呼吸道病毒標本采集運輸保存與實驗室結果判讀

呼吸道病毒標本采集運輸保存與實驗室結果判讀第1頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四相關呼吸道病毒概況第2頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四呼吸道病毒

呼吸道病毒是指一大類能侵犯呼吸道引起呼吸道局部病變，或僅以呼吸道為入侵門戶，主要引起呼吸道外組織器官病變的病毒。拒統(tǒng)計，90%以上的急性上呼吸道感染由病毒引起。第3頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四呼吸道病毒的分類正粘病毒科

流感病毒（A、B、C）副粘病毒科

副流感病毒（I-IV）、呼吸道合胞病毒、

偏肺炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒小RNA病毒科腸道病毒（脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒、埃可病毒）、鼻病毒、心病毒腺病毒科

腺病毒冠狀病毒科

SARS-CoV,229E,OC43,NL63,HKU1細小病毒

博卡病毒（1-4）呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬皰疹病毒科單純皰疹病毒、巨細胞病毒、EB病毒水痘－帶狀皰疹病毒、披膜病毒科風疹病毒多瘤病毒

WU、KI第4頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四呼吸道病毒感染的特點病毒的多樣性和變異性；在引起成人感冒的病毒群中：鼻病毒占30%-35%，冠狀病毒占20%-30%，其他病毒占10%-15%。大部分情況下，病毒入侵部位、入侵后繁殖部位、由此引發(fā)的組織和免疫病理改變以及表現出的臨床癥狀和體征的部位基本在呼吸道，表現的病情較輕；一般無病毒血癥；有些病毒還可引起腸道感染；免疫力不持久；第5頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四正粘病毒的基本特征流行性感冒病毒（簡稱流感病毒）：

是一種造成人類及動物患流行性感冒的RNA病毒，在分類學上，流感病毒屬于正黏液病毒科理化特性：

對熱敏感,56℃30min可滅活；最適pH為7.0～8.0，＜3.0和＞10.0感染力很快被破壞；對紫外線敏感；對乙醚、氯仿、丙酮等有機溶劑均敏感。

第6頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四流行性感冒概述流行性感冒（簡稱流感）：

是由甲（A）、乙（B）、丙（C）三型流感病毒分別引起的急性呼吸道傳染病。臨床表現：

起病急、高熱（38～40℃）、肌痛、頭痛伴有嚴重不適、干咳、咽喉痛或鼻炎，多數患者可在一到兩周內恢復。

潛伏期短（1-

3天）、經呼吸道飛沫傳播，傳播迅速，抗原易變異，人群對變異株普遍易感，控制難度大，流感流行呈一定季節(jié)性。第7頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四流感病毒概述分型與命名◆

根據流感病毒感染的對象，可以將病毒分為人類流感病毒、豬流感病毒、馬流感病毒以及禽流感病毒等類群?！舾鶕《玖：说鞍祝∟P）和膜蛋白（MP)抗原特性及其基因特性的不同，可以將病毒分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三型。◆甲型流感病毒根據其表面結構（H和N）及其基因特性的不同可分為多種亞型。

