生導(dǎo)第11章-5基因表達(dá)調(diào)控,生物技術(shù)

本章內(nèi)容提要1)基因的功能2)基因的結(jié)構(gòu)3)基因的表達(dá)4)基因的調(diào)控5)基因的突變第一頁，共203頁。基因的生物學(xué)功能第二頁，共203頁?；蚺c發(fā)育生物的發(fā)育是一個(gè)按照預(yù)定程序逐步展開的生物學(xué)過程。高等生物都是由許多結(jié)構(gòu)和功能不同的組織和器官組成。在胚胎發(fā)育和形態(tài)發(fā)生過程中，伴隨著細(xì)胞的分裂和分化，構(gòu)成組織，有序組成器官。細(xì)胞的命運(yùn)是由基因決定的，在細(xì)胞分化時(shí)，有些基因會(huì)開啟，有些基因會(huì)關(guān)閉。同一個(gè)基因在不同的細(xì)胞中處于不同的活性狀態(tài)稱為基因的差異表達(dá)，受控于基因組程序化，是發(fā)育調(diào)控的分子基礎(chǔ)。第三頁，共203頁。果蠅軀體規(guī)劃

body

plan

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基因決定個(gè)體發(fā)育第四頁，共203頁。果蠅發(fā)育突變第五頁，共203頁。果蠅體節(jié)控制基因突變第六頁，共203頁。BoyorGirl?—基因與性別1.人類中男性的性別決定是由Y染色體上的SRY基因控制的,該基因可以開啟另一個(gè)下游基因SOX9,這是一個(gè)決定性別表型的關(guān)鍵基因.2.GiovannaCamerino等發(fā)現(xiàn)意大利一個(gè)家庭的4個(gè)兄弟均為XY基因型,但他們的性別表型均為女性.3.GiovannaCamerino發(fā)現(xiàn)造成上述性別轉(zhuǎn)變的原因在RSPO1基因的突變關(guān)閉了SOX9基因,阻止雄性器官的發(fā)育.4.由于RSPO1基因的突變使4兄弟轉(zhuǎn)變?yōu)榕?該基因突變率為1/160000.Nature,2006.第七頁，共203頁。SOX9—性別開關(guān)基因小鼠轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn):雄性小鼠含有SRY基因,可開啟SOX9基因,轉(zhuǎn)化SOX9基因仍為雄性.雌鼠缺少SRY基因,不能開啟SOX9基因.用SOX9基因轉(zhuǎn)化雌鼠,促使雌鼠性別轉(zhuǎn)化.第八頁，共203頁。天才與瘋子僅一步之遙

--神奇的DARPP-32

基因畢加索愛因斯坦伍爾芙本人在《瘋狂的天才》書中，曾專門分析過那些患有精神疾病，尤其是躁狂型抑郁癥的天才—詩人、畫家、作家的精神世界。

自殺或者企圖自殺，是有著精神疾患的藝術(shù)家們相當(dāng)普遍的一種選擇。第九頁，共203頁。聰明基因可能增加精神分裂風(fēng)險(xiǎn)天才和瘋子之間似乎僅有一線之隔，如畫家梵高被稱為天才，但表現(xiàn)出自我毀滅的行為。研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種同時(shí)控制才智和癲癇的基因，這種基因可以決定一個(gè)人的智商高低，同時(shí)也能夠控制一個(gè)人是否會(huì)患上精神分裂癥。美國NIH精神健康研究所（NIMH）科學(xué)家對(duì)于人腦“控制開關(guān)”基因DARPP-32的首次研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)人遺傳了一套該基因的變異拷貝，它能夠“優(yōu)化”大腦思維回路，不過，它也可能削弱思維能力，增加患精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)。第十頁，共203頁。遺傳信息流---基因的表達(dá)程序第十一頁，共203頁?；虻慕Y(jié)構(gòu)第十二頁，共203頁。什么叫基因?1)“gene”一詞的出現(xiàn):1905年,Johson首創(chuàng)“gene”一詞,用以表示可在后代重復(fù)出現(xiàn)的遺傳因子..3)基因的定義(GeneticsGlossary):

經(jīng)典遺傳學(xué):

決定表型性狀的獨(dú)立的遺傳單位.

分子遺傳學(xué):

組成一個(gè)完整轉(zhuǎn)錄單元的DNA順序.第十三頁，共203頁?！耙粋€(gè)基因一個(gè)酶”的假設(shè)Beadle和Tatum通過脈包菌(Neurosporacrassa)的遺傳分析發(fā)現(xiàn)基因的原始作用是決定酶的結(jié)構(gòu)。每一種突變只阻斷一個(gè)生化反應(yīng)，或者說只是造成催化這個(gè)生化反應(yīng)的酶的功能缺陷。與突變基因相對(duì)應(yīng)的野生型基因決定了一種酶的產(chǎn)生，決定這個(gè)酶所催化的生化反應(yīng)能不能進(jìn)行，決定了這個(gè)酶反應(yīng)的產(chǎn)物能不能生成，決定了與這個(gè)產(chǎn)物相關(guān)的野生型性狀能不能顯現(xiàn)。第十四頁，共203頁。順反子

1955年，美國分子生物學(xué)家本澤（Benzer）提出了基因的順反子（Cistron）概念。遺傳的功能單位稱為順反子，一個(gè)順反子一個(gè)多肽，順反子即是結(jié)構(gòu)基因。順反子的概念來自遺傳學(xué)中的順反重組試驗(yàn)，確定交換片段究竟在一個(gè)基因內(nèi)還是屬于兩個(gè)基因的試驗(yàn)，順反子內(nèi)存在與核苷酸數(shù)量一樣的突變子和重組子。這個(gè)學(xué)說打破了基因是突變、重組、決定遺傳性狀的“三位一體”概念及基因是最小的不可分割的遺傳單位的觀點(diǎn)。

基因?yàn)镈NA分子上一段核苷酸順序，負(fù)責(zé)著遺傳信息傳遞，一個(gè)基因內(nèi)部仍可劃分若干個(gè)起作用的小單位，即可區(qū)分成順反子、突變子和重組子。第十五頁，共203頁。第十六頁，共203頁。對(duì)基因的結(jié)構(gòu)分析：我們可以看到基因共有的一些結(jié)構(gòu)域，基因是不同結(jié)構(gòu)域的組合；這暗示，至少這些基因起源于不同結(jié)構(gòu)域作為基本單位的組合；建筑之比喻免疫球蛋白，T細(xì)胞受體基因重排：基因組不同結(jié)構(gòu)域的隨機(jī)組合，擁有10E15以上多樣性?？寺∵x擇學(xué)說；財(cái)富高度集中有病。真核基因選擇性剪接：絕大多數(shù)真核基因具有選擇性剪接，選擇不同的外顯子組成基因；內(nèi)含子與外顯子的作用；反式剪接形成的基因:來源于不同的染色體轉(zhuǎn)錄成一個(gè)基因，也是一種基因組合?；虻木幊蹋潭ǔ绦蚺c臨時(shí)程序，程序員呢？第十七頁，共203頁?；虻慕Y(jié)構(gòu)以轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)為分界線,在其5’端的順序稱為基因的上游區(qū),在其3’端的順序稱為基因的下游區(qū).第十八頁，共203頁?；虻慕Y(jié)構(gòu)1)基因的上游區(qū)含有控制基因表達(dá)調(diào)控的順序,通常將這些順序稱之為反式因子.2)基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)包含:

外顯子:在轉(zhuǎn)錄加工后輸出細(xì)胞核的順序,含編碼mRNA的順序.

內(nèi)含子:在轉(zhuǎn)錄加工后被切除的順序,非編碼順序.5’-和3’-非翻譯區(qū):不編碼氨基酸3)mRNA的順序組成:5’非翻譯區(qū):可調(diào)控翻譯起始3’非翻譯區(qū):可調(diào)控翻譯終止多肽鏈編碼區(qū):密碼子組成區(qū),或稱開放讀框,openreadingframe,ORF第十九頁，共203頁。DNA的編碼鏈

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正鏈(+)轉(zhuǎn)錄時(shí)以負(fù)鏈(-)或無義鏈為模板,按堿基配對(duì)法則合成與編碼鏈或正鏈(+)順序相同的RNA.第二十頁，共203頁?；虻谋磉_(dá)基因表達(dá)的控制元件:1)啟動(dòng)子2)增強(qiáng)子第二十一頁，共203頁。

基因的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控與基因上游區(qū)順式因子結(jié)合的蛋白質(zhì)又稱為反式因子,絕大多數(shù)為轉(zhuǎn)錄因子,控制基因的轉(zhuǎn)錄起始.第二十二頁，共203頁。啟動(dòng)子---安裝轉(zhuǎn)錄裝置的平臺(tái)1）核心啟動(dòng)子的順序?yàn)?TATA-2)為RNA多聚酶的結(jié)合提供平臺(tái)2）確定轉(zhuǎn)錄的方向3）規(guī)定轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)

第二十三頁，共203頁。什么是增強(qiáng)子(enhancer)?真核生物啟動(dòng)子并不能單獨(dú)行使轉(zhuǎn)錄起始功能，它必須借助增強(qiáng)子的幫助。增強(qiáng)子可以定義為距離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)較遠(yuǎn)的與轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)的DNA順序。

真核生物的增強(qiáng)子有許多可以和轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白特異結(jié)合的短序列DNA組成,通常稱為順式元件(ciselements).增強(qiáng)子可以決定基因何時(shí)何處表達(dá).

