禤淑霞-環(huán)境基因組學(xué)：研究除草劑2,4-D毒性和抗性機(jī)制pp

摘要前沿用酵母模型來闡明基因-環(huán)境的相互作用用植物模型來闡明基因-環(huán)境的相互作用總結(jié)與展望第一頁，共21頁。摘要利用基因組學(xué)的信息和工具，能夠更好的理解各種有機(jī)體與周圍的環(huán)境的相互作用。在這里，我們揭示了環(huán)境基因組學(xué)這個新的領(lǐng)域如何研究2,4-D氯化苯氧乙酸除草劑(2,4-D氯化苯氧乙酸)的毒理作用機(jī)制和抗性的基本原理。2,4-D是最成功和最廣泛使用的除草劑之一，但它的過度使用已經(jīng)導(dǎo)致雜草抗藥性的增加，而且當(dāng)使用濃度高于推薦濃度的時候也引發(fā)了一些毒物學(xué)的問題。這篇綜述以釀酒酵母和擬南芥兩種模式生物來展開關(guān)于2,4-D的毒性和相應(yīng)的反應(yīng)。第二頁，共21頁。前言2,4-D的廣泛和高強(qiáng)度的使用可能導(dǎo)致一些毒物學(xué)的和環(huán)境的問題，而且已經(jīng)導(dǎo)致出現(xiàn)了抗藥性增加的雜草（造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，威脅環(huán)境和人類健康）利用釀酒酵母和擬南芥兩種模式生物，并結(jié)合了基因-基因的方法，研究2，4-D毒性作用機(jī)制和適應(yīng)反應(yīng)。在一個細(xì)胞或組織的DNA（基因型），RNA（轉(zhuǎn)錄組學(xué)），蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)組學(xué)）和代謝物（代謝組學(xué)）水平上，研究所有基因的表達(dá)與毒物的響應(yīng)，這種新的毒性系統(tǒng)論方法被認(rèn)為是毒理基因組學(xué)。這種新的各學(xué)科間交叉的領(lǐng)域把新的技術(shù)和研究病理學(xué)和毒物學(xué)的較傳統(tǒng)的工具結(jié)合起來，進(jìn)而研究在環(huán)境壓力下生物的反應(yīng)。生物學(xué)系統(tǒng)方法論提供了一個空前有力的工具來直接監(jiān)控毒物學(xué)的最早期的反應(yīng)。通過微陣列或表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)，在幾乎一出現(xiàn)毒物反應(yīng)時就能檢測出發(fā)生變化的全部基因的表達(dá)。而毒性的臨床反應(yīng)可能會幾天甚至幾年才表現(xiàn)出來。因此，比起傳統(tǒng)的毒物學(xué)方法，評估這些基因表達(dá)的改變可能提供一個更早更靈敏的毒性反應(yīng)的生物標(biāo)記。第三頁，共21頁。用酵母和植物模型來闡明基因-環(huán)境的相互作用

真核模型系統(tǒng)的開發(fā)有助于人們了解對環(huán)境刺激對人類健康所產(chǎn)生的影響。由于很多信號途徑和它們的分子組成成分充分保留在模式真核生物中，這些模型系統(tǒng)也成功解釋化學(xué)分子在這些基本途徑中的表達(dá)和功能。大量的模式系統(tǒng)改進(jìn)了高質(zhì)量高通量的基因組工具和增加了數(shù)據(jù)庫。釀酒酵母是單細(xì)胞的真核模型，具有非致病性，便宜，容易進(jìn)行遺傳操作，好的特性以及快速生長率等特點(diǎn)。借助于簡單可用的數(shù)據(jù)庫和幾年的后基因組研究也收集了大量的生物學(xué)信息擬南芥的小型，快速生活周期和多種子產(chǎn)量使得人們關(guān)注并研究了它的強(qiáng)烈的遺傳性，生化和生理超過40年，從而為實驗室操作和培養(yǎng)提供了有利條件。大量的基因組資源使得擬南芥可以對植物在非生命的壓力時的反應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)選擇的分子和系統(tǒng)廣泛的研究第四頁，共21頁。酵母對2，4-D的全面反應(yīng)，評估2，4-D的毒性

通過多藥物抵抗和細(xì)胞外被膜重排來解毒

細(xì)胞內(nèi)酸化和pH恢復(fù)