第8頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四目前已從甲型流感病毒的天然宿主水禽中分離到16種HA與9種NA亞型的甲型流感病毒。第9頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四禽流感病毒H5N1、H9N2、H7N7以及H10N7等均有感染人的報道。血清學的證據表明H4、H6以及H11亞型AIVs也可能感染過人。根據禽流感病毒對雞致病性的不同，AIVs可以分為低致病性禽流感病毒（LPAIV）和高致病性禽流感病毒（HPAIV）。近幾十年，不斷有HPAIV和LPAIV感染人的報道，均是由禽直接傳給了人，并沒有病毒能在人群中有效傳播的證據。H7亞型AIVs也可按照地域不同分為兩個基因譜系：北美譜系和歐亞譜系，且均有感染人的報道第10頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四副粘病毒的基本特征副粘病毒科(Paramyxoviridae)擁有2個病毒亞科6個屬。副粘病毒的基因組為單股負鏈RNA，不分節(jié)段。基因組約15~20kb，編碼的蛋白8~11個或更多。副粘病毒毒粒直徑約150~350nm，含有螺旋狀核殼。病毒顆粒呈多形性，但通常為圓形，均有包膜。即使在同一種病毒，毒粒的大小也不相同。細胞漿內復制。第11頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四第12頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四小RNA病毒的基本特征小RNA病毒(Picornavirus)小RNA病毒有9個屬，其中已知5個含有人類病原。小RNA病毒顆粒每個含有4種蛋白（VP1-VP4），各有60個拷貝，呈二十面體對稱結構，直徑大約30nm，無包膜。小RNA病毒基因組為單股正鏈RNA分子，大小約8kb，能夠在細胞漿內翻譯出病毒復制所需的所有病毒蛋白，因此具有感染性。第13頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四Cox腸道病毒感染特點非脊髓灰質炎腸道病毒（NPEV），主要包括Cox、ECHO和一些新型腸道病毒；感染廣泛，僅在美國每年癥狀性感染達500萬～1000萬。感染主要發(fā)生在夏秋季節(jié)，發(fā)病率和嚴重程度與年齡成反比，幼兒是主要受害者；可引起普通感冒、心肌炎、無菌性腦膜炎、腦炎等多種疾病。絕大部分感染是無癥狀性的，很難與鼻病毒感染區(qū)分。第14頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四在液體中穩(wěn)定；腦脊液、血清、全血、尿可以放在原始采集管中送交實驗室；直腸或咽拭子、鼻洗液等放入VTM；樣本采集腸道病毒第15頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四鼻病毒病毒復制及癥狀特征主要在鼻部，人普通感冒有1/3～1/2由鼻病毒引起；1960年代分離成功，至1987年已經鑒別了>100血清型；根據基因特征可將這些血清型分為A、B兩屬；2007年發(fā)現C屬，目前不能培養(yǎng)溫帶地區(qū)感染高峰為每年9月，春天有第二次感人那高峰，夏天可持續(xù)發(fā)生；無組特異性抗原，型見可有交叉，血清型變化頻繁；病毒經呼吸道分泌物從人傳播到人；潛伏期2～3d,病毒排出高峰期與急性鼻炎一致；4～5d時檢測不到病毒或維持低滴度達2周，癥狀一般維持7d;下呼吸道感染也常發(fā)生。尤其是對于嬰幼兒、老年人、慢性病患者或原有肺病患者，常與RSV感染不易區(qū)分；沒有胞膜，對有機溶劑有抵抗力。感染特點第16頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四癥狀出現后1～6d均可分離到病毒，病毒排泌1～3d明顯；標本應在鼻部采集而不是咽部采集；鼻洗液是鼻病毒分離最好的標本；樣本4℃可保存24～48h。鼻病毒樣本采集第17頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四線型雙鏈DNA，不分節(jié)段，基因組長30000~42000bp，編碼約30種蛋白；病毒無包膜，二十面立體對稱，直徑約70~90nm，具12個頂角和纖維刺突。腺病毒第18頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四潛伏期5~8d；通常為局部感染；約5%的兒童急性呼吸道疾病及約10%的嬰幼兒腹瀉由腺病毒引起；咽炎，急性呼吸系統(tǒng)疾?。?，4，7，21，1，2，5，6），濾泡性結膜炎，流行性角膜結膜炎，咽結膜熱，尿路感染（子宮頸炎、尿道炎、出血性膀胱炎）以及無癥狀持續(xù)感染；腦膜腦炎可為腺病毒呼吸道感染的并發(fā)癥。腺病毒感染特點第19頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四第20頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四第21頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四鼻咽拭子或抽出物、鼻拭子或抽出物、眼分泌物拭子、糞便或直腸拭子、尿、尿道或宮頸拭子以及活檢或尸檢組織都是可根據病人癥狀獲得的合適標本。疾病早期正確收集樣品并立即冷凍送往實驗室可大大提高病毒檢出率。用血清學方法建立或證實診斷需要配對的血樣。第一份樣品在癥狀出現后應立即盡快收集，第二份應在2-4周后收集。樣本采集腺病毒第22頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四冠狀病毒

單股正鏈RNA，27-31KD,5’端甲基化“帽子”，3’端polyA尾。

根據基因序列和血清學，分成三組，感染人類的分屬于I和II組，包括229E、NL63、OC43、HKU1和SARS-CoV。Woo,etal.ExpBiolMed.2009,234:1117–1127第23頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四可引起呼吸道、腸道感染，也可能引起神經癥狀。非SARS-CoV病毒，通過呼吸道飛沫傳播，尚無動物模型，多數感染較輕，為自限性，可加重慢阻肺等疾病。分布廣泛，主要發(fā)生在冬季和早春，美國數據表明，占成人上呼吸道感染的10~24%。病毒分離可用人胚腎細胞或器官培養(yǎng)。冠狀病毒感染特點第24頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四呼吸道病毒標本采集、運輸、保存第25頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四流感樣病例定義是指發(fā)熱（體溫大于等于38℃），伴咳嗽或咽痛之一者。第26頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四不明原因肺炎病例定義同時具備以下4條,不能明確診斷為其它疾病的肺炎病例:(1)發(fā)熱(腋下體溫≥38℃);(2)具有肺炎的影像學特征;(3)發(fā)病早期白細胞總數降低或正常,或淋巴細胞分類計數減少;(4)經規(guī)范抗菌藥物治療3-5天，病情無明顯改善或呈進行性加重。第27頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四呼吸道癥候群病例定義（一）急性感染表現（至少符合下列的一項）：