第二十四頁，共203頁。

增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)及其功能第二十五頁，共203頁?；虻?/p>

表達(dá)

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轉(zhuǎn)錄和

翻譯第二十六頁，共203頁。轉(zhuǎn)錄的起始與延伸第二十七頁，共203頁。毒蘑菇—轉(zhuǎn)錄的抑制劑毒蘑菇中有一種毒素α-鵝膏蕈（Xun）堿可與真核生物RNA聚合酶II緊密結(jié)合阻止mRNA的合成,但不抑制原核生物,葉綠體以及線粒體基因的轉(zhuǎn)錄.第二十八頁，共203頁。基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工1)真核細(xì)胞中編碼基因轉(zhuǎn)錄的初級(jí)產(chǎn)物稱為前體mRNA(pre-mRNA).2)前體mRNA必需經(jīng)過加工轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓膍RNA才能輸出細(xì)胞核.3)前體mRNA的加工包括:1)5’-端加帽2)3’-端加尾3)切除不編碼的內(nèi)含子,將相鄰的外顯子彼此連接.第二十九頁，共203頁。mRNA的加帽與加尾第三十頁，共203頁。

前體mRNA的剪接第三十一頁，共203頁。

基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制第三十二頁，共203頁。大腸桿菌乳糖操縱子大腸桿菌的乳糖操縱子含Z、Y及A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼β-半乳糖苷酶、透酶、乙?；D(zhuǎn)移酶，此外還有一個(gè)操縱序列O、一個(gè)啟動(dòng)序列P及一個(gè)調(diào)節(jié)基因Ⅰ。Ⅰ基因編碼一種阻遏蛋白，后者與O序列結(jié)合，使操縱子受阻遏而處于轉(zhuǎn)錄失活狀態(tài)。在啟動(dòng)序列P上游還有一個(gè)分解（代謝）物基因激活蛋白CAP結(jié)合位點(diǎn)，由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點(diǎn)共同構(gòu)成LAC操縱子的調(diào)控區(qū)，三個(gè)酶的編碼基因即由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表達(dá)。

第三十三頁，共203頁。原核基因表達(dá)調(diào)控

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操縱子模型當(dāng)培養(yǎng)基中含有葡萄糖時(shí),抑制蛋白質(zhì)與lac操縱子中的操縱基因結(jié)合,阻止轉(zhuǎn)錄.當(dāng)培養(yǎng)基中無葡萄糖而含有乳糖時(shí),乳糖與抑制蛋白結(jié)合,解除抑制,基因轉(zhuǎn)錄.第三十四頁，共203頁。細(xì)菌中轉(zhuǎn)錄與

翻譯

是偶聯(lián)的

同步進(jìn)行第三十五頁，共203頁。mRNA的多核糖體翻譯第三十六頁，共203頁。

真核生物基因表達(dá)---多步調(diào)控第三十七頁，共203頁。

基因突變--類型基因突變的類型:1)堿基代換又稱點(diǎn)突變,堿基改變包括:

轉(zhuǎn)換:一種嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N嘌呤,A→G或G→A

顛換:一種嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N嘌呤,或者相反,如C→A或A→T等.2)核苷酸插入或缺失突變第三十八頁，共203頁。

基因突變的效應(yīng)—堿基代換堿基代換會(huì)產(chǎn)生4種不同的效應(yīng):1)同義突變:不改變氨基酸順序的堿基代換2)錯(cuò)義突變:使氨基酸密碼子發(fā)生改變的堿基代換3)無義突變:產(chǎn)生終止密碼的突變,使翻譯提前終止,產(chǎn)生殘缺蛋白質(zhì)4)連讀突變:終止密碼變?yōu)橛辛x密碼,產(chǎn)生延伸的多肽鏈第三十九頁，共203頁。突變的效應(yīng)---同義突變同義突變發(fā)生在氨基酸密碼子的第3個(gè)堿基即搖擺位置,不影響氨基酸改變,又稱沉默突變.第四十頁，共203頁。錯(cuò)義突變錯(cuò)義突變的堿基代換發(fā)生在密碼子的第1或第2個(gè)堿基位置,改變了密碼子的編碼含義,由一個(gè)新的氨基酸取代.

鐮刀型紅細(xì)胞即起因于點(diǎn)突突變,使谷氨酸變?yōu)槔i(Xie)氨酸.第四十一頁，共203頁。無義突變或終止突變無義突變系指編碼氨基酸的密碼子因堿基代換轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼的突變,使翻譯提前終止.第四十二頁，共203頁。連讀突變連讀突變發(fā)生在終止密碼位置,將終止密碼轉(zhuǎn)變?yōu)榘被崦艽a子,使翻譯延續(xù),產(chǎn)生延長的多肽鏈.第四十三頁，共203頁。插入或缺失突變不影響密碼子讀框的插入或缺失突變:這類突變插入或缺失的堿基數(shù)目為3的倍數(shù),不影響后續(xù)密碼子的讀框,但會(huì)增加或減少突變區(qū)域氨基酸的數(shù)目.影響密碼子讀框的插入或缺失突變:這類突變插入或缺失的堿基數(shù)目與密碼子堿基數(shù)不成倍數(shù),使后續(xù)密碼子的讀框發(fā)生改變,又稱為移碼突變.第四十四頁，共203頁。插入或缺失---非移碼突變編碼區(qū)連續(xù)插入或缺失3個(gè)堿基不影響后續(xù)的讀碼順序.第四十五頁，共203頁。插入或缺失---移碼突變編碼區(qū)連續(xù)插入或缺失非3倍數(shù)的堿基影響后續(xù)讀碼順序.第四十六頁，共203頁。影響表型的各種突變第四十七頁，共203頁。人類早衰突變第四十八頁，共203頁。幼態(tài)癥現(xiàn)年17歲的布魯克·格林伯格是一名美國巴爾的摩市女孩，和父親霍華德、母親梅拉妮以及3名姐妹居住在巴爾的摩市郊區(qū)雷斯特斯鎮(zhèn)。布魯克·格林伯格盡管已17歲大，但她的外表看上去仍然像一歲女嬰，體重只有7.25公斤，身高也只有0.76米！美國醫(yī)學(xué)專家對(duì)布魯克進(jìn)行了一系列診治，發(fā)現(xiàn)她身上存在許多“矛盾現(xiàn)象”——她身體每個(gè)部分的衰老程度并不一樣！比如17歲的布魯克仍然長著乳牙，但她的骨骼年齡卻更像是10歲兒童。醫(yī)生曾建議布魯克的父母為她注射生長荷爾蒙，但生長荷爾蒙治療也沒有產(chǎn)生任何效果。

2010年05月10日03:27

第四十九頁，共203頁。人類的大腦為何特別大

?第五十頁，共203頁。人類頜肌肌球蛋白基因的突變第五十一頁，共203頁。細(xì)胞癌變的分子機(jī)制1)細(xì)胞癌變的關(guān)鍵是細(xì)胞分裂的失控.2)癌變可由多種原因引起,最終都是破壞控制細(xì)胞分裂基因的正常功能.3)癌變通常發(fā)生在必需不斷更新的組織細(xì)胞,由于頻繁復(fù)制可積累突變.4)導(dǎo)致癌變的內(nèi)外因素,如接觸致癌化合物引起DNA突變.第五十二頁，共203頁。癌基因致癌基因(oncogene):因突變或高水平表達(dá)而引起靶細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞的基因。原癌基因（Proto-Oncogenes）：細(xì)胞中具有正常的功能，但在其突變或增強(qiáng)表達(dá)時(shí)能促進(jìn)細(xì)胞分裂并有致癌作用的基因.第五十三頁，共203頁。

癌變的多步模型---結(jié)腸癌第五十四頁，共203頁。某些原癌基因的功能p53-inducedcell-cyclearrestinresponsetoDNADamageThenormallyunstablep53proteinisstabilizedbydamagedDNA,soitsconcentrationincreases.Actingasatranscriptionfactor,p53inducesexpressionofp21CIP,acyclin-kinaseinhibitorthatinhibitsallCdk1-,Cdk2-,Cdk4-,andCdk6-cyclincomplexes。Bindingofp21CIPtotheseCdk-cyclincomplexesleadstocellcyclearrestinG1andG2.

