臨床基因組學(xué)檢驗(yàn)課件第七章 Sanger測(cè)序及高通量測(cè)序技術(shù)1

臨床基因組學(xué)

第七章

Sanger測(cè)序及高通量測(cè)序技術(shù)臨床基因組學(xué)教研室

賀樹香主要內(nèi)容第一節(jié)核酸測(cè)序技術(shù)的發(fā)展第二節(jié)Sanger測(cè)序技術(shù)第三節(jié)高通量測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用

第三節(jié)高通量測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用重點(diǎn)高通量測(cè)序的發(fā)展二代測(cè)序的基本原理及操作流程三代測(cè)序的基本原理高通量測(cè)序的臨床應(yīng)用高通量測(cè)序的發(fā)展人類基因組約含4萬(wàn)到10萬(wàn)個(gè)基因，由約30億個(gè)堿基對(duì)組成，分布在細(xì)胞核的23對(duì)染色體中。1990年，被譽(yù)為生命“登月計(jì)劃”的國(guó)際人類基因組計(jì)劃啟動(dòng)。1999年9月，中國(guó)加入這一研究計(jì)劃，負(fù)責(zé)測(cè)定人類基因組全部序列的1％。2003年完成，比預(yù)計(jì)提前2年。六國(guó)（美、日、英、法、德、中）科學(xué)家歷經(jīng)了13年花費(fèi)了27億美元才完成的草圖。盡管第一代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測(cè)序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的測(cè)序方法。優(yōu)勢(shì)：能同時(shí)對(duì)無(wú)數(shù)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，效率極高技術(shù)特點(diǎn)：每次測(cè)很短的片段（讀長(zhǎng)較短），但是可以通過(guò)超大量的平行測(cè)序，獲得大量的序列。“下一代”測(cè)序技術(shù)Next-generationsequencing,NGS高通量測(cè)序的常用名詞高通量測(cè)序技術(shù)（High-throughputsequencing，HTS）是對(duì)傳統(tǒng)Sanger測(cè)序（稱為一代測(cè)序技術(shù)）革命性的改變,一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條核酸分子進(jìn)行序列測(cè)定,因此在有些文獻(xiàn)中稱其為下一代測(cè)序技術(shù)(nextgenerationsequencing，NGS)足見其劃時(shí)代的改變,同時(shí)高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能,所以又被稱為深度測(cè)序(Deepsequencing)基因組重測(cè)序（GenomeRe-sequencing）是對(duì)基因組序列已知的個(gè)體進(jìn)行基因組測(cè)序，并在個(gè)體或群體水平上進(jìn)行差異性分析的方法。denovo測(cè)序也稱為從頭測(cè)序：其不需要任何現(xiàn)有的序列資料就可以對(duì)某個(gè)物種進(jìn)行測(cè)序，利用生物信息學(xué)分析手段對(duì)序列進(jìn)行拼接，組裝，從而獲得該物種的基因組圖譜。外顯子測(cè)序（wholeexonsequencing）指利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的基因組分析方法。Reads

又稱讀長(zhǎng)，高通量測(cè)序中一個(gè)反應(yīng)獲得的測(cè)序序列或測(cè)序出來(lái)的一條條序列。測(cè)序深度

是指測(cè)序得到的總堿基數(shù)與待測(cè)基因組大小的比值。假設(shè)一個(gè)基因大小為2M，測(cè)序深度為10X，那么獲得的總數(shù)據(jù)量為20M。覆蓋度是指測(cè)序獲得的序列占整個(gè)基因組的比例。Contig

拼接軟件基于reads之間的overlap區(qū)，拼接獲得的序列稱為Contig（重疊群）。Scaffold

基因組denovo測(cè)序，通過(guò)reads拼接獲得Contigs后，往往還需要構(gòu)建454Paired-end庫(kù)或IlluminaMate-pair庫(kù)，以獲得一定大小片段（如3Kb、6Kb、10Kb、20Kb）兩端的序列?；谶@些序列，可以確定一些Contig之間的順序關(guān)系，這些先后順序已知的Contigs組成Scaffold。

高通量測(cè)序平臺(tái)LifeIonPGM;IonprotonIlluminaMiSeqNextSeq500Roche454GenomeSequencerFLXRoche454GenomeSequencerGSFLXGSJuniorSystemGSFLX的基本原理文庫(kù)構(gòu)建擴(kuò)增測(cè)序模板焦磷酸測(cè)序數(shù)據(jù)分析樣本文庫(kù)構(gòu)建擴(kuò)增測(cè)序模板焦磷酸測(cè)序數(shù)據(jù)分析樣本(DNA)n+dNTPpolymerase(DNA)n+1+PPiSulfurylaseATPAPS+PPiATP+luciferinoxyluciferin