發(fā)熱（從發(fā)病開始有報告和記錄），WBC升高或降低，或WBC分布異常，寒戰(zhàn)，體溫降低（考慮年齡）（二）呼吸道臨床表現（至少符合下列的一項）：

咽部不適、咽干或咽痛，鼻塞、流涕，鼻/咽/喉明顯充血、水腫，咳嗽（新發(fā)或咳嗽加重），咳痰，氣短，聽診呼吸音異常（濕啰音，干啰音，哮鳴音，濁音），胸痛其中肺炎病例具有上述(一)和(二),并具備----（三）肺炎癥狀：

胸部X線片提示肺部炎性改變注:從肺炎病例采集的標本數比例不少于所承擔發(fā)熱呼吸道癥候群總任務量的20%。第28頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四針對各種標本的病毒與細菌檢測項目的流程圖如下：病例標本采集全血鼻/咽拭子尿液鼻咽抽吸物支氣管肺泡灌洗液細菌培養(yǎng)和鑒定急性期/恢復期血清可疑病毒抗體檢測（備選項）、肺炎支原體和肺炎衣原體抗體檢測（備選項）病毒核酸檢測（陽性者部分繼續(xù)進行病毒分離）、肺炎支原體和肺炎衣原體DNA檢測嗜肺軍團菌、肺炎鏈球菌快速抗原檢測痰液肺炎支原體及肺炎衣原體DNA檢測；細菌培養(yǎng)和鑒定（鼻咽抽吸物和支氣管肺泡灌洗液陰性者進行細菌DNA檢測）；病毒核酸檢測（陽性者部分繼續(xù)進行病毒分離）胸腔穿刺液第29頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四相關法律法規(guī)依據《中華人民共和國傳染病防治法》開展標本的采集和檢測。標本的采集和檢測應嚴格遵守《病原微生物實

驗室生物安全管理條例》(國務院424號令2004

年11月12日起實施)，并嚴格做好個人防護標本的保存與運輸嚴格遵守《可感染人類的高

致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理

規(guī)定》（衛(wèi)生部45號令2006年2月1日起施行）具體依據《人間傳染的病原微生物名錄》（衛(wèi)科教發(fā)[2006]15號2006年1月11日發(fā)布）第30頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四病原微生物標本的采集條件具有與采集病原微生物樣本所需要的生物安全防護水平相適應的設備，包括個人防護用品（隔離衣、帽、口罩、鞋套、手套、防護眼鏡等）、防護材料、器材和防護設施等具有掌握相關專業(yè)知識和操作技能的工作人員具有有效的防止病原微生物擴散和感染的措施具有保證病原微生物樣本質量的技術方法和手段

采集過程中應對標本的來源、采集過程和方法等作詳細記錄。第31頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四病原微生物標本采集原則早、快、近（病變部位）、多、凈應根據病例的臨床表現采集不同時期、不同種類的標本死亡病例最好采集尸檢標本，并盡可能地收集醫(yī)院已檢的臨床標本沒有條件進行尸體解剖的，可根據檢測目的采集呼吸道灌洗液、肛拭子或經皮穿刺采集胸水、腹水、肺組織標本等第32頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四病原微生物標本的種類呼吸道樣品：上呼吸道樣品：咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子、鼻洗液、咽漱液、深咳痰液、鼻咽抽取物。最佳采集時間為發(fā)病后3天內，一般不超過7天。下呼吸道樣品：呼吸道抽取物、呼吸道灌洗液、胸水、肺組織標本。下呼吸道標本最有利于病毒分離。消化道樣品：糞便、肛拭子、胃內容物。其他樣品：血液、腦脊液、尿液、皰疹液、瘀斑或出血點、皮膚潰瘍分泌液、體液標本、膿或傷口標本、尸檢標本。第33頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四標本采集的器材和容器標本采集的器材和容器應是無菌的，在有效期內使用。標本容器最好使用可耐深低溫的塑料制品。如外螺旋蓋帶密封墊圈的無菌螺口塑料管或瓶。采集好的標本應規(guī)范標識獨立包裝在帶密封條的塑料袋中。第34頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四標本容器第35頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四采咽拭子的器材和容器第36頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四采鼻拭子的器材和容器第37頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四采集血標本的器材和容器第38頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四BDSST血清分離膠管