第五十五頁，共203頁。腫瘤與癌癥的區(qū)別腫瘤可分為良性腫瘤和惡性腫瘤兩大類，腫瘤與癌癥是不同的兩個(gè)概念,良性腫瘤和惡性腫瘤的區(qū)別是相對(duì)的。腫瘤有惡性和良性之分,惡性腫瘤就是癌癥。更確切地說,上皮組織的惡性腫瘤,才是癌癥,其他組織的惡性腫瘤叫做肉瘤。腫瘤(良性)是可控制的,而癌癥是不可控制的。良性腫瘤一般生長緩慢，生長方式大多為膨脹性生長，有包膜，與周圍正常組織分界清楚.惡性腫瘤大都生長較快，一般無包膜，邊界不清，腫塊固定，與周圍組織粘連而不能移動(dòng)。

第五十六頁，共203頁。思考題1)真核生物基因的結(jié)構(gòu).2)原核生物與真核生物基因表達(dá)模式的主要差別?3)前體mRNA必需經(jīng)過哪些加功才能輸出細(xì)胞核?3)核苷酸的插入可引起哪些突變?是否所有的插入突變都會(huì)引起密碼子的移碼?4)簡述乳糖操縱子表達(dá)調(diào)控的機(jī)制?5)癌癥為什么大多發(fā)生在持續(xù)分裂的組織與細(xì)胞?不良的生活習(xí)慣為何容易誘發(fā)癌癥,舉例說明?第五十七頁，共203頁。第12章重組DNA技術(shù)第五十八頁，共203頁。

本章內(nèi)容提要1)重組DNA與限制性內(nèi)切酶2)大腸桿菌質(zhì)?？寺≥d體的結(jié)構(gòu)3)如何構(gòu)建基因文庫4)分子雜交的原理與程序5)如何從基因文庫中篩選基因第五十九頁，共203頁。什么是重組DNA

?第六十頁，共203頁。

分子刀-DNA限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶是一類在原核生物中發(fā)現(xiàn)的可以識(shí)別特定的DNA堿基順序并將其切開的酶.第六十一頁，共203頁。限制性核酸內(nèi)切酶的特點(diǎn)1)限制性核酸內(nèi)切酶僅在原核生物中發(fā)現(xiàn).2)

限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基順序長度不等,可從4堿基對(duì)到數(shù)十堿基對(duì).大多數(shù)常用的限制酶識(shí)別的堿基對(duì)長度為4-6個(gè)堿基對(duì).3)限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA的方式可以是5’突出單鏈或3’突出單鏈,也可以是平端酶切.4)大多數(shù)II型限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基順序都有

回文對(duì)稱的特點(diǎn),即旋轉(zhuǎn)1800,識(shí)別順序重疊.5)細(xì)菌中的限制核酸內(nèi)切酶可以將外源的DNA切割,但不酶切自身的DNA.因?yàn)榧?xì)菌基因組DNA可以甲基化,使限制酶不能識(shí)別而得以保護(hù).第六十二頁，共203頁。發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶1)1950年代科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌K具有某種機(jī)制可以限制λ噬菌體的感染能力.2)1962年瑞士的科學(xué)家WernerArber等人證明了大腸桿菌K可以產(chǎn)生一種酶，可以阻止λ噬菌體的感染能力,因而稱為限制性內(nèi)切酶(restrictionendonuclease

).3)在1970年美國科學(xué)家HamiltonO.Smith等人從噬血感菌RD菌株中分離出另一種限制酶,定名為HindII,為II型限制酶,目前常使用的限制酶均屬於這一類.4)在1971年美國科學(xué)家DanielNathans等人，首先利用

HindII限制酶描繪出

simianvirus40(SV40)病毒的限制酶位點(diǎn)物理圖.基於限制酶的發(fā)現(xiàn)及其性質(zhì)方面研究的貢獻(xiàn)，WernerArber、HamiltonO.smith、DanielNathans三人在1978共同獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。第六十三頁，共203頁。限制酶發(fā)現(xiàn)及其應(yīng)用獲得諾貝爾獎(jiǎng)第六十四頁，共203頁。有三種限制性內(nèi)切酶目前已知有三種限制性內(nèi)切酶:1)I型限制性內(nèi)切酶:一類兼有限制性內(nèi)切酶和修飾酶活性的蛋白復(fù)合體,可催化宿主DNA的甲基化

。它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)約1000bp以外的任何位置切割DNA鏈,不產(chǎn)生確定的限制片段和明確的條帶.

2)II型限制性內(nèi)切酶:在識(shí)別位點(diǎn)之中或臨近的確定位點(diǎn)特異地切開DNA鏈。它們產(chǎn)生確定的限制片段和條帶，因此是三類限制性內(nèi)切酶中唯一用于DNA分析和克隆的酶。3)III型限制性內(nèi)切酶:兼有限制和修飾兩種功能的酶,可催化宿主DNA的甲基化

。它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)之外25-27bp的位置切開DNA鏈，并且要求識(shí)別位點(diǎn)是反向重復(fù)序列,如BcgI,CGANNNNNNTGC

；它們很少能產(chǎn)生完全切割的片段，因而不具備實(shí)用價(jià)值。

第六十五頁，共203頁。幾種常用的II型限制酶及其識(shí)別位點(diǎn)限制酶識(shí)別與酶切的堿基順序具有回文結(jié)構(gòu),旋轉(zhuǎn)1800C可以順序重疊,產(chǎn)生的突出末端稱為粘性末端.平端切口不產(chǎn)生突出單鏈末端.第六十六頁，共203頁。重組DNA的操作限制酶切割DNA暴露的突出末端順序又稱粘性末端,具有相同突出末端的片段可以彼此連接.第六十七頁，共203頁。第一個(gè)重組DNA分子

1972年斯坦福大學(xué)的Paul

Berg博士首次在國際上構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子,它們結(jié)合了兩種生物的DNA.為此,Berg榮獲1980年化學(xué)諾貝爾獎(jiǎng).重組DNA與原子核裂變的意義可以相提并論.上世紀(jì)70年代中期,美國國家科學(xué)院要求Berg就重組DNA的安全性進(jìn)行評(píng)估.為此,Berg寫了一封具有歷史意義的信件,號(hào)召推遲重組DNA研究,直到安全性得到控制為止.他是1975年在加洲Asilomar召開的國際重組DNA技術(shù)論壇的關(guān)鍵組織者.一百多位與會(huì)科學(xué)家討論了基因剪切實(shí)驗(yàn)的潛在風(fēng)險(xiǎn).一年后,討論結(jié)果形成了關(guān)于重組DNA技術(shù)的NIH準(zhǔn)則,這是一個(gè)里程碑式的事件,顯示了科學(xué)家們負(fù)責(zé)任的自律精神.

Berg博士1991年被聘為人類基因組計(jì)劃科學(xué)顧問委員會(huì)主席.第六十八頁，共203頁。第一個(gè)重組DNA生物

In1973,HerbertBoyer和

StanleyCohen創(chuàng)造了第一個(gè)

重組DNA生物----含有猿猴病毒SV40基因的大腸桿菌細(xì)胞.1975年Swanson訪問了在硅谷的Boyer,討論成立生物技術(shù)公司的想法.

1976年Boyer和Swanson共同創(chuàng)辦了世界上第一家生物技術(shù)公司,Genentech.1978年他們生產(chǎn)了第1個(gè)重組DNA商用醫(yī)藥產(chǎn)品—人體胰島素(治療糖尿病),次年生產(chǎn)了第2個(gè)重組DNA產(chǎn)品—生長因子(治療侏儒癥).第六十九頁，共203頁。9]

P[LP[L*/-++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

第七十頁，共203頁。DNA克隆第七十一頁，共203頁。什么是克隆(cloneorcloning)?1)Agroupofgeneticallyidenticalindividualsdescendedfromthesameparentbyasexualreproduction.2)Agroupofgeneticallyidenticalcellsproducedbymitoticdivisionfromanoriginalcell.3)AgroupofDNAmoleculesproducedfromanoriginallengthofDNAsequencesproducedbyabacteriumoravirususingmolecularbiologytechniques.ThisiswhatisoftencalledmolecularcloningorDNAcloning.4)Theproductionofgeneticallyidenticalanimalsby'embryosplitting'.Thiscanoccurnaturallyatthetwocellstagetogiveidenticaltwins.5)Thecreationofoneormoregeneticallyidenticalanimalsbytransferringthenucleusofabodycellintoaneggfromwhichthenucleushasbeenremoved.核移植,多利羊定義:通過無性方式產(chǎn)生的遺傳組成相同的后代(DNA,細(xì)胞,個(gè)體).第七十二頁，共203頁。DNA分子克隆載體(Vector)一種可以將插入DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增的質(zhì)粒DNA,含有可在原核或真核細(xì)胞中復(fù)制所必需的元件.第七十三頁，共203頁。大腸桿菌質(zhì)粒DNA1)大腸桿菌細(xì)胞中含有游離于染色體外并且可以獨(dú)立復(fù)制的遺傳物質(zhì)—質(zhì)粒DNA.2)質(zhì)粒DNA一般是小分子環(huán)狀DNA分子.3)大腸桿菌細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA通常有很多個(gè)拷貝,因此可以用來擴(kuò)增外源的DNA片段.4)質(zhì)粒DNA可以提取出來進(jìn)行體外操作,構(gòu)建重組DNA分子.5)提取和純化的質(zhì)粒DNA可以用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞,并可在宿主菌中進(jìn)行多拷貝復(fù)制.第七十四頁，共203頁。DNA克隆載體的必需部件1)DNA復(fù)制起始點(diǎn)2)質(zhì)粒載體選擇標(biāo)記3)多克隆位點(diǎn)第七十五頁，共203頁。質(zhì)粒載體