強(qiáng)氧化劑反應(yīng)和抗氧化性反應(yīng)

一般脅迫應(yīng)激反應(yīng)營養(yǎng)限制的感應(yīng)和反應(yīng)：TOR途徑的作用

第五頁，共21頁。擬南芥對2,4-D應(yīng)激反應(yīng)除草劑2,4-D作用的模型分子機(jī)制研究通過多藥耐藥運(yùn)輸來解毒

細(xì)胞內(nèi)pH恢復(fù)和膜或細(xì)胞壁改變普通壓力應(yīng)激TOR途徑第六頁，共21頁。圖3，酵母對2,4-D適應(yīng)性反應(yīng)的模式。(a)刺激反應(yīng)的H+-ATPases出現(xiàn)在質(zhì)膜和液泡膜中。(b)抗氧化防衛(wèi)活化。(c)基因轉(zhuǎn)錄活化編碼多藥物運(yùn)輸，推定涉及除草劑抗衡離子的主動運(yùn)輸，細(xì)胞壁和質(zhì)膜重排。(d)通過TOR途徑進(jìn)行選擇性營養(yǎng)新陳代謝的活化作用

第七頁，共21頁。在低pH環(huán)境中，高親脂弱酸性的2，4-D呈現(xiàn)未解離的親脂毒性狀態(tài)（RCOOH），因此經(jīng)由被動擴(kuò)散能容易地通過質(zhì)膜。在中性的細(xì)胞溶質(zhì)中，2，4-D的非解離形式分解，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酸化和毒性抗衡離子的堆積（RCOO?），而不能輕易的通過質(zhì)膜脂質(zhì)雙分子層。因此，低的pH值（例如酸性土壤，動物消化道）會顯著的引起除草劑的毒性。第八頁，共21頁。在酵母中，多重抗藥性質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)屬于擴(kuò)散載體超家族(MFS)或ATP結(jié)合盒(ABC)超家族，給予藥物和其他化學(xué)應(yīng)力組成的抗性，可能是促進(jìn)了它們的非親脂性狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。在MDR家族中Tpo1p和Pdr5p（分別屬于MFS和ABC超家族）的參與酵母對2，4-D的抗性的基礎(chǔ)上，假設(shè)這些質(zhì)膜運(yùn)輸促進(jìn)了2,4-D抗衡離子的主動運(yùn)輸。對2,4-D起抗性的酵母9個基因[編碼MDR運(yùn)輸和由相同的多重藥物抗性（PDR）調(diào)整網(wǎng)絡(luò)控制]進(jìn)行了微陣列分析，發(fā)現(xiàn)只有TPO1和PDR5能確定在對除草劑的抗性中起到?jīng)Q定性作用。在2,4-D刺激下一些基因（包括細(xì)胞壁重塑）上調(diào)。這些包括SPI1編碼減少壁孔和親脂性2,4-D通過質(zhì)膜的細(xì)胞壁蛋白的表達(dá)。在質(zhì)膜組成水平上的改變，包括增加了膜脂肪酸的飽和度。這些適應(yīng)性機(jī)制保護(hù)膜脂氧化，對于生物膜的流動性和功能有深刻的影響。由OLE1編碼的Δ9脂肪酸去飽和酶減少轉(zhuǎn)錄（催化飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)化），以適應(yīng)2,4-D第九頁，共21頁。細(xì)胞內(nèi)的酸化可能抑制大量生物反應(yīng)，特別是H+依賴的跨膜運(yùn)輸。分析對2,4-D適應(yīng)時的酵母蛋白質(zhì)組的改變，顯示了液泡H+-ATPase(V-ATPase)的兩種亞基Vma1p和Vma2p的含量增加。V-ATPase活性的刺激和質(zhì)膜H+-ATPase的活化，可能使酵母細(xì)胞部分中和細(xì)胞內(nèi)酸性，并最終在中性除草劑脅迫下繼續(xù)生長第十頁，共21頁。在2,4-D脅迫下，羥基和脂質(zhì)過氧化水平增加部分基因上調(diào)，這些基因涉及參與β-氧化過氧化物酶和線粒體氧化磷酸化反應(yīng)，這兩個主要的代謝反應(yīng)導(dǎo)致了內(nèi)部生成活性氧化物(ROS)。2,4-D也會導(dǎo)致線粒體呼吸鏈的電子滲漏，以及催化和誘導(dǎo)老鼠細(xì)胞的脂肪酸的β-氧化?？