BDSST管內壁均勻噴涂促凝劑加速血液凝固，縮短周轉時間（TAT）。惰性分離膠用于離心后分隔血細胞和血清，可提高血清產量，較長時間保持血清成分的穩(wěn)定，利于樣本的復檢。分離膠穩(wěn)定性強，不易吸附血清中的蛋白質，對藥物檢測及普通的生化檢測可得出真實的結果。

BDPST血漿分離膠管

BDPST管內含有惰性分離膠，可分隔血細胞和血漿，提高血漿產量，保持血漿成分的穩(wěn)定。用于采集血漿樣本，消除凝血時間，縮短周轉時間(TAT)。通常用于重癥監(jiān)護和急診檢測。

BD血清管

BD血清管用于采集靜脈血后分離出血清，應用于臨床化學、血清學、免疫學、治療藥物監(jiān)測、微量元素測定。促凝劑的作用是加速血液凝固。采用促凝管可以縮短周轉時間。

BD血漿管

BD血漿管用于采集靜脈血后分離出血漿，應用于臨床生化等檢驗。血漿管內壁均勻噴涂肝素鋰或肝素鈉用于血液抗凝，適于大多數臨床生化檢測，可以作為那些不用分離膠管而又需要血漿標本的實驗室的主要采血管。

BD血糖管

BD血糖管用于血糖測定或糖耐量檢測，管壁均勻噴涂抗凝劑（草酸鉀）及糖原穩(wěn)定劑（氟化鈉），糖原穩(wěn)定劑可以使血糖濃度在室溫條件下保持24小時穩(wěn)定。

BDEDTA血常規(guī)管

血常規(guī)管含有EDTA的二鉀鹽或三鉀鹽，其中二鉀鹽呈霧狀均勻噴涂于管壁。該管主要用于血細胞學檢測如血象，血紅蛋白，糖化血紅蛋白，環(huán)胞素，紅細胞葉酸及輸血前檢測（血型、抗體篩查、交叉配型）。

BD血凝管

BD血凝管主要用于凝血四項檢測（凝血酶原時間、凝血酶時間、活化部分凝血活酶時間、纖維蛋白原），指導臨床如口服華法林治療的監(jiān)控、靜脈輸注肝素治療的監(jiān)控以及“特殊凝血研究”（凝血因子檢測、如第VIII因子或血友病因子、血小板功能檢測）。

BDVacutainer?血沉管（ESR管）

血沉管用于紅細胞沉降率的測定，含有3.2%枸櫞酸鈉溶液抗凝，抗凝劑與血液的比例為1:4。玻璃管可配合血沉架或全自動血沉儀聯(lián)合使用，該方法為封閉系統(tǒng)，無需打開管帽，采血后直接操作。-BDPAXgeneTM全血RNA管能穩(wěn)定血細胞內的RNA水平，延長血液標本體外放置的時間，利于批量采集，細胞轉錄水平保真性好可用于與血細胞RNA相關的RT-PCR檢測，人類疾病基因轉錄譜的研究及其他RNA轉錄相關的檢測第39頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四標本采集方法

咽拭子：用2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時檫拭雙側咽扁桃體及咽后壁，將拭子頭浸入含3ml采樣液的管中，棄去尾部，旋緊管蓋。第40頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四標本采集方法

鼻拭子：將1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子輕輕插入鼻道內鼻腭處，停留片刻后緩慢轉動退出；取另1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子以同樣的方法采集另一側鼻孔；將上述2根拭子浸入同一含3ml采樣液的管中，棄去尾部，旋緊管蓋。第41頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四標本采集方法鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。先將收集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負壓，旋轉收集器頭部并緩慢退出；收集抽取的粘液，并用采樣液3ml涮洗收集器1次（可用小孩導尿管接在50ml注射器上來代替收集）第42頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四吸取過程正確錯誤錯誤不要觸摸病人的臉!第43頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四標本采集方法咽漱液：用10ml不含抗菌素的采樣液漱口（漱時讓患者頭部微后仰，發(fā)“噢”聲，讓洗液在咽部轉動），然后將咽漱液收集于50ml無菌的螺口塑料管中。無條件的可用平皿或燒杯收集咽漱液并轉入10ml螺口采樣管中。第44頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四標本采集方法深咳痰液：肺部感染應采取痰標本，以清晨第一口痰為最佳。采集前要求患者用清水漱口數次，以除去口腔內的大量雜菌，患者深咳后，將咳出的痰液收集于含3ml采樣液的50ml無菌螺口采樣管中。呼吸道灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm深處），注入5ml生理鹽水，接通負壓，旋轉收集器頭部并緩慢退出；收集抽取的粘液，并用采樣液涮洗收集器1次（可用小孩導尿管接在50ml注射器上來代替收集）。第45頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四標本采集方法胸水：在B超定位下進行胸腔穿刺，抽取胸水5ml，置于無菌的塑料螺口管中。肺組織活檢標本：在超聲或X線定位下，經皮穿刺取肺組織活檢標本，置于含3ml采樣液的塑料螺口管中。尸檢標本：在嚴格按照生物安全防護的條件下，進行尸檢，根據檢測目的可采集肺、肝、腎、脾、心臟、腦、淋巴結等組織標本。病人死亡后應依法盡早進行解剖，無菌采集，每一采集部位分別使用不同消毒器械，以防交叉污染；每組織應多部位取材，各組織應取20～50g，淋巴取2個。第46頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四標本采集方法糞便標本：對黏液膿血便應挑取黏液或膿血部分，液狀糞便采集水樣便或含絮狀物的液狀糞便2～5ml；成形糞便至少取5g糞便置于無菌螺口管中，最好加有保存液或增菌液。肛拭子：若無法獲得糞便時，可用保存液或增菌液濕潤過的棉拭子插入肛門4～5cm深處（小兒2～3cm）輕輕轉動一圈，取直腸表面的黏液后取出，用于病毒檢測的肛拭子立即放入含3ml病毒保存液的帶外螺旋蓋的試管中，用于細菌檢測的肛拭子需將樣品接種到增菌液中，或將標本插入Cary-Blair運送半固體培養(yǎng)基中，但不得冷凍。