的一般結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)元件:1)復(fù)制起始點(diǎn);2)質(zhì)粒篩選標(biāo)記;3)插入子篩選標(biāo)記;3)多克隆位點(diǎn).第七十六頁，共203頁。質(zhì)粒DNA復(fù)制起始點(diǎn)與拷貝數(shù)1)DNA克隆載體必須在宿主菌細(xì)胞中復(fù)制才能進(jìn)行擴(kuò)增,因此克隆載體均含有可被宿主菌識(shí)別的復(fù)制起始點(diǎn).2)不同的細(xì)菌DNA復(fù)制起始點(diǎn)具有種屬專一性,因此可在甲種細(xì)菌中復(fù)制的克隆載體不一定能在乙種細(xì)菌中復(fù)制.3)可在多種宿主菌中復(fù)制的克隆載體稱為穿梭載體,它們含有廣宿主復(fù)制起始點(diǎn).4)復(fù)制起始點(diǎn)決定細(xì)胞中拷貝數(shù)的多少:松弛型質(zhì)粒:一個(gè)細(xì)胞中可以復(fù)制數(shù)十個(gè)質(zhì)?？截?這種質(zhì)粒為松弛型,常用于質(zhì)粒擴(kuò)增.嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒:一個(gè)細(xì)胞中只允許一個(gè)或數(shù)個(gè)質(zhì)?？截?這種質(zhì)粒為嚴(yán)謹(jǐn)型,基因工程中很少采用這類質(zhì)粒.第七十七頁，共203頁?？寺≥d體選擇標(biāo)記克隆載體的選擇標(biāo)記具有兩種類型:1)質(zhì)粒選擇標(biāo)記,這類標(biāo)記可使質(zhì)粒DNA在選擇壓力下保留在細(xì)胞中,如大腸桿菌克隆載體中的抗卡那霉素基因(kamR)或抗氨卞青霉素基因(ampR).2)插入子選擇標(biāo)記,根據(jù)篩選標(biāo)記的表型可以判斷外源DNA是否已插入到克隆載體中,如大腸桿菌克隆載體中常用的lacZ基因.若無外源DNA插入,在篩選培養(yǎng)基上克隆顯示藍(lán)色.在外源DNA插入破壞lacZ基因時(shí),克隆顯示白色.第七十八頁，共203頁。插入子選擇標(biāo)記1)插入子選擇標(biāo)記基因lacZ編碼降解乳糖糖苷鍵的酶,它也能降解一種IPTG的化合物,并產(chǎn)生一種藍(lán)色的物質(zhì).2)在篩選培養(yǎng)基中加入IPTG,如果細(xì)菌能產(chǎn)生lacZ蛋白質(zhì),細(xì)胞內(nèi)有藍(lán)色產(chǎn)物積累,表明載體中的標(biāo)記基因lacZ是正常的,沒有插入外源DNA.這些藍(lán)色克隆為陰性克隆.3)如果細(xì)菌不產(chǎn)生lacZ蛋白質(zhì),細(xì)胞內(nèi)沒有藍(lán)色產(chǎn)物積累,表明載體中的標(biāo)記基因lacZ受到破壞,已有外源DNA插入.這些白色克隆為陽性克隆.第七十九頁，共203頁。多克隆位點(diǎn)1.所有克隆載體都有多克隆位點(diǎn),它們是外源DNA插入的位置.多克隆位點(diǎn)由一段特別的堿基順序組成,它們可以由不同的限制酶切開.含有相同接頭的外源DNA可通過互補(bǔ)接頭插入到載體的多克隆位點(diǎn)中.2.采用多克隆位點(diǎn)的目的是為了便于不同順序的外源DNA整合到載體中.3.當(dāng)外源DNA順序中沒有合適的酶切位點(diǎn)時(shí),可以合成匹配的接頭整合到載體中.第八十頁，共203頁。常用的DNA克隆載體

第八十一頁，共203頁。DNA

克

隆

的一般程序第八十二頁，共203頁。篩選目標(biāo)克隆第八十三頁，共203頁。DNA分子雜交—Southern分析1.DNA雙螺旋的兩條單鏈?zhǔn)前磯A基互補(bǔ)配對(duì)(A/T和C/G)的原則形成的.在高于950C(或酸堿條件)下,DNA兩條雙鏈會(huì)彼此分開形成單鏈,這一過程稱為DNA變性或解鏈.當(dāng)溫度下降到700C或750C以下時(shí),兩條單鏈又會(huì)按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則重新形成雙鏈,這一過程稱為復(fù)性.2.當(dāng)兩條同源DNA分子的堿基順序具有80%以上的一致性時(shí),這兩條同源DNA的單鏈在650C條件下能形成雜交雙鏈.分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用這種方法篩選含有目標(biāo)基因的陽性克隆.3.根據(jù)DNA分子變性和復(fù)性的原理,可以采用分子雜交的方法檢測樣品中是否含有順序一致的核酸分子.如果檢測的對(duì)象是DNA,這種雜交稱為Southern雜如果檢測的對(duì)象是RNA分子,這種雜交稱為northern雜交.第八十四頁，共203頁。

DNA探針及分子雜交1.DNA探針是指一段用來檢測或鑒定目標(biāo)DNA是否具有同源或相同順序的DNA分子.用作探針的DNA片段在與樣品(DNA或RNA)雜交前:1)需采用同位素或熒光化合物進(jìn)行標(biāo)記,以便在雜交反應(yīng)后顯示與目標(biāo)DNA雜交的信號(hào).2)探針必需變性成為單鏈才能用于克隆雜交.2.基因文庫的克隆轉(zhuǎn)移到雜交膜上后,必需將細(xì)胞裂解使其釋放DNA,還要進(jìn)一步將克隆的DNA變性使其成為單鏈狀態(tài).第八十五頁，共203頁。鑒定克隆DNA片段---Southern分子雜交第八十六頁，共203頁。如何使雙鏈DNA變性為單鏈?使雙鏈DNA變性的方法如下:1)加熱:將DNA樣品置于95OC的溶液.2)酸處理:將DNA樣品置于0.1N(或0.2N)的HCl溶液.3)堿處理:將DNA樣品置于0.2N(或0.4N)的NaOH溶液.注:1.加熱,酸堿處理均可破壞雙鏈DNA配對(duì)堿基之間的氫鍵,使單鏈游離.2.常用的雜交膜含有特別的化學(xué)基團(tuán),可將DNA固定在雜交膜上,使其所在雜交膜上的位置不變.第八十七頁，共203頁。Southern分子雜交實(shí)驗(yàn)雜交后將雜交膜漂洗,然后進(jìn)行X-光片放射性自顯影,保留在雜交膜上的探針可顯示基因片段在電泳凝膠上的相對(duì)位置(圖右:電泳凝膠DNA遷移位置;圖左:探針雜交位置).第八十八頁，共203頁。什么是基因文庫(genelinrary)?基因文庫:一組插入到克隆載體中足以覆蓋基因組所有基因的DNA片段,可進(jìn)行復(fù)制與擴(kuò)增.第八十九頁，共203頁。表達(dá)基因文庫(cDNA庫)的構(gòu)建1)基因組中的基因在不同組織細(xì)胞中并不是全部同時(shí)表達(dá)的,比如眼睛組織細(xì)胞中表達(dá)的基因與大腦組織細(xì)胞中表達(dá)的基因各不相同.為了知道大腦與眼睛中表達(dá)基因的差別,可以構(gòu)建專門的組織特異性cDNA文庫.2)從特定組織中分離純化mRNA,然后利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA分子互補(bǔ)的DNA,這個(gè)互補(bǔ)的DNA(cDNA).cDNA只含外顯子順序,沒有內(nèi)含子順序.3)將cDNA插入到載體中獲得的克隆群體則稱為cDNA文庫.第九十頁，共203頁。cDNA文庫構(gòu)建程序第九十一頁，共203頁。從基因文庫中分離目標(biāo)克隆第九十二頁，共203頁。PCR技術(shù)及其發(fā)明者

1)什么是PCR?PCR的全稱為多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的英文縮寫(polymerasechainreaction),系指一種在體外通過酶的催化反應(yīng)擴(kuò)增DNA分子的技術(shù).2)PCR技術(shù)由美國生物化學(xué)博士KaryBanksMullis發(fā)明,并榮獲1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng).

