生物下游技術(shù)課件

第三章

發(fā)酵液預(yù)處理目的不僅在于分離細(xì)胞、菌體和其它懸浮顆粒（細(xì)胞碎片、核酸和蛋白質(zhì)的沉淀物），還希望除去部分可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液的性質(zhì)，以利于后繼各步操作。采用絮凝或凝聚的方法，設(shè)法增大懸浮液中固體粒子的大小，提高其沉降速度；或采用稀釋、加熱等方法降低黏度，以利于過濾。改善發(fā)酵液過濾特性的物理化學(xué)方法：調(diào)酸（等電點(diǎn)）、熱處理、電解質(zhì)處理、添加凝聚劑、添加表面活性物質(zhì)、添加反應(yīng)劑、冷凍-解凍及添加助濾劑等。1.降低液體粘度

2.調(diào)整pH3.凝聚與絮凝

根據(jù)流體力學(xué)原理，濾液通過濾餅的速率與液體的粘度成反比，降低液體粘度（加水稀釋法和加熱法等）可有效提高過濾速率。注意加熱溫度與時間，不影響產(chǎn)物活性和細(xì)胞的完整性。pH值直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，適當(dāng)調(diào)節(jié)pH值可改善其過濾特性。氨基酸、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的調(diào)節(jié)；在膜過濾中，發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)易與膜發(fā)生吸附，通過調(diào)整pH值改變易吸附分子的電荷性質(zhì)，即可減少堵塞和污染；細(xì)胞、細(xì)胞碎片及某些膠體物質(zhì)等在某個pH值下也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于過濾的進(jìn)行。采用凝聚和絮凝技術(shù)能有效改變細(xì)胞、細(xì)胞碎片及溶解大分子物質(zhì)的分散狀態(tài)，使其聚結(jié)成較大的顆粒，便于提高過濾速率。另外，還能有效地除去雜蛋白和固體雜質(zhì)，提高濾液質(zhì)量。凝聚——指在電解質(zhì)作用下，由于膠粒之間雙電層電排斥作用降低，電位下降，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象；絮凝——指在某些高分子絮凝劑存在下，基于橋架作用，使膠粒形成較大絮凝團(tuán)的過程。采用絮凝法可形成粗大的絮凝體，使發(fā)酵液較易分離。絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對分子質(zhì)量可高達(dá)數(shù)萬至一千萬以上，長鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上含有許多活性官能團(tuán)，包括帶電荷的陰離子（如---COOH）或陽離子（如---NH2）基團(tuán)以及不帶電荷的非離子型基團(tuán)。它們通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，強(qiáng)烈地吸附在膠粒的表面。當(dāng)一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上，產(chǎn)生橋架聯(lián)結(jié)時，就形成了較大的絮團(tuán)，這就是絮凝作用。（2）絮凝高分子絮凝劑的吸附和絮凝作用示意圖1）有機(jī)高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物；2）無機(jī)高分子聚合物，如聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等；3）天然有機(jī)高分子絮凝劑，如聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等。目前最常見的高分子聚合物絮凝劑有機(jī)合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）類衍生物根據(jù)活性基團(tuán)在水中解離情況不同，可分為三類：非離子型、陰離子型（含有羧基）陽離子型（含有胺基）工業(yè)上使用的絮凝劑可分為三類：聚丙烯酰胺類絮凝劑的優(yōu)點(diǎn)用量少，一般以mg/L計(jì)量；絮凝體粗大，分離效果好；絮凝速度快；種類多，適用范圍廣。聚丙烯酰胺類絮凝劑的缺點(diǎn)存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，用于食品和醫(yī)藥工業(yè)時應(yīng)謹(jǐn)慎。聚丙烯酰胺類絮凝劑的應(yīng)用醫(yī)藥和食品工業(yè)：聚丙烯酸類陰離子絮凝劑（無毒），聚苯乙烯類衍生物，無機(jī)高分子聚合物絮凝劑（聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等），天然有機(jī)高分子絮凝劑（多聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等）。影響絮凝的因素絮凝劑的加量(圖3-1）絮凝劑的分子量溶液的pH攪拌速度攪拌時間對于帶負(fù)電荷的菌體或蛋白質(zhì)來說，采用陽離子型高分子絮凝劑同時具有降低膠粒雙電層電位和產(chǎn)生吸附橋架的雙重機(jī)理；對于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，要采用凝聚和絮凝雙重機(jī)理才能提高過濾效果，這種包括凝聚和絮凝機(jī)理的過程，稱為混凝。（3）混凝發(fā)酵液中的雜質(zhì)高價無機(jī)離子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）雜蛋白在采用離子交換提煉時，會影響樹脂對生化物質(zhì)的交換容量。在采用離子交換和吸附法提取時會降低其交換容量和吸附能力，在有機(jī)溶劑法或雙水相萃取時，易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，使兩相分離不清。在常規(guī)過濾或膜過濾時，易使過濾介質(zhì)堵塞或受污染，影響過濾效率。

