凱氏定氮法測定食品中蛋白質

凱氏定氮法測定食品中蛋白質第1頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四凱氏定氮法

測定食品中蛋白質

第2頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四一、概述

蛋白質是以氨基酸為最小構成單元的大分子的含氮化合物，它是由20種氨基酸通過酰氨鍵以一定方式結合，并具有一定的空間結構。第3頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四1生命的物質基礎3遺傳信息的表達方式5人及動物需要從食品得到蛋白質及其分解產(chǎn)物，來構成自身的蛋白質2維持酸堿平衡、水平衡4維持物質的代謝及運轉6營養(yǎng)指標、食品生產(chǎn)工藝指標。生理功能及在食品中的作用第4頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四常見食物中蛋白質的含量牛肉螺旋藻第5頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四常見食物氮系數(shù)氮系數(shù)：蛋白質含氮量的倒數(shù)，常用6.25表示。第6頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四蛋白質測定方法方法時間應用范圍優(yōu)缺點凱氏定氮法8-10h0.2-1.0mg氮時間長雙縮脲法20-30min1-10mg氮靈敏度低、快速檢測Folin－酚試劑法40-60min<5mg氮靈敏度高、耗時長、試劑配制困難紫外吸收法考馬斯亮藍法5-10min5-15min50-100mg蛋白質0～0.1mg/mL層析柱流出物檢測較好，標準曲線有輕微非線性第7頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四二、凱氏定氮法測定蛋白質（粗蛋白）

凱氏定氮法是通過測出樣品中的總含氮量再乘以相應的蛋白質系數(shù)而求出蛋白質的含量。1.原理1樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出2樣品中的有機氮轉化為氨與硫酸結合成硫酸銨3加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標準鹽酸溶液滴定第8頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四消化蒸餾吸收、滴定計算2.實驗步驟第9頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四第一步：樣品消化

樣品與濃硫酸加熱消化，硫酸使有機物脫水并破壞有機物，C、H氧化為二氧化碳、水逸出，蛋白質分解為氨、與硫酸結合生成硫酸銨、留在溶液中

對原子的前處理，使被測物質進入溶液中，使不溶變?yōu)榭扇堋⒂袡C物分解為可溶性無機物消化第10頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四（1）消化總反應式：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用濃硫酸（98%）第11頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四消化裝置“自動回流消化儀”第12頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四定氮消化的不同狀態(tài)RCH2(NH2)COOH+H2SO4→CO2+H2O+SO2+(NH4）2SO4澄清消泡碳化第13頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四消化過程中試劑作用硫酸鉀：提高溶液沸點、加快反應進程；硫酸銅（藍綠色）：催化作用褐色第14頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四(NH4)2SO4+2NaOH→NH3+Na2SO4+2H2O第二步——蒸餾第15頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四01氫氧化鈉需過量、若不夠，會生成H2S,H2S是強酸，會使溶液顏色變紅02防止樣液中氨氣逸出。注意事項：第16頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四(3）吸收與滴定吸收：加熱蒸餾所放出的氨，硼酸溶液滴定：鹽酸標準溶液，

硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8×10-10），用酸滴定不影響指示劑的變色反應，它有吸收氨的作用

硫酸、鹽酸溶液也可用作吸收劑。第17頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四各步驟操作細節(jié)圖解：

樣品消化→蒸餾→滴定（1）樣品消化樣品+0.4g硫酸銅+6g硫酸鉀+20ml濃硫酸+玻珠數(shù)粒先小火炭化，無泡沫后，加大火力，液體變藍綠透明，繼續(xù)加熱微沸30分鐘45度角消化終點瓶口不能對著人蓋上小漏斗第18頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四（2）蒸餾將消化液全部轉移到100ml容量瓶中加10ml硼酸溶液和混合指示劑2～3d加入NaOH溶液后顏色為深藍色或褐色通入蒸汽開始蒸餾冷凝管下口浸入硼酸溶液中取10ml消化稀釋液沿小玻璃杯移入反應室，少量蒸餾水沖洗，塞緊棒狀玻璃塞，向小玻璃杯內加入10ml40%NaOH,提起玻璃塞，使NaOH緩慢流入反應室，立即塞緊玻璃塞，并在小玻璃杯中加水使之密封。第19頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四吸收液變藍色后繼續(xù)蒸餾5分鐘，將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管尖端，取下接收瓶，關閉電源第20頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四（3）滴定取下接收瓶，用0.1000mol/L的鹽酸或硫酸標準溶液滴定至終點。滴定前滴定終點同時做一試劑空白實驗，記錄空白滴定消耗鹽酸的體積。第21頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四實驗注意事項—消化（1）不時轉動凱氏燒瓶、緩和沸騰消化（2）消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘，一般消化時間約4小時（3）可加如少量辛醇、硅油做消泡劑（4）樣品不易澄清時可冷卻后加入30%過氧化氫2-3ml第22頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四小結第23頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四第24頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四自動凱氏定氮儀法在凱氏定氮法的基礎上發(fā)展起來的自動凱氏定氮儀法，具有安全、高效、準確的優(yōu)點。儀器：消化爐自動蒸餾裝置第25頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四

1、原理及適用范圍2、特點：

（1）消化裝置用優(yōu)質玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時消化8個樣品，30分鐘可消化完畢。（3）自動：自動加堿蒸餾，自動吸收和滴定，自動數(shù)字顯示裝置。可計算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成1個樣。第26頁，共28頁，2023年，2月20日，星期四雙縮脲法（分光光度法）1.原理——雙縮脲反應

堿性條件下、雙縮脲與硫酸銅作用生成紫紅色配合物的反應。

肽鍵（-CO-NH-）與雙縮脲結構相似、能呈現(xiàn)此反應。

560nm處、由顏色深淺判定蛋白質含量