3)PCR技術(shù)主要利用高溫耐熱DNA多聚酶的特性,使模板DNA在高溫下變性,然后與擴(kuò)增引物復(fù)性并在DNA多聚酶的作用下進(jìn)行DNA復(fù)制.這一過程可在試管中反復(fù)進(jìn)行,每擴(kuò)增一次,DNA分子的數(shù)量增加一倍.經(jīng)多輪擴(kuò)放反應(yīng)后,擴(kuò)增的DNA分子可從數(shù)個(gè)模板增加到數(shù)百萬個(gè).第九十三頁，共203頁。

PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) PCR可以指數(shù)級(jí)增加DNA數(shù)量,每經(jīng)過一次擴(kuò)增DNA數(shù)目增加一倍.因?yàn)楸匦柙诟邷?80-900C)下使DNA解鏈,然后降低溫度使引物與解鏈變性的DNA單鏈復(fù)性,所以PCR酶必需耐受高溫才能連續(xù)擴(kuò)增.第九十四頁，共203頁。PCR技術(shù)的應(yīng)用PCR技術(shù)在現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用:1.直接從基因組DNA中擴(kuò)放和克隆基因.2.檢測樣品中是否含有特定堿基順序的DNA.3.古DNA樣品的擴(kuò)增.4.繪制DNA指紋圖.5.遺傳病的檢測.6.傳染性病毒的檢測.7.將特定的堿基引入DNA順序中進(jìn)行定向突變.8.檢測與比較基因在不同組織的差異表達(dá).第九十五頁，共203頁。思考題1)什么是重組DNA?2)什么是限制性內(nèi)切酶?3)克隆載體包括哪些基本的結(jié)構(gòu)元件,簡述DNA克隆的過程?4)質(zhì)粒載體中含有哪些標(biāo)記基因?其作用是什?5)如何構(gòu)建來自人體血細(xì)胞的基因文庫?6)什么是cDNA,如何克隆cDNA?7)在進(jìn)行Southern雜交時(shí)為何要將DNA變性?8)如何從基因文庫中篩選已知部分堿基順序的基因?9)簡述PCR原理.第九十六頁，共203頁。第13章生物技術(shù)---現(xiàn)代生

命科學(xué)的革命第九十七頁，共203頁。本章內(nèi)容提要1)生物技術(shù)包括哪些內(nèi)容2)基因工程3)轉(zhuǎn)基因植物與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物4)基因治療5)DNA指紋6)DNA芯片7)體細(xì)胞克隆8)轉(zhuǎn)基因安全性第九十八頁，共203頁。什么是生物技術(shù)？

生物技術(shù)（biotechnology）,有時(shí)也稱生物工程（bioengineering）,是指人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合其他基礎(chǔ)科學(xué)的原理，采用先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)手段，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的。生物技術(shù)是人們利用微生物、動(dòng)植物體對(duì)物質(zhì)原料進(jìn)行加工，以提供產(chǎn)品來為社會(huì)服務(wù)的技術(shù)。

現(xiàn)代生物技術(shù)綜合生物化學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、胚胎學(xué)、免疫學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)、信息學(xué)、計(jì)算機(jī)等多學(xué)科技術(shù)，發(fā)展到高通量組學(xué)（omics）芯片技術(shù)、基因組人工設(shè)計(jì)與合成生物學(xué)等技術(shù)。

B&B第九十九頁，共203頁。生物工程?

生物工程是以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物體(或者生物組織、細(xì)胞及其組分)的特性和功能，設(shè)計(jì)構(gòu)建新物種、新品系、新的分子、新技術(shù)、新方法、新材料等，并且與工程原理相結(jié)合進(jìn)行研究、設(shè)計(jì)、加工生產(chǎn)，為社會(huì)提供服務(wù)。因此生物工程是一個(gè)綜合性技術(shù)體系，其內(nèi)容主要包括基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程，微生物工程和生物克隆技術(shù)等六個(gè)部分，其中基因工程技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心技術(shù)。第一百頁，共203頁?；蚬こ?生物技術(shù)的核心基因工程蛋白質(zhì)酶生化工程細(xì)胞工程微生物發(fā)酵工程組織工程第一百零一頁，共203頁。生物技術(shù)的內(nèi)容生物技術(shù)包括:基因工程蛋白質(zhì)工程細(xì)胞工程組織工程第一百零二頁，共203頁。未來5-10年十大生物技術(shù)(健康領(lǐng)域)美國“NATUREGENETICS”雜志認(rèn)為,未來5-10年與人類健康有關(guān)的十大生物技術(shù)為:1.分子診斷;2)重組疫苗;3)藥物與疫苗輸送技術(shù);4)環(huán)保生物技術(shù);5)病原體測序技術(shù);6)防御性傳播疾病新技術(shù);7)識(shí)別藥物靶標(biāo)生物技術(shù);8)高營養(yǎng)價(jià)值轉(zhuǎn)基因作物技術(shù);9)可降低激素和干擾素等治療性蛋白質(zhì)技術(shù);10)促進(jìn)新藥研制開發(fā)組合化學(xué)技術(shù).第一百零三頁，共203頁?；蚬こ?/p>

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超級(jí)鼠第一百零四頁，共203頁。轉(zhuǎn)基因技術(shù)1)植物轉(zhuǎn)基因2)動(dòng)物轉(zhuǎn)基因第一百零五頁，共203頁。植物基因工程植物基因工程的依據(jù)與原理:1)植物體細(xì)胞具有全能性,可發(fā)育為完正個(gè)體.2)經(jīng)外源基因遺傳轉(zhuǎn)化的體細(xì)胞可以再生成完整植株.第一百零六頁，共203頁。植物細(xì)胞的全能性第一百零七頁，共203頁。植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體由天然的土壤根瘤菌或農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)的Ti質(zhì)粒衍生的基因工程載體.L:左邊界;R:右邊界.借助農(nóng)桿菌感染介導(dǎo),被切下的邊界順序及內(nèi)部順序可整合到宿主細(xì)胞染色體中,篩選后可獲得轉(zhuǎn)化子.第一百零八頁，共203頁。植物轉(zhuǎn)基因的一般程序第一百零九頁，共203頁。轉(zhuǎn)基因是如何導(dǎo)入宿主細(xì)胞的?植物轉(zhuǎn)基因的導(dǎo)入有三種方法:

生物介導(dǎo):農(nóng)桿菌感染法物理方法:直接導(dǎo)入,基因槍法化學(xué)方法:直接導(dǎo)入,脫去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體在PEG和CaCl2的介導(dǎo)下由細(xì)胞直接攝取外源DNA.第一百一十頁，共203頁。外源基因如何進(jìn)入細(xì)胞?農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移有如下步驟:1.植物受傷,傷口分泌有機(jī)化合物—酚類物質(zhì).2.酚類物質(zhì)吸引農(nóng)桿菌趨向傷口.3.農(nóng)桿菌接觸細(xì)胞,將T-DNA(轉(zhuǎn)移DNA)切離,4.T-DNA通過跨膜遂道進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),并穿過核膜進(jìn)入細(xì)胞核.5.進(jìn)入細(xì)胞核的T-DNA整合到宿主細(xì)胞的染色體上.6.轉(zhuǎn)基因表達(dá).第一百一十一頁，共203頁。外源T-DNA進(jìn)入植物細(xì)胞的機(jī)制第一百一十二頁，共203頁?？瓜x毒蛋白的殺蟲機(jī)理天然的昆蟲腸道內(nèi)有寄生的蘇云金桿菌,這是一種芽孢桿菌.蘇云金芽孢桿菌在營養(yǎng)條件不利時(shí)會(huì)在細(xì)胞內(nèi)形成蛋白質(zhì)伴胞晶體.當(dāng)昆蟲蠶食葉片時(shí),會(huì)將葉片上的蘇云金桿菌食入腸道內(nèi),蘇云金桿菌會(huì)將蛋白質(zhì)伴胞晶體釋放.在昆蟲腸道堿性蛋白酶作用下,伴胞晶體蛋白被酶切釋放出毒蛋白多肽(Bttoxin).毒蛋白多肽與昆蟲腸道細(xì)胞表面的糖蛋白結(jié)合,使細(xì)胞膜穿孔,造成細(xì)胞內(nèi)外滲透壓失控,使昆蟲厭食直至死亡.第一百一十三頁，共203頁?？瓜x棉基因工程第一百一十四頁，共203頁。是雙價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，由中國農(nóng)科院研究所和中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所共同選育。該品種在黃河流域抗蟲棉區(qū)試驗(yàn)，皮棉畝產(chǎn)85.2～99.2公斤，超過對(duì)照抗蟲雜交棉中棉所29和中棉所38.在河南、山東大面積生產(chǎn)示范中平均皮棉畝產(chǎn)90公斤以上，比美國33B增產(chǎn)25%。絨長29.7毫米，比強(qiáng)度21.9cN/tex，馬克隆值4.6。我國選育出一批轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，8個(gè)品種通過審定。中棉所41：含有Bt和CpTI雙價(jià)抗蟲基因，抗蟲性有雙重效果，尤其中后期抗蟲性顯著高于美國33B。抗枯萎病耐黃萎病。第一百一十五頁，共203頁。復(fù)旦大學(xué)楊金水教授領(lǐng)導(dǎo)的課題組做出了重大貢獻(xiàn)。116轉(zhuǎn)基因優(yōu)質(zhì)棉----改變棉花纖維品質(zhì)楊金水教授課題組與中國棉花研究所2006年開始棉花纖維品質(zhì)轉(zhuǎn)基因改良實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過6年不懈的努力，獲得一批在棉花育種和生產(chǎn)上具有極高應(yīng)用價(jià)值的轉(zhuǎn)基因棉花品系。轉(zhuǎn)csRRM基因棉花，將對(duì)照棉花的平均單鈴重從5.5克提高到7.5克，鈴重增加36%，顯著高于一般棉花品種。棉花由于生殖生長與營養(yǎng)生長同步進(jìn)行，很容易掉鈴。csRRM轉(zhuǎn)基因棉花因生長勢(shì)強(qiáng)，干物質(zhì)積累多，結(jié)鈴性比一般棉花品種提高20%以上。最值得強(qiáng)調(diào)的是，csRRM轉(zhuǎn)基因棉花顯著增加了棉纖維長度，使對(duì)照棉纖維長由平均30.5mm提高到平均33.5mm，比一般棉花品種增長3mm左右，在高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)品種培育方面具有非常大的應(yīng)用潛力。第一百一十六頁，共203頁。耐儲(chǔ)藏番茄基因工程1)在番茄果實(shí)成熟時(shí),細(xì)胞會(huì)適時(shí)地合成許多促使果實(shí)成熟的蛋白質(zhì)或酶,多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)是其中之一.2)多聚半乳糖醛酸酶具有分解細(xì)胞之間的果膠質(zhì)的活性,可使果實(shí)軟化,降低果實(shí)的硬度.3)為了延緩番茄的軟化時(shí)間,提高果實(shí)的抗損傷強(qiáng)度,提高耐儲(chǔ)藏性,同時(shí)又保持番茄原有的品質(zhì),采用反義基因干擾的技術(shù),將PG酶活性將至正常果實(shí)的1%.這一方法使番茄保鮮期延長一倍,仍基本保持原有品質(zhì).第一百一十七頁，共203頁?；蚬こ瘫ｕr番茄1983年第一個(gè)轉(zhuǎn)基因耐貯藏的番茄問世第一百一十八頁，共203頁?？钩輨┗蚬こ屉s草是世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的大敵，它在天地里和農(nóng)作物爭奪陽光、水分和養(yǎng)料。我國每年因?yàn)殡s草為害，各種農(nóng)產(chǎn)品的損失達(dá)13.5%，其中糧食達(dá)350億斤。如果靠噴灑除草劑除掉田間的雜草，在除去雜草的同時(shí)，也往往會(huì)殺死農(nóng)作物。為了能夠有針對(duì)性地去除雜草，科學(xué)家從植物中篩選了耐除草劑的基因，并把這種基因轉(zhuǎn)到農(nóng)作物中，種植了能抗除草劑的轉(zhuǎn)基因作物，農(nóng)民只要施加少量的除草劑就能既除去雜草，又不損害農(nóng)作物。而且減少了除草劑的用量，也就降低了對(duì)土壤等生態(tài)環(huán)境的污染。第一百一十九頁，共203頁。人們對(duì)制作抗除草劑的轉(zhuǎn)基因作物的生物學(xué)操作有很多設(shè)想，如：抑制植物對(duì)除草劑的吸收；降低對(duì)除草劑敏感的靶蛋白與除草劑的親和力；賦予植物在新陳代謝過程種使除草劑失活的能力。這些策略的指導(dǎo)下，已經(jīng)培育出了各種抗除草劑的轉(zhuǎn)基因作物，如草甘膦，膦絲菌素等。把抗草甘膦基因引入植物，可使這種基因工程作物獲得抗草甘膦的能力。此時(shí)若用草甘膦除草，則可選擇性地除掉雜草，這種作物因不受損害而繼續(xù)生長。美國科學(xué)家已成功地將這種突變的抗草甘膦的EPSP基因引入大豆、煙草中，轉(zhuǎn)化植株獲得了抗草甘膦的能力。現(xiàn)在已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化種植的抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物主要有大豆、玉米和棉花。第一百二十頁，共203頁。草甘膦（glyphosate）特點(diǎn)：是一種廣譜除草劑，它具有無毒、易分解、無殘留和不污染環(huán)境等特點(diǎn)，因而得到廣泛的使用。它的靶位是植物葉綠體中的一個(gè)重要酶——內(nèi)丙酮莽草酸磷酸合成酶（5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphatesynthetase,EPSP）。草甘膦通過抑制EPSP活性而阻斷芳香族氨基酸的合成，最終導(dǎo)致受試植物的死亡。第一百二十一頁，共203頁。大豆大豆為世界性的重要作物。大豆對(duì)人體健康非常有益。已經(jīng)證明大豆可以降低膽固醇，預(yù)防心臟病、冠狀動(dòng)脈硬化，還可以預(yù)防癌癥，包括乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌等；緩解更年期綜合癥，預(yù)防骨質(zhì)疏松。有人認(rèn)為：大豆是二十一世紀(jì)的維生素。人們對(duì)大豆食品需求的增長促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因大豆種植面積的增大。美國，自2001年以來，轉(zhuǎn)基因大豆種植面積以每年160萬～200萬公頃的幅度增加。除了大豆、玉米、棉花，2004年，孟山都公司培育的轉(zhuǎn)基因小麥MON71800成為美國批準(zhǔn)商業(yè)化種植的第一個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥品種。這種小麥中導(dǎo)入的也是耐除草劑的基因。第一百二十二頁，共203頁。富含維生素“黃金米”維生素A缺乏（簡稱VAD）導(dǎo)致夜盲，嚴(yán)重者失明。全球目前已有78個(gè)國家，四分之一的學(xué)齡兒童（1.27億）存在VAD問題，每年有超過25萬少年兒童為此失明。2002年中國3-12歲兒童維生素A缺乏率為9.3%，農(nóng)村為11.2%；在西南等貧困地區(qū)，其比率高達(dá)50%。水稻是全世界一半以上人群的主糧，尤其是窮人的主糧，如果能提高水稻中維生素A的含量，那么全世界窮人的維生素A缺乏問題就迎刃而解.瑞士IngoPotrykus教授1992年培育了第一代“黃金大米”，他被評(píng)為目前在世的對(duì)生物技術(shù)貢獻(xiàn)最大的100人之一。Potrykus教授將把細(xì)菌和黃水仙中合成維生素A的4個(gè)基因?qū)胨局校屗镜木S生素A的含量從零提高到一點(diǎn)幾微克/克。著名生物技術(shù)公司先正達(dá)公司從玉米中找到了功效更強(qiáng)的基因，培育了第二代的“黃金大米”，讓維生素A的含量一下提高了幾十倍，每人每天只要吃不到2兩大米就可以滿足全天的需要。黃金稻并不能直接產(chǎn)生維生素A，而是beta-胡蘿卜素，在人體里可以轉(zhuǎn)化為維生素A。這種轉(zhuǎn)化效果如何，需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在中美聯(lián)合的這個(gè)試驗(yàn)中給出了完美的答案（3），兒童每天吃2-3兩米飯（大約是一兩干大米）可以滿足兒童一天60%的維生素A需求，和吃維生素A丸的效果一樣。第一百二十三頁，共203頁。玫瑰花沒有產(chǎn)生藍(lán)色色素的基因。雖然玫瑰有5000多年的人工栽培2500多個(gè)品種,但始終沒有藍(lán)玫瑰的身影。藍(lán)色妖姬“藍(lán)色妖姬”最早來自荷蘭是一種加工花卉。它是等白玫瑰（或白月季）快到花期時(shí)，開始用染料澆灌花卉，讓花像吸水一樣，將著色劑吸入進(jìn)行染色。第一百二十四頁，共203頁。藍(lán)色妖姬的產(chǎn)生克隆合成藍(lán)色素的基因（目地基因）三色紫羅蘭白玫瑰（受體）導(dǎo)入日本SuntoryLtd公司14年努力終于在2009年取得了突破。第一百二十五頁，共203頁。用于植物改良的外源基因1）標(biāo)記基因或報(bào)告基因(reportgene)抗新霉素基因（neomycin，NPTII），抗潮霉素基因（hygromycin），抗氯霉素基因2）目的基因Bt毒蛋白基因，抗除草劑基因，蛋白質(zhì)酶抑制劑基因，番茄耐儲(chǔ)藏基因（反義多聚半乳糖醛酸酶基因），抗凍基因，凝集素基因（lectin），病毒外殼蛋白基因，蝎素和蜘蛛毒素基因，淀粉酶抑制劑基因等第一百二十六頁，共203頁。轉(zhuǎn)基因植物已從科學(xué)家的實(shí)驗(yàn)室走入農(nóng)民的大田，共有三十幾個(gè)國家批準(zhǔn)了數(shù)千例轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)入田間試驗(yàn)，設(shè)計(jì)的植物種類有40多種。2004年，美國已批準(zhǔn)商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物品種總數(shù)達(dá)到了59個(gè)，其中包括轉(zhuǎn)基因玉米品種17個(gè)，油菜品種9個(gè)，棉花品種8個(gè)，番茄品種6個(gè)，土豆品種4個(gè)，大豆品種3個(gè)，甜菜品種3個(gè)，南瓜品種2個(gè)，水稻、小麥、亞麻、木瓜、羅馬甜瓜、菊苣和匍匐剪股穎品種各1個(gè)。我國的科學(xué)家自國家“863”高技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃實(shí)施以來，利用基因工程技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的農(nóng)作物抗病、抗蟲，品質(zhì)改良等研究中取得了很大進(jìn)展，轉(zhuǎn)基因工程已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大顯身手，成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的新亮點(diǎn)。第一百二十七頁，共203頁。現(xiàn)已種植的轉(zhuǎn)基因商用作物