第47頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四標本采集方法血清標本：用真空負壓采血管采集血液標本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，收集血清于2ml無菌螺口塑料管中。每一例病人須采集急性期、恢復期雙份血清。第一份血清應盡早（最好在發(fā)病后7天內）采集，第二份血清應在發(fā)病后第3～4周采集。以空腹血為佳。病例診斷需雙份血清。全血：用一次性真空抗凝采血管采集病人5ml靜脈血，立即緩慢地顛倒采血管3-5次，4℃條件下立即送至有關實驗室。第48頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四不同疾病標本的采集

流行性感冒：采發(fā)病3天內流感樣病例（T≥38℃、伴有咽痛或咳嗽癥狀之一者,缺乏其它實驗室確定診斷依據）的咽拭子或鼻咽拭子放入3-5ml采樣液中或采集病人的含漱液10ml，冷藏運送至實驗室。最好沒有服用過抗病毒藥物。

麻疹：作病毒分離的樣品，要在前驅期或出疹初期（T≥38℃、3天內）采病人的咽拭子放入3-5ml采樣液中冷藏送至實驗室；作血清學診斷的樣品，則在出疹后４-１５天采集靜脈血，必要時間隔1周再采1次。第49頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四不同疾病標本的采集SARS/人禽流感/MERS：應在發(fā)病不同時期分別采集住院病人的不同標本，早期可采集病人的咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液、深咳痰液等上呼吸道標本；病人上呼吸機后，可采集呼吸道抽取物、支氣管灌洗液等下呼吸道標本；如果病例有腹瀉癥狀，可采集糞便標本；有胸水者可采集胸水標本；須采集急性期、恢復期雙份血清；必要時還可采集全血。第50頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四51標本的采集（一）注意事項確認符合病例定義后盡早采集（盡量在采取治療措施前）采集時嚴格無菌操作，減少或避免機體正常菌群及其它雜菌污染采集后應盡快送檢。床旁接種可提高病原菌檢出率。送檢標本應貼條形碼，并附送檢單，送檢單上應注明姓名、(編號)、標本來源、檢驗目的和標本采集具體時間。填寫病例信息調查表。嚴格按生物安全規(guī)范操作。第51頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四52（二）各種標本的采集要求病毒檢測：（檢測一類標本即可）鼻/咽拭子（必采項）痰液（盡量采集）鼻咽抽吸物（盡量采集）胸腔穿刺液（盡量采集）支氣管肺泡灌洗液（盡量采集）血液（盡量采集）細菌檢測：血液（必采項）痰液（必采項）胸腔穿刺液（盡量采集）支氣管肺泡灌洗液（盡量采集）尿液：軍團菌、肺炎鏈球菌快速抗原檢測（必采項）第52頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四聯(lián)合國對感染性物質的運輸分類根據其所運輸病原體的傳染性和感染后對個體或群體的危害程度不同，分為A類和B類。A類指人感染后發(fā)病的可能性大，傳染性強，對人群危害性大的烈性感染性物質。高度懷疑具有嚴重危害性的感染性物質也屬于A類。A類之外，僅具有一般危險性，引起感染的機會較少的感染性物質感染性物質為B類第53頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四感染性物質運輸的包裝系統(tǒng)感染性及潛在感染性物質的運輸應使用三層包裝系統(tǒng)：內層容器、中層包裝、外層包裝將樣品采用防水、防漏的內層容器包裝并貼上指示內容物的標簽后裝入中層容器內層容器和中層容器間應放置足量的吸水性材料，以便內層容器打破或泄漏時能吸收溢出的所有液體。然后將中層容器固定在硬質外層容器中以免中層容器在運輸過程中受到物理性損壞。