsoninterpretationoflaboratoryresults

PositiveSARSdiagnostictestfindings

a)ConfirmedpositivePCRforSARSvirus:

-atleast2differentclinicalspecimens(egnasopharyngealandstool)OR

-thesameclinicalspecimencollectedon2ormoredaysduringthecourseoftheillness(eg2ormorenasopharyngealaspirates)OR-2differentassaysorrepeatPCRusingtheoriginalclinicalsampleoneachoccasionoftestingb)SeroconversionbyELISAorIFA:-negativeantibodytestonacuteserumfollowedbypositiveantibodytestonconvalescentserumOR-four-foldorgreaterriseinantibodytitrebetweenacuteandconvalescentphaseseratestedinparallelc)Virusisolation:-IsolationincellcultureofSARS-CoVfromanyspecimen;plusPCRconfirmationusingavalidatedmethod.ConfirmationofpositivePCR

-ThePCRprocedureshouldincludeappropriatenegativeandpositivecontrolsineachrun,whichshouldyieldtheexpectedresults:1negativecontrolfortheextractionprocedureand1watercontrolforthePCRrun1positivecontrolforextractionandPCRrunthepatientsamplespikedwithaweakpositivecontroltodetectPCRinhibitorysubstances(inhibitioncontrol)-IfapositivePCRresulthasbeenobtained,itshouldbeconfirmedby:repeatingthePCRusingtheoriginalsampleORhavingthesamesampletestedinasecondlaboratory.AmplifyingasecondgenomeregioncouldfurtherincreasetestspecificityUseoflaboratorymethodsforSARSdiagnosis-WHORecommendationsoninterpretationoflaboratoryresults

RecommendationsforlaboratoriestestingforSARSRecommendationsforlaboratoriestestingforSARS

Referencelaboratoriesshouldbeidentifiedatnationallevel.

PCRtestingLaboratoriestestingforSARSbyPCRshouldalreadyhaveexperiencewithPCRtesting.TheyshouldadoptqualitycontrolproceduresandidentifyapartnerlaboratoryintheircountryoramongtheWHOcollaboratingresearchlaboratorieslistedinMulti-centreCollaborativeNetwork:LaboratoriestestingforSARStocross-checktheirpositivefindings.LaboratoriesperformingSARSspecificPCRtestsshouldadoptstrictcriteriaforconfirmationofpositiveresults,especiallyinlowprevalenceareas,wherethepositivepredictivevaluemightbelower.APCR-kitforSARSiscommerciallyavailable,includinginternalcontrols.PCRprimersandprocedureshavebeenpublishedandcanbeadaptedbylaboratories.PositivecontrolRNAisavailablefromtheBernhard-NochtInstituteinHamburg,Germany.Thesensitiv