第一百二十八頁，共203頁。基因治療1)基因治療是一種分子遺傳學(xué)技術(shù),系指將外源的正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和基因異常引起的遺傳疾病.2)其他疾病研究后來居上第一百二十九頁，共203頁?；蛑委?新的醫(yī)學(xué)革命

*基因治療是把藥物工廠開到人體里去，在需要的時(shí)候就生產(chǎn)藥物，不需要的時(shí)候自動(dòng)關(guān)閉。將正常有功能的基因?qū)肴梭w,以基因作為藥物治療疾病.*基因治療醫(yī)藥工業(yè)的第四次革命。

第一百三十頁，共203頁。基因治療的基本原理第一百三十一頁，共203頁。基因治療什么病?遺傳病:基因先天缺陷,理論上疾病治療的希望根本所在;如隱性單基因遺傳病.腫瘤:為腫瘤治療提供了一條新路,發(fā)展迅速,具有潛在的商業(yè)價(jià)值傳染病:艾滋病,肝炎等疾病的治療一種新的嘗試.其他疾病:心腦血管疾病,神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,不妨一試,意外效果.第一百三十二頁，共203頁?；蛑委?從治療到預(yù)防基因治療不僅可以用于疾病的治療,還可以用于疾病的預(yù)防.

傳染病的預(yù)防:基因免疫(DNA疫苗),肝炎,肺結(jié)核,腹瀉,流感等;HIV預(yù)防

腫瘤預(yù)防:鼻咽癌,宮頸癌病毒導(dǎo)致腫瘤等;

腫瘤復(fù)發(fā)預(yù)防:各種基因轉(zhuǎn)移腫瘤瘤苗免疫第一百三十三頁，共203頁。基因治療--從治療到提高

基因治療不僅可以用于疾病的治療和預(yù)防,還可以用于人類生活質(zhì)量的提高和改善.1.肥胖,禿頂患者的福音2.長命百歲不再難求3.耳聰目明易如反掌4.性格重塑隨心所欲問題焦點(diǎn):基因治療的倫理學(xué)的挑戰(zhàn)第一百三十四頁，共203頁?；蛑委?-三大要素1.基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)2.基因表達(dá)調(diào)控3.治療相關(guān)基因第一百三十五頁，共203頁?！安《尽币彩切疫\(yùn)的使者基因治療的“

槍炮”---基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)第一百三十六頁，共203頁。基因治療的“彈藥”-----基因

基因治療如同武器,基因轉(zhuǎn)移方法是槍炮,而治療所選用的基因就是彈藥.基因來源于人類對(duì)疾病分子病理的認(rèn)識(shí),基因功能的研究.如:CFTR基因與CF基因治療基因治療是人類基因組計(jì)劃研究--功能基因組研究的最大受益者之一.第一百三十七頁，共203頁?；蛑委熝芯繗v史回顧60年代Lederberg設(shè)想基因治療遺傳病1980年，美國Cline主持了β－地中海貧血的基因治療,引發(fā)社會(huì)風(fēng)波1980-1989年,美國Anderson為首的科學(xué)家爭取社會(huì)和政府的支持理解，F(xiàn)DA和RAC制定了基因治療審批管理方案1989年美國Rosenberg經(jīng)FDA批準(zhǔn)主持腫瘤患者標(biāo)志基因轉(zhuǎn)移臨床試驗(yàn).1990年,美國Culver/Blease主持世界首例ADA缺乏癥基因治療臨床試驗(yàn).第一百三十八頁，共203頁?；蛑委熝芯楷F(xiàn)狀基因治療從1989年進(jìn)入臨床試驗(yàn)以來,從相對(duì)禁錮到迅速發(fā)展,過熱泛濫,反思降溫,平穩(wěn)發(fā)展,猛烈抨擊,捷報(bào)頻傳等階段,幾經(jīng)波折,充分體現(xiàn)了新生事物發(fā)展規(guī)律.但是,無論基因治療發(fā)展坎坷如何,科學(xué)家堅(jiān)信,基因治療是一場醫(yī)學(xué)革命,在21世紀(jì)將真正走向臨床,為人類造福.2003我國批準(zhǔn)了世界首個(gè)腺病毒P53腫瘤基因治療藥物，標(biāo)志著基因治療已經(jīng)真正走向臨床應(yīng)用。第一百三十九頁，共203頁。世界上第一例成功的基因治療1)1990年9月美國國家健康研究院(NIH)的醫(yī)生進(jìn)行了第一例基因治療,患者是一位年僅4歲的小女孩,AshantiDeSilva,她患的是遺傳性免疫缺陷癥SCID.由于免疫系統(tǒng)缺陷不能接觸外界空氣,只能生活在無菌的隔離房中,所以又稱為“bubbleboy”病(泡泡病孩).2)Ashanti的白細(xì)胞接受了一種基因組中缺少的可以合成免疫系統(tǒng)蛋白質(zhì)的基因,因而她可以在戶外活動(dòng),不必關(guān)在無菌的玻璃房中.3)由于這種經(jīng)遺傳校正的白細(xì)胞只能工作幾個(gè)月,因此Ashanti必需定期接受基因治療,注射遺傳校正的白細(xì)胞.第一百四十頁，共203頁。重癥組合免疫缺陷癥是一種遺傳

病

第一百四十一頁，共203頁。什么是SCID?1)SCID是英文Severecombinedimmuno-deficiency(重癥組合免疫缺陷)的簡稱.2)SCID可由不同的遺傳缺陷引起,目前已知:1.人類細(xì)胞間質(zhì)素受體gamma亞基基因(X-染色體)(ILRG),2.ILRG下游信號(hào)傳導(dǎo)JAK3基因(19號(hào)染體);3.編碼腺苷酸脫氨酶(adenosinedeaminase,ADA)基因,

上述三個(gè)基因的突變均會(huì)引起SCID.第一百四十二頁，共203頁。如何治療SCID

?第一百四十三頁，共203頁。世界首例ADA缺乏癥基因治療患者走出隔離病房第一百四十四頁，共203頁。復(fù)旦大學(xué)等進(jìn)行了世界首次血友病B基因治療第一百四十五頁，共203頁。反義核酸與反基因技術(shù)

針對(duì)特定的基因，人工合成一段修飾的寡核苷酸序列，或采用反義序列的表達(dá)載體，在人體細(xì)胞內(nèi)特異抑制特定基因的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄。寡核苷酸修飾的必要性：延長半衰期，抗降解。特點(diǎn)：針對(duì)性強(qiáng)，設(shè)計(jì)合成簡單不足：細(xì)胞屏障，持續(xù)給藥，效率？