第54頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四標本的包裝A類包裝，符合UN2814要求容器或包裝材料應達到國際民航組織《危險物品航空安全運輸技術細則》（Doc9284包裝說明PI602）規(guī)定的A類包裝標準第55頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四標本的包裝三層包裝第一層為離心管第二層為防水、防漏的安全殼容器第三層為運輸包裝包裝要求樣本應用吸水紙等包裹，固定在自封袋或離心管內在堅固、防水、防漏的第二層安全殼容器中，用吸水紙等填充物將內有標本的自封袋或離心管固定好，裝入第三層包裝第二層和第三次包裝之間應放置冰排等制冷材料安全殼容器和外包裝須與IATA危險物品條例包裝制度650相符合第56頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四57標本的運送血液標本、鼻/咽拭子、痰液、鼻咽抽吸物、支氣管肺泡灌洗液、胸腔穿刺液、尿液標本采集后應該盡快送檢。血培養(yǎng)瓶須在24小時內送檢，送檢前置于常溫環(huán)境（15-30℃）保存。其他標本送檢前應保存在4-8℃，如24小時內無法檢測的標本則應置于-70℃或以下保存，但應避免反復凍融。標本運送過程中，血培養(yǎng)瓶應置于15-30℃環(huán)境中,其他標本應置4-8℃運送。第57頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四收取標本由醫(yī)院所在地的疾病預防控制機構到醫(yī)院收取標本。標本運輸之前，應按相關生物安全規(guī)定，與樣本接收單位生物安全管理部門聯(lián)系，辦理相關手續(xù)運送日期確定后，立即將運送時間和運輸方式通知接收單位，做好接收準備第58頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四59標本的保存（一）檢測標本的存放血清、呼吸道標本、尿液標本、胸腔穿刺液標本抵達檢測實驗室后，原則上應盡早進行病毒和細菌檢測；進行病毒檢測的標本，24小時內能進行檢測的可置于4℃保存，24小時內不能進行檢測的則應置于-70℃或以下保存；用于細菌培養(yǎng)的標本，應立即分離，不應存放后分離。標本應避免反復凍融。（二）標本的長期保存所采標本抵達實驗室后，血清、呼吸道標本、尿液標本、胸腔穿刺液標本按需要分裝成所需份數，置-70℃冰箱或以下保存。第59頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四60（二）標本的處理

（一）呼吸道標本用于病毒檢測前需進行分裝分裝鼻/咽拭子標本時，注意充分擠壓拭子頭，保證細胞充分脫落分裝管中用于核酸檢測的標本，如粘液成分較重，可進行液化等處理（二）血清標本從血標本中分離血清，分裝后按方案要求儲存第60頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四呼吸道病原譜（1）流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、偏肺病毒、冠狀病毒、博卡病毒和鼻病毒8種病毒以及肺炎支原體和肺炎衣原體的核酸檢測。進行細菌培養(yǎng)和鑒定，培養(yǎng)的重點是肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、A組乙型鏈球菌、流感嗜血桿菌。第61頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四呼吸道病原譜（2）對所有細菌分離培養(yǎng)陰性的胸腔穿刺液和支氣管肺泡灌洗液，進行針對所檢測細菌和肺炎支原體、肺炎衣原體的核酸檢測。對全部尿標本進行肺炎鏈球菌和嗜肺軍團菌的快速抗原檢測。凡從無菌部位（全血、支氣管肺泡灌洗液、胸腔穿刺液）采集標本證實一種病原體感染，即可視為檢測終點，不要求繼續(xù)進行其它病原體檢測。第62頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四63（三）檢測程序檢測病毒：人流感病毒、呼吸道合胞病毒、人腺病毒、人副流感病毒、人偏肺病毒、人冠狀病毒、人博卡病毒、人鼻病毒檢測方法：核酸PCR檢測/Real-timePCR（逐步完善）

