龍軍真菌講稿4課件

分子生物學(xué)技術(shù)目前缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的方法WHite運用實時定量PCR方法對203例血液病患者全血標(biāo)本進(jìn)行曲霉檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在確診/高度擬診的患者中，陽性率為92.3%;與G實驗和GM實驗及高分辨CT有良好的一致性分子生物學(xué)技術(shù)臺灣學(xué)者運用液相芯片技術(shù)，基于所有真菌的高度保守序列如18S、28S和高度可變的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)，前者用于篩選真菌感染，后者用于菌種的確定，同時對64種真菌進(jìn)行鑒定，敏感性和特異性均大于97%，1天內(nèi)完成JClinMic2005,43:3760-3768分子生物學(xué)技術(shù)存在問題1.外來的污染2.不能有效地區(qū)分定植和感染3.不能指導(dǎo)臨床何時開始及停止抗真菌治療真菌的病理檢查PAS陽性的念珠菌菌絲真菌的病理檢查HE染色真菌菌絲真菌的病理檢查肺隱球菌PAS陽性組織病理學(xué)檢查組織內(nèi)曲霉：－鏡下菌絲常呈45°分枝、有隔、透明且粗細(xì)均勻,直徑約3～6μm,有菌絲反復(fù)分枝現(xiàn)象，排列成放松射狀或珊瑚狀。－有些慢性損害中菌絲常呈不規(guī)則扭曲狀－特征性的菌絲：診斷曲霉感染最可靠的依據(jù)組織病理學(xué)檢查HE染色呈藍(lán)色略帶紅色，PAS染色呈紅色嗜銀染色呈黑色菌絲橫切面與孢子的鑒別：－孢子往往成群分布，直徑小于菌絲曲菌菌絲毛霉菌的實驗室診斷與外界相通部位分離出毛霉菌不一定有意義無菌部位標(biāo)本陽性培養(yǎng)有意義支氣管肺泡灌洗液直接鏡檢—常用分子生物學(xué)技術(shù)真菌藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)解讀抗真菌藥物敏感試驗過去試驗方法及存在問題液基稀釋法(brothdilution)微量液基稀釋法(brothmicrodilution)瓊脂混合法（agarincorporation）（即過去廣泛使用的藥基法）瓊脂擴散法(agardiffusion)問題：影響因素過多，結(jié)果重復(fù)性差NCCLSM27-A方案酵母菌的液基稀釋法抗真菌藥敏試驗參考方案（ReferenceMethodforBrothDilutionAntifungalSusceptibilityTestingofYeasts）已批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)方法，包括微量稀釋法（microdilution)主要適用于：念珠菌和新生隱球菌2002年出版了M27-A2方案NCCLSM38-P方案產(chǎn)孢絲狀真菌的液基稀釋法抗真菌藥敏試驗參考方案（ReferenceMethodforBrothDilutionAntifungalSusceptibilityTestingofConidia-Forming

FilamentousFungi）

提出的標(biāo)準(zhǔn)方法，微量稀釋法主要適用于：如曲霉、鐮刀菌、米根霉、波氏假阿利什霉、申克孢子絲菌（菌絲相）等。我們已根據(jù)此法，進(jìn)行了皮膚癬菌的藥敏試驗2003年推出M38-A方案M44-A方案2004年CLSI出版了<對酵母菌的紙片擴散法抗真菌藥物敏感試驗參考方案>使用美藍(lán)MH瓊脂平板，紙片為Rosco公司生產(chǎn)的各種抗真菌藥物紙片M27-A2藥敏判讀伊曲康唑的MIC定義同氟康唑如MIC≤0.125μg/ml,提示受試黏膜感染的念珠菌敏感，如≥1μg/ml報告耐藥0.25—0.5μg/ml提示為劑量依賴敏感目前無黏膜外的侵襲性念珠菌感染的折點判定標(biāo)準(zhǔn)M27-A2藥敏方案的臨床意義1）耐藥菌株的鑒定與監(jiān)測：?念珠菌對FCZ的耐藥問題日益嚴(yán)重?AIDS患者經(jīng)FCZ治療后出現(xiàn)較多白念珠菌的耐藥株?MIC值升高，隨FCZ劑量增大?分子生物學(xué)方法可證實同一菌株產(chǎn)生耐藥M27-A2藥敏方案的臨床意義(2）拓展新的藥敏試驗方法：?微量稀釋法、E-test法等均以M27-A為基礎(chǔ)，從不同角度為臨床提供更簡捷，易推廣的藥敏試驗技術(shù)體外抗真菌藥敏試驗與體內(nèi)療效