實(shí)例:ISIP抗艾滋病的反義核酸藥物上市第一百四十六頁，共203頁。DNA指紋1)廣義的DNA指紋泛指所有能夠進(jìn)行個(gè)體識(shí)別的DNA多態(tài)性(片段)的組成。狹義的DNA指紋系杰弗瑞斯最初提出的建立在限制性酶切和探針(Southern)雜交基礎(chǔ)上的DNA多態(tài)性圖譜(分析技術(shù))。2)DNA多態(tài)性系指同一種群的不同個(gè)體在同源染色體的相同位點(diǎn)DNA順序組成的差異.3)1985年，杰弗瑞斯及其同事采用血紅蛋白基因第一內(nèi)含子中的短串聯(lián)重復(fù)序列作為探針在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交得到了包含十幾條條帶的雜交圖譜，不同個(gè)體雜交圖譜上條帶的位置差別很大，就象人的指紋一樣，于是杰弗瑞斯就把它稱為DNA指紋。第一百四十七頁，共203頁。DNA指紋的繪制從血液或其他組織中提取DNA，用重復(fù)順序兩側(cè)序列作為引物擴(kuò)放基因組DNA可獲得很多長短不一的片段，把這些片段通過電泳的方法按長短分開，然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，固定，采用放射性或非放射性標(biāo)記的探針（探針主要是短串聯(lián)重復(fù)序列的核心序列）雜交。雜交的結(jié)果可以通過放射自顯影或染色處理顯示出來，形成由復(fù)雜條帶組成的圖譜，不同個(gè)體由于在不同位點(diǎn)短串聯(lián)重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)不同，因此雜交條帶的長短不同.第一百四十八頁，共203頁。1988年DNA指紋

在美國首次被認(rèn)可作為法庭證據(jù)故事發(fā)生地:佛羅里達(dá)，奧蘭多

案情:1986年12月，奧蘭多的警探搜捕在這個(gè)城市的南部已經(jīng)連續(xù)作案不下23次的強(qiáng)奸犯。DNA指紋的命運(yùn):1987年8月,阿倫·朱斯蒂博士完成了嫌犯托米·李·安德魯?shù)腄NA指紋檢測,與現(xiàn)場留下的DNA樣品一致.由擔(dān)心不同個(gè)體存在DNA指紋相同的可能,加上無其他證據(jù),起訴人被迫撤回控告。柳暗花明:1988年2月重審霍奇一案。DNA證據(jù)被認(rèn)為具有重大意義。貝里德和麻省理工學(xué)院的生物學(xué)家豪斯曼，證明血樣的DNA與精液的DNA相匹配。陪審團(tuán)聽取了這些意見，1988年2月5日，法庭宣告安德魯有罪，被控為連續(xù)強(qiáng)奸犯，他被判監(jiān)禁達(dá)115年。這個(gè)案子的結(jié)案，標(biāo)明美國的法庭審判第一次承認(rèn)并接受DNA測試可作為證據(jù).

第一百四十九頁，共203頁。DNA指

紋

與

身

份

確

認(rèn)第一百五十頁，共203頁。親子鑒定-DNA指紋

通過用限制性內(nèi)切酶消化和與特異的核心探針（VNTR）雜交取得不同大小的DNA片段的多區(qū)帶圖譜，DNA指紋圖被認(rèn)為對(duì)某一個(gè)體是獨(dú)特的。目前的DNA指紋是指不同的STR特異基因組合,最為常見的是國際通用的15個(gè)STR組合。

父親母親子女1子女2子女3第一百五十一頁，共203頁。未來的基因芯片具有人體特征第一百五十二頁，共203頁。DNA芯片DNA芯片是在很小的幾何尺度的表面積上，裝配高度密集的固定的單鏈或可變性雙鏈DNA，同時(shí)檢測和研究不同生物細(xì)胞DNA的特性，以及它們之間的相互作用，獲得生命微觀活動(dòng)規(guī)律的一項(xiàng)分子生物學(xué)技術(shù)。它的本質(zhì)是進(jìn)行生物信號(hào)的平行分析，利用微點(diǎn)陣(miroarray)技術(shù)將成千上萬的DNA信息集中到一小片固相基質(zhì)上，在盡量小的空間范圍內(nèi)，以盡量快的速度完成樣品的遺傳信息分析。

第一百五十三頁，共203頁。D

N

A

芯

片見網(wǎng)站第一百五十四頁，共203頁。

DNA芯片探針的合成(左)與雜交(右)第一百五十五頁，共203頁。DNA芯片

的檢測A)在1cm2小塊玻片上有成千上萬個(gè)小方塊組成的視框,上面有附著其上的由不同堿基順序組成的DNA單鏈.B)將需要檢測的5個(gè)DNA樣品經(jīng)PCR放大后用熒光染料標(biāo)記,然后與DNA芯片雜交.DNA芯片含有多種順序,雜交洗片后在顯微鏡下可檢測熒光信號(hào)顯示所需要的信息..第一百五十六頁，共203頁。分子診斷---艾滋病病源檢測第一百五十七頁，共203頁。體細(xì)胞克隆第一百五十八頁，共203頁。體細(xì)胞克隆---早期的實(shí)驗(yàn)第一百五十九頁，共203頁。體細(xì)胞克隆

--多利羊第一百六十頁，共203頁。

目前已成功克隆的哺乳動(dòng)物

1)綿羊(sheep)2)山羊(goat)3)小鼠(mouse)4)大鼠(rat)5)貓(cat)6)豬(pig)7)牛(cattle)8)馬(horse)第一百六十一頁，共203頁。動(dòng)物轉(zhuǎn)基因—生物反應(yīng)器第一百六十二頁，共203頁。干細(xì)胞(stemcell)1)干細(xì)胞:具有分裂和分化潛能的細(xì)胞稱為干細(xì)胞,干細(xì)胞在適合的條件下可分化形成不同類型的細(xì)胞群.2)單能干細(xì)胞:僅能分裂形成同類型的子代細(xì)胞.2)多能干細(xì)胞:僅可分化為少數(shù)不同類型的細(xì)胞,如某些胚胎干細(xì)胞可分化為肌肉細(xì)胞,神經(jīng)細(xì)胞,骨骼細(xì)胞等.3)全能干細(xì)胞:可以分化所有細(xì)胞類型的細(xì)胞,如哺乳動(dòng)物囊胚期細(xì)胞可分化為各種類型細(xì)胞.全能干細(xì)胞主要就是胚胎干細(xì)胞，它能分化成人體200多種細(xì)胞類型，形成機(jī)體的任何細(xì)胞、組織和器官。第一百六十三頁，共203頁。干細(xì)胞研究的意義在人工條件下將干細(xì)胞定向分化為所需的細(xì)胞、組織乃至器官，可以用來治療目前還難以或無法治愈的帕金森氏病、早老性癡呆、白血病、糖尿病等頑癥，解決十分緊缺的組織和器官移植的來源問題。如果進(jìn)一步與克隆技術(shù)相結(jié)合，運(yùn)用體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)來得到胚胎干細(xì)胞，還能解決細(xì)胞治療以及組織和器官移植的免疫排異難題。第一百六十四頁，共203頁。胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞主要有三個(gè)來源：1）(自然和人工)流產(chǎn)的胚胎；2）輔助生殖剩余的胚胎；3）通過體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移術(shù)得到的胚胎。第一百六十五頁，共203頁。胚胎干細(xì)胞研究與利用的爭論1)不管哪一個(gè)來源，提取胚胎干細(xì)胞必定會(huì)損毀胚胎。于是，胚胎是不是生命，是不人，研究胚胎干細(xì)胞是不是“毀滅生命”、“人”，很自然地成為爭論的焦點(diǎn)。2)胚胎的定義:3)胚胎是不是生命?第一百六十六頁，共203頁。其它生物技術(shù)1)蛋白質(zhì)工程:利用重組DNA技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行改造,生產(chǎn)具有更高活性,療效和產(chǎn)率的蛋白質(zhì)產(chǎn)品.2)發(fā)酵工程:利用微生物代謝產(chǎn)生的中間產(chǎn)物采用工業(yè)化的方法大規(guī)模生產(chǎn)特定化合物的方法,如釀酒,制藥等.3)細(xì)胞工程:某些特定的化合物只有特別的細(xì)胞類型才能生產(chǎn).可通過組織培養(yǎng)獲得大量細(xì)胞,從中提取所需化合物,如螺旋藻生產(chǎn)β-胡蘿卜素,組織培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇等.第一百六十七頁，共203頁。生物技術(shù)安全性1)食物安全性2)生態(tài)安全性3)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)第一百六十八頁，共203頁。生物技術(shù)安全性1)經(jīng)基因工程改良(GM)動(dòng)植物用作人類食物或直接食用某些基因工程產(chǎn)品時(shí)是否對(duì)人體健康產(chǎn)生短期或長期的危害.2)經(jīng)基因工程改良(GM)動(dòng)植物特別是農(nóng)作物是否會(huì)向天然的野生物種擴(kuò)散,這種擴(kuò)散是否會(huì)造成生態(tài)災(zāi)難.其他安全性問題？第一百六十九頁，共203頁。轉(zhuǎn)基因作物食用的安全性1）1988年，一家日本企業(yè)向美國市場投放了一種轉(zhuǎn)基因細(xì)菌合成的用作鎮(zhèn)靜劑的色氨酸。第二年，用過這種產(chǎn)品的數(shù)千人出現(xiàn)肌肉疼痛，呼吸困難，咳嗽，皮疹等癥狀。后從樣品中檢測出兩種毒素，從這一事件開始引起人們對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性的關(guān)注。2）美國康奈爾大學(xué)羅西發(fā)表了一篇論文，報(bào)道