分離培養(yǎng)和免疫熒光/PCR鑒定血清學檢測：各實驗室視情況和條件選擇實施。第63頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四64呼吸道病毒的核酸檢測1.核酸的提?。鹤詣踊怂崽崛∩唐坊暮怂崛斯ぬ崛≡噭┖泄J的傳統(tǒng)方法：如《分子克隆》。2.核酸的檢測：RT-PCR，PCRReal-timePCR3.結果的確證和記錄：膠回收克隆和測序第64頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四65病毒的分離培養(yǎng)（1）1.進行病毒分離的標本選擇原則：我國目前尚缺乏或存量較少，且具有較大的研究意義的病毒，包括人偏肺病毒，人冠狀病毒。在常規(guī)監(jiān)測研究時，某種病毒核酸檢測陽性比例的異常增高時或非常規(guī)的聚集性病例時，從中選擇適當數量病例分離5-10株病毒。鼓勵建立人博卡病毒的細胞培養(yǎng)分離體系。第65頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四2.分離得到的病毒，應采用核酸檢測、免疫熒光等方法鑒定病毒種類。3.細胞株：應有明確的生物學背景，來源清楚，并已排除病原體的污染。66病毒的分離培養(yǎng)（2）第66頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四實驗室生物安全要求實驗室檢測相關活動嚴格按照《人間傳染的病原微生物名錄》的要求，在相應的生物安全級別實驗室開展病毒培養(yǎng)在BSL-x實驗室動物感染實驗在ABSL-x實驗室未經培養(yǎng)的感染材料的操作在BSL-x實驗室滅活材料的操作在BSL-x實驗室按照《病原微生物實驗室生物安全管理條例》等相關規(guī)定要求，做好生物安全工作第67頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四標本上送要求根據要求，應將陽性和部分陰性標本送省疾控中心、中國控中心進行復核檢測實驗室檢測結果應及時反饋標本送檢單位，并盡快上報上級主管部門第68頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四A類標本運輸的生物安全要求由專人專車運送，運送人員須有相關資質，且不得少于兩人申請單位對與運送人員進行相關的生物安全培訓在運送過程中采取相應的防護措施運輸前仔細檢查容器，要符合安全要求按照規(guī)定進行標本運輸前的包裝和送達后的開啟第69頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四呼吸道病毒檢測實驗室結果判讀第70頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四核酸檢測技術的原理PCR的基本工作原理就是以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板互補的DNA片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復制的機理沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。特異性：引物序列靈敏度：擴增100萬倍1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1～3步25～35輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍第71頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四RT-PCR和real-timePCRRT-PCR：即逆轉錄PCR，擴增的模板為RNA，增加RNA→DNA過程。Real-timePCR：即實時熒光定量PCR，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程。第72頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四RT-PCR/Real-timeRT-PCR的基本步驟需要主要設備：高速冷凍離心機，PCR儀或熒光定量PCR儀，電泳儀，水平電泳槽，凝膠電泳成像系統(tǒng)，可調加樣槍（10ul，200ul，1000ul）。裂解細胞或病毒釋放核酸純化核酸反應管中加入提取的核酸PCR試劑盒混合反應體系反應管放入PCR儀，自動完成擴增程序反應管中的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳電泳拍照結果分析裂解細胞或病毒釋放核酸純化核酸反應管中加入提取的核酸PCR試劑盒混合反應體系反應管放入熒光定量PCR儀，自動完成擴增程序第73頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四PCR檢測結果判讀第74頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四熒光PCR結果判讀第75頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四結果解釋－陰性樣品第76頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四結果解釋－試驗失敗第77頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四結果解釋－可疑樣品第78頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四結果解釋－可疑樣品第79頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四陽性樣品擴增曲線第80頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四病毒分離結果-采用的細胞系MDCK細胞：流感病毒LLCMK2細胞：副流感病毒，偏肺病毒，冠狀病毒CoV-OC43Hep-2細胞：腺病毒，RSVHela細胞：腺病毒，RSV，冠狀病毒CoV-229E，副流感病毒HEL細胞：冠狀病毒CoV-229EBSC-1細胞：冠狀病毒CoV-OC43第81頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四MDCKLLCMK2Hep-2第82頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四第83頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四檢測流程標本敏感細胞系收獲培養(yǎng)2-7天PCR、免疫熒光等方法篩選/檢測分型第84頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四InfluenzaAInfluenzaBScreeningScreening第85頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四RSVNegative第86頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四尼基氏小體（Negri

body）神經細胞熒光染色照片第87頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四血凝和血凝抑制實驗結果判斷雞或火雞紅細胞陽性(淚滴)陰性豚鼠或人O型血紅細胞陽性（環(huán)狀）陰性陽性陰性陽性陰性第88頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四中東呼吸綜合征冠狀病毒實驗室檢測第89頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四參考標準中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）實驗室檢測技術指南WHO:Laboratory

TestingforMiddleEastRespiratorySyndrome

Coronavirus：interim

recommendations(revised)