的一致性NCCLSM27-A?90-60原則－－MIC值與臨床療效藥敏試驗敏感菌株：90%對治療有效藥敏試驗?zāi)退幘辏?0%對治療有效NCCLS對藥敏結(jié)果的解釋MIC不是一個物理或化學(xué)的指標(biāo)?在實際臨床治療中，宿主因素往往比藥敏試驗結(jié)果更為重要?體外藥敏結(jié)果敏感并不預(yù)示治療成功?體外的耐藥常預(yù)示治療失敗藥敏判讀絲狀真菌對兩性霉素B的MIC值一般在0.15-2mg/L,但是部分真菌(如:土曲霉、枝頂孢霉、尖端賽多孢霉、足分支霉)MIC可能超2mg/L。

一般認(rèn)為,MIC>2mg/L,兩性霉素B治療有可能失敗。

?絲狀真菌通常對5-FC和氟康唑不敏感,MIC往往大于64mg/L。絲狀真菌常侵襲組織,MIC和藥物組織濃度的關(guān)系對于臨床治療指導(dǎo)意義更大藥敏判讀因此,目前對于絲狀真菌的體外診斷,更有

意義的不是藥敏試驗,而是仔細(xì)地將致病

真菌鑒定到種

?舉例說明:如果分離到土曲霉、尖端賽多

孢霉、足分支霉,就知道這些真菌通常對

兩性霉素B耐藥紙片擴散法將含有一定量抗真菌藥物的紙片置于接種有一定量真菌的平皿中，在一定的溫度

經(jīng)過一定時間孵育后，通過測量抑菌圈的

大小來判斷受試真菌對于該藥物的敏感性

?該方法簡單直觀，已有商品化

?缺點：不能精確量化酵母菌紙片擴散法敏感試驗

(CLSI)M44-PM44-P酵母菌紙片擴散法敏感試驗方案，制定了氟康唑(fluconazole)和沃爾康唑(voriconazole)質(zhì)控株的參考范圍及氟康唑的抑菌環(huán)解釋標(biāo)準(zhǔn)研究證實氟康唑?qū)湍妇幟粼囼炗休^好的重復(fù)性，可準(zhǔn)確地檢測酵母菌對氟康唑的敏感性ROSCO酵母菌紙片擴散法改良Shadomy瓊脂或RPMI1640瓊脂加熱溶解后倒入9cm平皿（20ml）新鮮具活力的純化的酵母菌落以生理鹽水制成5*105FU/ml(配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫群笤僖陨睇}水對倍稀釋)

接種：平皿先置35℃干燥20－25分鐘，傾注0.5ml菌液于平皿表面，均勻涂布，用移液管吸除多余的菌液

35℃干燥15分鐘后貼上藥物紙片

培養(yǎng)：35℃18－24小時，如未見明顯生長，再放24小時。隱球菌：30℃42－48小時結(jié)果判讀氟康唑、酮康唑、氟胞嘧啶：≥20mm敏感12-19mm中介≤11耐藥兩性霉素B、伊曲康唑、制霉菌素:≥15mm敏感10-14mm中介無抑菌圈耐藥E-test法是一種商品化的抗真菌藥物敏感性方法采用被不同量的抗真菌藥物包被的特殊試劑條，受試藥物包括氟康唑、伊曲康唑和兩性霉素B等?該方法操作簡單、直觀，與NCCLS法有較好的一致性?缺點：結(jié)果判定需有一定經(jīng)驗，價格昂貴E-test法基本原理：用特殊技術(shù)將抗菌藥物在一

試劑條上形成一個定量連續(xù)梯度,其培養(yǎng)

基、菌接種濃度、培養(yǎng)溫度及時間等條

件基本按照M-27方案所推薦的條件

E-test法已被用于某些霉菌如曲霉屬、鐮

刀菌屬和根霉屬的藥敏檢測

E-test法E-test抗真菌藥敏試條：

?二性霉素B(AP)

?5氟胞嘧啶(5-FC)

?酮康唑(KE)

?伊曲康唑(IT)

?氟康唑(FL)

?起始濃度:32mg/L終末濃度:0.002mg/L絲狀真菌的E-test藥敏試驗流式細(xì)胞檢測法原理:檢測不同藥物濃度作用下各藥物濃度管的熒光強度，根據(jù)熒光強度的梯度變化趨勢，判定藥物抗菌活性的一種方法對流動液體中排列成單列的細(xì)胞和顆粒進(jìn)行檢測，分析其光散射和熒光，從體積、內(nèi)部結(jié)構(gòu)等物理及化學(xué)特征判斷真菌活力和功能狀態(tài)。深部真菌感染存在的問題—總結(jié)真菌廣泛定殖于人體的各個部位及存在于周圍環(huán)境中，在免疫