LucifetasedNTPApyrasedNDP+dNMP+phosphateATPApyraseADP+AMP+phosphate文庫(kù)構(gòu)建擴(kuò)增測(cè)序模板焦磷酸測(cè)序數(shù)據(jù)分析樣本序列是什么呢？CGTAAGGTGATGTATAGGGG....LifeTechnologyIon平臺(tái)

IonPGM?系統(tǒng)IonProton?系統(tǒng)IonS5?系統(tǒng)IonChef?系統(tǒng)IontorrentPGM的基本原理PrepareLibraryClonalAmplificationDNA/RNADataAnalysisLibraryPreparationDNASequencing*IsolatePositiveIonSphere?Particles10DataAnalysisLoadChipandSequence10TemplatePreparation*SensorPlateSiliconSubstrateDrainSourceBulkdNTPTocolumnreceiver?pH?Q?VSensingLayerH+Sequencing:FlowsIonSphere-----Primer------AGTCAAGCGTCCCATGSequenceofInterestKeySequenceTACGTACGTFlows1-4…9-12Flows5-8…etc.TACGFlows1-4...---IonSphere?ParticleA“flow”istheeventofexposingthechiptooneparticulardNTP(T,A,C,orG),followedbyawashingstepThefloworderrepeatswithpattern:‘TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC’CGACGTACGTAA“cycle”isfourconsecutivedNTPflows:forinstance,T-A-C-G=1cycleTA“flow”istheeventofexposingthechiptooneparticulardNTP(T,A,C,orG),followedbyawashingstepThefloworderrepeatswithpattern:‘TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC’Sequencing:FlowsIonSphere-----Primer------AGTCAAGCGTCCCATGSequenceofInterestKeySequenceCTACGTACGTFlows1-4…9-12Flows5-8…etc.TACGFlows5-8...---IonSphere?ParticleCGACGTACGTAA“cycle”isfourconsecutivedNTPflows:forinstance,T-A-C-G=1cycleTIonSphere-----Primer------AGTCAAGCGTCCCATGSequenceofInterestKeySequenceCTACGTACGTCGACGTACGFlows1-4…9-12Flows5-8…etc.TCGTFlows9+AG...---IonSphere?ParticleA“flow”istheeventofexposingthechiptooneparticulardNTP(T,A,C,orG),followedbyawashingstepThefloworderrepeatswithpattern:‘TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC’TTAA“cycle”isfourconsecutivedNTPflows:forinstance,T-A-C-G=1cycleSequencing:FlowsTIonSphere-----Primer------AGTCAAGCGTCCCATGSequenceofInterestKeySequenceACGTACGTACGTFlows1-4…9-12Flows5-8…etc.TACGTTTCGCAGGGTACAndsoon…...---IonSphere?ParticleA“flow”istheeventofexposingthechiptooneparticulardNTP(T,A,C,orG),followedbyawashingstepThefloworderrepeatswithpattern:‘TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC’CGACGTACGTAA“cycle”isfourconsecutivedNTPflows:forinstance,T-A-C-G=1cycleSequencing:Flows大家知道接下來(lái)的序列是什么嗎?AATCTTCTGAATTTCTGCAACTGTG例一：

阿爾茨海默?。ˋlzheimerdisease,AD）是老年癡呆中最常見的一種漸進(jìn)性的神經(jīng)功能退化整體認(rèn)知能力的下降早發(fā)性AD主要是由β-淀粉樣前體蛋白(APP)基因和早老素基因突變引起，與晚發(fā)性AD發(fā)病明顯相關(guān)的只有載脂蛋白E-ε4(APOE-ε4)等位基因?qū)εcAD關(guān)聯(lián)的4個(gè)基因(APOE+APP+PSEN1+PSEN2)進(jìn)行全基因測(cè)序，有助于發(fā)現(xiàn)更多的AD患者的遺傳變異。阿爾茨海默病(Alzheimerdisease,AD)通過(guò)Ion-Torrent-PGM技術(shù)，對(duì)PSEN1、PSEN2、APP、APOE基因的外顯子區(qū)（編碼區(qū)）序列進(jìn)行直接測(cè)序，與參考序列進(jìn)行比較，從而發(fā)現(xiàn)可能存在的基因突變?；蚨ㄎ蛔饔肁POE19q13-13.2與老年性癡呆相關(guān)APP21q11.2-21q21與老年性癡呆相關(guān)PSEN1基因（早老素-1基因）14q24.3其中PSEN1基因可能是EOFAD的主要責(zé)任基因，并且也有報(bào)道PSEN1基因的某些突變和多態(tài)性也與散發(fā)性AD有關(guān)。PSEN2基因（早老素-2基因）1q31-42與老年性癡呆相關(guān)早發(fā)性AD的家系舉例:

AD相關(guān)基因

NGS測(cè)序PSEN1基因突變?cè)绨l(fā)型AD常顯遺傳Illumina平臺(tái)

IlluminaMiseq的基本原理測(cè)序的時(shí)候，測(cè)序引物匹配于模板，反應(yīng)體系里加入4種不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的Fl-NTPs，整合到新合成鏈的Fl-NTPs會(huì)發(fā)出相應(yīng)的熒光，并被相機(jī)拍下，終止反應(yīng)，將熒光基團(tuán)切除即可進(jìn)入下一輪合成過(guò)程。如此往復(fù)直到測(cè)完設(shè)定的循環(huán)數(shù)。MiSeqControlSoftware圖片處理Basecalling質(zhì)量評(píng)分MiSeqReporter數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)化比對(duì)序列到參考序列得到變異信息質(zhì)量>Q30的數(shù)據(jù)達(dá)到95%以上測(cè)序照片二、數(shù)據(jù)分析NextSeq500特色——TwoChannelSBSGGT,ATT,CAA,GCATCA,ATG,CGT,GGC（A/T;A/C）

帕金森病（Parkinson’sdisease，PD）是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，老年人多見，平均發(fā)病年齡為60歲左右，40歲以下起病的青年帕金森病較少見。最主要的病理改變:中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡，由此而引起紋狀體DA含量顯著性減少而致病。癥狀體征不對(duì)稱、靜止性震顫、對(duì)左旋多巴制劑治療敏感多提示原發(fā)性帕金森病。各測(cè)序技術(shù)的比較數(shù)據(jù)來(lái)源：LiuJT,etal.JBiomedBiotechnol.2012;2012:871272.第三代測(cè)序基于單個(gè)分子信號(hào)檢測(cè)的DNA測(cè)序被稱為單分子測(cè)序

(singlemoleculesequencing,SMS)，或第三代測(cè)序(thirdgenerationsequencing,TGS)。主要包括Helicos的tSMS，PacBio的SMRT，Oxford的Nanopore

。tSMS（turesinglemoleculesequencing

）該技術(shù)的關(guān)鍵是采用高分辨率的相機(jī)直接讀取單分子熒光信號(hào)，不需要依賴PCR擴(kuò)增以放大信號(hào)。首先將待測(cè)核酸樣本隨機(jī)打斷成小片段，在每個(gè)小片段的末端加上poly-dA；再將小片段DNA模板與固定在檢測(cè)芯片上的poly-dT引物進(jìn)行雜交并精確定位，并逐一加入經(jīng)過(guò)熒光物質(zhì)修飾的dNTP。tSMS技術(shù)使用的dNTP也是僅能摻入新合成鏈而不能直接作為下一個(gè)dNTP分子摻入新鏈的3ˊ端，必須將其熒光基團(tuán)切除之后才可允許下一個(gè)dNTP分子的摻入。在dNTP摻入新鏈成像之后，切除熒光基團(tuán)，加帽，允許下一個(gè)核苷酸的摻入。tSMS（turesinglemoleculesequencing

）SMRT（singlemoleculeReal-Time）sequencing

該方法采用四色熒光標(biāo)記的dNTP和被稱為零級(jí)波導(dǎo)(zero-modewaveguides,ZMW)的納米結(jié)構(gòu)對(duì)單個(gè)DNA分子進(jìn)行測(cè)序。當(dāng)DNA合成進(jìn)行時(shí)，連接上的dNTP由于在ZMW底部停留的時(shí)間較長(zhǎng)(約200ms)，其熒光信號(hào)能夠與本底噪音區(qū)分開來(lái)，從而被識(shí)別。熒光基團(tuán)被連接在dNTP的磷酸基團(tuán)上，因此在延伸下一個(gè)堿基時(shí)，上一個(gè)dNTP的熒光基團(tuán)被切除，從而保證了檢測(cè)的連續(xù)性，提高了檢測(cè)速度。Nanopore

當(dāng)單鏈DNA或RNA分子通過(guò)納米級(jí)的小孔時(shí)，由于堿基形狀大小不同，引起孔內(nèi)電阻變化，在小孔兩端保持一個(gè)恒定的電壓，則能夠檢測(cè)到通過(guò)小孔的電流變化情況