.(September

2014

）USCDC：InterimGuidelinesforCollecting,Handling,andTestingClinicalSpecimensfromPatientsUnderInvestigation(PUIs)forMiddleEastRespiratorySyndromeCoronavirus(MERS-CoV)-Version2第90頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四MERS-CoV感染標本采集對象中東呼吸綜合征冠狀病毒感染疑似病例、臨床診斷病例及需要進一步研究的確診病例；其它需要進行MERS-CoV感染診斷或鑒別診斷者。第91頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四標本采集要求從事MERS-CoV檢測標本采集的技術人員應經過生物安全培訓，培訓合格且具備相應的實驗技能。在標本采集過程中，采樣人員進行安全防護。住院病例的標本由所在醫(yī)院醫(yī)護人員在當地疾控機構專業(yè)人員指導下采集。密切接觸者標本由當地疾控機構負責采集。根據實驗室檢測工作的需要，結合病程再次采樣。第92頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四采集標本種類和要求呼吸道（上、下呼吸道）和其他樣品（血清、尿液和糞便）、尸檢標本。每個病例應盡可能同時采集上、下呼吸道標本，下呼吸道標本最佳，建議同時采集糞便和尿液標本。應盡可能采取發(fā)病初期和恢復期雙份血清標本以確定是否感染，雙份血清樣品間隔14~21天采集比較理想，第一份血清應在發(fā)病第一周內采集。但單份樣品的檢測對于確定疑似病例也有價值，如果只能采集一份樣品，應該在出現癥狀后至少14天采集。第93頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四標本的保存樣品采集后應盡快送至實驗室，運輸過程需合理。若呼吸道樣品72小時以上才能到達實驗室，強烈推薦將樣品儲存在-80℃并使用干冰進行運輸，應避免樣品反復凍融。從全血分離的血清應4℃儲存并運輸，或用干冰、液氮冷凍并運輸。由于無霜冰柜溫度波動較大，應避免使用無霜冰柜儲存呼吸道和血清樣品。第94頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四院內轉運時，標本應該放置在耐用、防滲透的二級容器中進行轉運。為減少任何標本破、漏的風險，不要使用任何氣動傳輸系統(tǒng)來轉運任何可能疑似患者標本。轉運至CDC的MERS-CoV標本應該充分包裹，轉運時不能開蓋或分裝標本。標本轉運應該符合三重包裝系統(tǒng)要求：內層是主要的容器（一個可密封的標本袋纏繞以可吸收材料），第二層是防水、防滲漏的容器，外層是用于轉運的包裝。MERS-CoV感染標本包裝和運輸第95頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四

MERS-CoV感染實驗室檢測方法核酸檢測：為目前早期診斷、早期發(fā)現MERS-CoV感染病例的主要檢測方法，采用Real-timePCR進行病毒核酸檢測和診斷，患者呼吸道樣本中擴增到特異性核酸，可確診MERS-CoV感染。傳統(tǒng)RT-PCR因易出現污染使用受限，但可以獲得病毒基因序列?？乖贵w檢測:IgM捕獲法ELISA檢測血清特異性IgM抗體間接法ELISA或免疫熒光方法檢測IgG抗體利用假病毒進行中和抗體檢測第96頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四第97頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四MERS-CoV的實驗室檢測靶標目前病毒核酸的檢測方法主要有：檢測E蛋白上游基因（upE）、ORF1b、ORF1a、N2基因四種。這些方法均高度敏感，推薦upE檢測用于初篩;檢測ORF1b基因的方法不如針對ORF1a的方法敏感，但比其更加特異;N2基因檢測具有較高的靈敏性。另外，已確定了中東呼吸綜合征冠狀病毒基因組中位于RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）和衣殼蛋白（N）基因的幾個適合測序驗證的靶序列。第98頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四巢式PCR普通PCRPCR產物電泳或測序逆轉錄，獲得cDNA核酸提取標本采集PCR檢測熒光定量PCR實驗方案第99頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四待檢樣品upE特異性RT-PCR檢測陽性陰性ORF1aRT-PCR檢測陽性陰性確診RdRp測序或N測序陰性抗原檢測抗體檢測病毒分離陽性實驗流程第100頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四繼續(xù)采樣，如有必要應送樣至有MERS-CoV檢測經驗的參比實驗室進行檢測入選病例rRT-PCRupE基因進行篩查實驗陽性陰性rRT-PCRORF1a、ORF1b或N基因區(qū)進行確證實驗陰性，但如果臨床和流行病學證據充分，繼續(xù)采樣重復檢測陰性陽性RdRp或N區(qū)測序實驗陰性顯示為其他序列顯示MERS-CoV確診病例確診病例第101頁，共109頁，2023年，2月20日，星期四upEupE-Fwd5'-GCAACGCGCGATTCAGTT-3'upE-Rev5'-GCCTCTACACGGGACCCATA-3'upE-Prb5'FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-TAMRA3'ORF1bORF1b-Fwd5'-TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT-3'ORF1b-Rev

5'-TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG-3'O