因此，在預(yù)處理時，應(yīng)盡量除去這些物質(zhì)。二、發(fā)酵液的相對純化（一）、高價無機(jī)離子的去除方法Ca2+——草酸、草酸鈉，→形成草酸鈣沉淀（注意回收草酸）

；Mg2+——三聚磷酸鈉，→形成三聚磷酸鈉鎂可溶性絡(luò)合物；Fe2+——黃血鹽，→普魯士藍(lán)沉淀（二）雜蛋白的去除方法蛋白質(zhì)一般以膠體狀態(tài)存在于發(fā)酵液中。在酸性溶液中帶正電荷；在堿性溶液中帶負(fù)電荷。在某一pH下，凈電荷為零，溶解度最小，稱為等電點(diǎn)。1.沉淀法2.變性法

加熱大幅度調(diào)節(jié)pH值加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或表面活性劑等。不足之處加熱法只適合于對熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端pH值也會導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且要消耗大量酸堿；有機(jī)溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場合。加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質(zhì)而除去。在四環(huán)素類抗生素中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀的膠狀沉淀來吸附蛋白質(zhì)；在枯草桿菌發(fā)酵液中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。3.吸附法第二節(jié)固液分離工程及設(shè)備優(yōu)點(diǎn)：分離速度快，分離效率高、液相澄清度好；缺點(diǎn)：設(shè)備投資高、能耗大。離心機(jī)種類：碟片式離心機(jī)、管式離心機(jī)、傾析式離心機(jī)。1.離心分離在液相非均一系統(tǒng)中，利用離心力達(dá)到液－液、液－固、液－液－固分離的方法，統(tǒng)稱為離心分離。碟片式離心機(jī)

是傳統(tǒng)離心機(jī)，為目前工業(yè)上應(yīng)用最廣泛的離心機(jī)。分離因數(shù)可達(dá)1000-20000，最大處理量達(dá)到300m3/h，常用于大規(guī)模的分離過程。適用范圍

細(xì)菌、酵母菌、放線菌、細(xì)胞碎片管式離心機(jī)工作原理圖GF型，用于分離各種乳濁液,特別適用于二相相對密度差甚微的液一液分離以及含有少量雜質(zhì)的液一液一固分離。分離原理：密度大的液相形成外環(huán)，密度輕的液相形成內(nèi)環(huán)，流體到轉(zhuǎn)鼓上部各自的排液口排出，微量固體沉積在轉(zhuǎn)鼓壁上，待停機(jī)后人工卸出。GQ型，用于分離各種難于分離的懸浮液。特別適合于濃度小、粘度大，固相顆粒細(xì)，固液重度差較小的固液分離。分離原理：密度較大的固體微粒逐漸沉積在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)壁形成沉渣層，待停機(jī)后人工卸出，澄清后的液相流動轉(zhuǎn)鼓上部的排液口排出。傾析式分離機(jī)

是一種靠離心力和螺旋的推動力作用自動連續(xù)排渣的離心機(jī)。具操作連續(xù)、適應(yīng)性強(qiáng)、結(jié)構(gòu)緊湊和維修方便的優(yōu)點(diǎn)。分離因數(shù)為1500-3000。適用范圍