赡軙斓脑黾覴OS的生成量2,4-D誘導(dǎo)一種烷基過氧化物酶AhplP氧化形式數(shù)量的增加。微陣列分析結(jié)果指出那些涉及谷胱甘肽和硫氧還蛋白代謝和重要的NADP余因子再生的基因也上調(diào)以應(yīng)對除草劑。這些抗氧化防衛(wèi)的刺激與羥基水平的逐漸減少相一致，酵母細(xì)胞群體適應(yīng)除草劑并能重新回到對數(shù)生長期。第十一頁，共21頁。圖4利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)來研究酵母對2,4-D的反應(yīng)。用2D電泳分離酵母蛋白質(zhì)組。在暴露在除草劑后，相對蛋白豐度和修正的一些改變已經(jīng)強(qiáng)調(diào)出來，特別是涉及一般脅迫應(yīng)激的蛋白(Hsp12p),氨基酸耗損(His4pandMet6p)和氧脅迫反應(yīng)（減少和Ahp1p的氧化形式）。第十二頁，共21頁。非特異性轉(zhuǎn)錄重編，發(fā)生在應(yīng)激性脅迫下，并由轉(zhuǎn)錄因子Msn2p和Msn4p控制，并認(rèn)為是適應(yīng)2,4-D的反應(yīng)之一目的基因編碼熱休克蛋白，分子伴侶和抗氧化物酶，這些可能涉及在酵母暴露在2,4-D后出現(xiàn)的體內(nèi)變性環(huán)境后保護(hù)或變性蛋白的恢復(fù)。在Sfp1p和Rap1p的控制下減少蛋白合成，在Rpn4p的控制下增加蛋白質(zhì)變性，這也是普通應(yīng)激反應(yīng)的特征。這個反應(yīng)，也假設(shè)是2,4-D誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄廣泛性改變，也推測是在壓力下維持蛋白翻譯的準(zhǔn)確性。Rpn4p一個可能與遍在蛋白化-蛋白質(zhì)組途徑相關(guān)的多藥抗性適配器，也顯示出對2,4-D活性基因大約有>8%的調(diào)整。在2,4-D侵略后，涉及RNA和蛋白變性的蛋白的濃度的增加也呈現(xiàn)出定量的蛋白質(zhì)組學(xué)。第十三頁，共21頁。經(jīng)微陣列和蛋白質(zhì)組學(xué)分子分析，酵母對2,4-D的全面反應(yīng)表明大量的基因上調(diào)，這些基因涉及碳源和氮源代謝中氨基酸生物合成的改變，并引起體內(nèi)氨基酸濃度的劇烈減少。2,4-D作用于質(zhì)膜脂質(zhì)組成和滲透性而禁止?fàn)I養(yǎng)的輸入。除草劑增加了雙分子層的寬度和膜系統(tǒng)疏水結(jié)構(gòu)域的深度結(jié)構(gòu)攝動。另外，在兔大腦和老鼠肌肉組織中一些膜聯(lián)合溶質(zhì)運(yùn)輸系統(tǒng)受到限制。整合很多來自轉(zhuǎn)錄組學(xué)的數(shù)據(jù)，表明2,4-D的出現(xiàn)使TOR途徑受到抑制。這個信號途徑控制蛋白合成和降解的平衡，以響應(yīng)營養(yǎng)數(shù)量和質(zhì)量，從而保證營養(yǎng)代謝的轉(zhuǎn)錄控制。第十四頁，共21頁。植物激素可以誘導(dǎo)氨基環(huán)丙烷羧酸合成酶的從頭合成，ACC水平的放大，乙烯的直接前體，導(dǎo)致涉及應(yīng)激反應(yīng)，植物生長和衰老的氣態(tài)植物生長素濃度的大量增加?？赡芡ㄟ^葉黃素類的分裂，增加的乙烯濃度輪流引發(fā)脫落酸(ABA)的生物合成，脫落酸的積累會導(dǎo)致生長抑制，形態(tài)變異和衰老。與這個模型一致，最近基因組廣泛的基因表達(dá)對在擬南芥中2,4-D除草濃度的效應(yīng)的研究報道了一些涉及的生長素反應(yīng)，乙烯信號，和脫落酸合成，發(fā)出信號和反應(yīng)的基因的調(diào)整。另外，除草劑對一些涉及細(xì)胞生長和延長的基因表達(dá)有下調(diào)作用，而對非生物和生物刺激都有反應(yīng)的基因卻有上調(diào)作用。第十五頁，共21頁。圖5擬南芥中2,4-D的除草濃度產(chǎn)生的可見的表型效應(yīng)，包括葉片衰老，干燥，和抑制跟的延長和分支。最初的圖來自(a)3周大的植物在1