特別適合固形物含量較多的懸浮液的分離。因分離因數(shù)較低，不適合細(xì)菌、酵母等微小微生物懸浮液的分離。（P53圖）2過濾

定義：

在一定的壓力差下，利用多孔性介質(zhì)截留固液懸浮液中的固體粒子，進(jìn)行固液分離的方法稱為過濾。

通常發(fā)酵液的黏度大，其中的微生物體積小，造成過濾的困難。在過濾前，一般需對料液進(jìn)行絮凝或凝聚等預(yù)處理，此外可添加助濾劑提高過濾速度。A.根據(jù)過濾機(jī)理，過濾操作可分為澄清過濾和濾餅過濾。澄清過濾：濾餅過濾：過濾介質(zhì)為硅藻土、砂、顆?；钚蕴?、玻璃珠、塑料顆粒等，當(dāng)懸浮液通過濾層時，固體顆粒被阻攔或吸附在濾層的顆粒上，使濾液得以澄清，適合于固體含量少于0.1g/100ml、顆粒直徑在5-100μm的懸浮液的過濾分離，如河水、麥芽汁、酒類和飲料等的澄清。過濾介質(zhì)為濾布，包括天然或合成纖維織布、金屬織布、玻璃纖維紙、合成纖維等無紡布。當(dāng)懸浮液通過濾布時，固體顆粒被濾布阻攔而逐漸形成濾餅（濾渣）。當(dāng)濾餅至一定厚度時即起過濾作用，此時即可獲得澄清的濾液，這種方法叫做濾餅過濾，在濾餅過濾中，懸浮液本身形成的濾餅起著主要的過濾作用，適合于固體含量大于0.1g/100ml的懸浮液的過濾分離。B.常用過濾設(shè)備廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基制備的過濾及霉菌、放線菌、酵母菌和細(xì)菌等多種發(fā)酵液的固液分離。適合于固體含量1-10%的懸浮液的分離。（1）板框過濾機(jī)板框過濾機(jī)板框過濾機(jī)1.結(jié)構(gòu)：若干板，框交替排列，板，框都用支耳架在一對橫梁上，用壓緊裝置壓緊或拉開。2.濾板結(jié)構(gòu)：凹凸紋路作用支撐濾布，提供濾液或洗滌液的流道。分為洗滌板和非洗滌板兩種。3.濾框結(jié)構(gòu)：有供料漿通過的暗孔，料漿在壓差的推動下籍框兩側(cè)覆蓋的濾布進(jìn)行過濾分離。4.過濾操作液體流動路徑：料漿沿1通道輸入，通過濾框的暗孔進(jìn)入濾框，框中的料漿在壓差的推動下籍框兩側(cè)覆蓋的濾布進(jìn)行過濾分離。濾餅在框內(nèi)兩側(cè)生成并增長，濾液通過濾布流到濾板板面的凹槽后因板面凹槽有暗孔與2、4通道相連或與3通道相連，故濾液可由三條通道流到過濾機(jī)外。優(yōu)點(diǎn)：

真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)具有自動化程度高、操作連續(xù)、處理量大。特別適合固體含量大（>10％）的懸浮液的分離，在發(fā)酵工業(yè)中廣泛用于霉菌、放線菌和酵母發(fā)酵液或細(xì)胞懸浮液的過濾分離。缺點(diǎn)：

由于受真空度的限制，不適于菌體較小和粘度較大的細(xì)菌發(fā)酵液的過濾，且過濾所得固相的干度不如加壓過濾。（2）真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)硅藻土的使用方法：作為過濾介質(zhì)預(yù)涂在支持介質(zhì)上加入到懸浮液中按支撐單元分：板框過濾機(jī)，葉片式過濾機(jī)等（3）硅藻土過濾機(jī)1）切向流過濾（Cross-FlowFiltration）又稱錯流過濾

交叉過濾和十字流過濾，是一種維持恒壓下高速過濾的技術(shù)。其操作特點(diǎn)是使懸浮液在過濾介質(zhì)表面作切向流動，利用流動的剪切作用將過濾介質(zhì)表面的固體（濾餅）移走。2）雙水相萃取

向水相中加入溶于水的某些高分子化合物（如葡聚糖、聚乙二醇等）后，形成密度不同的兩相，輕相中富含某種高分子化合物，重相中富含鹽類或另一種高分子化合