mM2,4-D中2h，(b)5天大的植物在0.1

μM2,4-D中6天第十六頁，共21頁。擬南芥有一些與ScTPO1有高度同源性的MFS開放閱讀框，和之前在植物中描述的Pdr5-like蛋白。有趣的是，2,4-D對植物的第一個PDR基因起到誘導(dǎo)作用生物信息學(xué)分析指出擬南芥基因組有15個編碼運(yùn)輸?shù)鞍椎幕?，而其中只有三個(AtPDR8,AtPDR9andAtPDR12)在功能水平上進(jìn)行了鑒定。與涉及2,4-D輸出的同系性ScPdr5p酵母運(yùn)輸一致，AtPDR9也決定了植物對除草劑的抗性。AtPDR9催化根部細(xì)胞的2,4-D輸出而不影響內(nèi)部生長激素的運(yùn)輸。為了揭露額外的MDR運(yùn)輸在植物細(xì)胞輸出2,4-D時起到的作用，需要做進(jìn)一步的研究，從而為利用生物技術(shù)解決雜草除草劑抗性做好準(zhǔn)備。第十七頁，共21頁。植物激素誘導(dǎo)質(zhì)膜H+-ATPase的活性，H+-ATPase在植物根部可維持細(xì)胞內(nèi)pH值，從而調(diào)節(jié)除草劑抗性有2,4-D存在時，分離的植物膜中磷脂酰肌醇的降解會增強(qiáng)，mRNA堆積物及低聚糖和木聚糖在細(xì)胞壁的溶解相關(guān)聯(lián)。關(guān)于2,4-D對質(zhì)膜和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的特殊作用的進(jìn)一步研究對闡明在雜草除草劑抗性的研究有重要的意義第十八頁，共21頁。對暴露在2,4-D后受到誘導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)錄學(xué)組的改變進(jìn)行整體分析，結(jié)果顯示涉及植物脅迫整體應(yīng)激的一系列基因都受到調(diào)節(jié)。兩種植物激素--乙烯和ABA，在擬南芥的脅迫應(yīng)激反應(yīng)中起到重要的作用。微陣列分析中一些涉及生物合成或是信號傳遞和一些壓力反應(yīng)激素的基因(e.g.NCED,ABF3,COR78,KIN1)確實得到上調(diào)。然而，其他壓力相關(guān)的基因并沒有直接受到植物激素的調(diào)節(jié)（如防御和保衛(wèi)基因，解毒作用的基因）第十九頁，共21頁。在釀酒酵母中第一次描述的TOR蛋白和途徑，與真菌和哺乳動物中的有密切同源性和相似功能雖沒有在植物中進(jìn)行研究但TOR蛋白(AtTOR)存在于植物中，已有報道指出在擬南芥中有TOR激酶途徑：分生組織頂芽生殖部位和脅迫信號的生長調(diào)節(jié)表明這個途徑在較高級的真核細(xì)胞中有一個相似的作用，和對雜草抗性有影響。第二十頁，共21頁?？偨Y(jié)和展望整體基因組的表達(dá)技術(shù)在鑒定那些受重要的化學(xué)物在早期毒物學(xué)反應(yīng)影響的基因有廣泛的應(yīng)用潛力。這技術(shù)對毒物的毒物學(xué)機(jī)制的闡明可能有用，而且有助于關(guān)聯(lián)風(fēng)險的描述。酵母提供了一個有用的實驗?zāi)Ｊ絹硌芯刻幱谥匾霓r(nóng)用化學(xué)除草劑2,4-D的毒理學(xué)作用的基礎(chǔ)分子機(jī)制和相關(guān)的適應(yīng)響應(yīng)。擬南芥的補(bǔ)充應(yīng)用為研究2,4-D特殊作用在目的雜草中和它們的除草劑抗性機(jī)制的提供了有力證據(jù)。當(dāng)2,4-D作為強(qiáng)氧化劑或