單克隆抗體與基因工程抗體的制備

單克隆抗體與基因工程抗體的制備第1頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四抗體種類：第一代抗體多克隆抗體（polyclonalantibody)第二代抗體單克隆抗體（monoclonalantibody)第三代抗體基因工程抗體（geneticengineeringantibody)第2頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四雜交瘤技術(shù)的基本原理單克隆抗體的制備一、單克隆抗體的產(chǎn)生二、單克隆抗體的純化三、單克隆抗體的性質(zhì)鑒定四、單克隆抗體的特性基因工程抗體制備一、基因工程抗體種類二、原理三、重組抗原制備過程第3頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四基本概念抗原決定簇（抗原表位）細(xì)胞克隆多克隆抗體單克隆抗體是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，又稱表位(epitope).由一個B淋巴細(xì)胞增殖而成的細(xì)胞集團(tuán)針對多種抗原決定簇的混合抗體由單個B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對單一抗原決定簇的同源抗體第4頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四雜交瘤技術(shù)的理論基礎(chǔ)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的克隆選擇學(xué)說，即一種克隆只產(chǎn)生一種抗體細(xì)胞融合技術(shù)產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞可以保持雙方親代細(xì)胞的特性利用代謝缺陷補(bǔ)救機(jī)理篩選雜交瘤細(xì)胞，并克隆化，制備McAb當(dāng)兩個細(xì)胞緊密接觸時，細(xì)胞膜可能融合在一起。融合細(xì)胞含有兩個不同的細(xì)胞核，稱為異核體，產(chǎn)生具有原來兩個細(xì)胞基因信息的單個核細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞（hybridcell）。第5頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤技術(shù)原理：聚乙二醇（PEG）：細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì)

胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合HAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：反復(fù)的免疫學(xué)檢測篩選克隆化增殖的雜交瘤

細(xì)胞系單克隆抗體生成：接種雜交瘤

細(xì)胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價的單克隆抗體第6頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四流程雜交瘤技術(shù)第7頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四不產(chǎn)生Ig的重鏈和輕鏈HGPRT-;TK-與提供淋巴細(xì)胞的動物品系相同（一）小鼠骨髓瘤細(xì)胞第8頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四

動物：BALB/c小鼠7～12周齡20g～25g體重（二）免疫脾細(xì)胞第9頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐劑，2~3周重復(fù)一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加強(qiáng)免疫免疫小鼠第10頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四細(xì)胞融合劑：PEG:分子量4000的PEG是最常用的細(xì)胞融合劑作用機(jī)理：誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易打開而有助于細(xì)胞融合作用特點：隨機(jī)發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同第11頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四骨髓瘤細(xì)胞與淋巴細(xì)胞(1:3-10)50%PEG1min內(nèi)加完;10ml培養(yǎng)液終止反應(yīng)融合方法第12頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞的比例為1：2～51ml50%的PEG（無菌，預(yù)溫37℃）在1分鐘內(nèi)滴完,靜置45秒,時間一到,將事先準(zhǔn)備的培養(yǎng)液一滴一滴加入,停止PEG作用根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入HAT培養(yǎng)基，使之分加到96孔板中時每孔細(xì)胞數(shù)為（0.5～1.5）×105個。融合后7-14天，換用HT培養(yǎng)液細(xì)胞融合第13頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四7～20天出現(xiàn)克隆HAT篩選挑克隆融合細(xì)胞的早期培養(yǎng)第14頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四HAT培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細(xì)胞通過替代途徑合成DNA雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)第15頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四HAT選擇作用：淋巴細(xì)胞：不能生長，5~7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細(xì)胞：不能生長，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻第16頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四雜交瘤細(xì)胞：長期生長繁殖利用淋巴細(xì)胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA從淋巴細(xì)胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息從骨髓瘤細(xì)胞獲得不斷繁殖的能力第17頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四有限稀釋法特點：不需任何特殊設(shè)備克隆出現(xiàn)效率高實驗室常用方法方法：細(xì)胞懸液通過系列稀釋每個培養(yǎng)孔含0.5～1個細(xì)胞陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)與凍存第18頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四

單克隆抗體的制備

經(jīng)過反復(fù)克隆化獲得的抗體陽性雜交瘤細(xì)胞株應(yīng)立即擴(kuò)大培養(yǎng)（除及時凍存的細(xì)胞外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應(yīng)盡早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體。第19頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四一、單克隆抗體的產(chǎn)生動物體內(nèi)誘生方法：每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只體外培養(yǎng)法：中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)

單抗含量不高，牛血清Ab難以去除第20頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四腹腔注射法第21頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四鹽析沉淀親和層析離子交換層析

二、McAb的純化第22頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四Ig類型、亞類測定：雙擴(kuò)法或ELISA法特異性測定：抗原類似物的交叉反應(yīng)效價測定：用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示

表位測定：幾株單抗是否為不同表位特異的,用競

爭抑制法，相加指數(shù)法及微機(jī)集群分析親和性測定：測定親和常數(shù)K雜交瘤細(xì)胞染色體：秋水仙素裂解法，小鼠B細(xì)胞染色體40條，SP2/0細(xì)胞68條，雜交瘤細(xì)胞一般100多條McAb靶抗原分子量：常用westernblot三、 單克隆抗體的性質(zhì)鑒定第23頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四四、單克隆抗體的特性高度特異性高度的均一性和可重復(fù)性弱凝集反應(yīng)和不呈現(xiàn)沉淀反應(yīng)對環(huán)境敏感性（一）單克隆抗體的特性第24頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四優(yōu)點：在體外“永久”地存活并傳代用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。適用于以標(biāo)記抗體為特點的免疫學(xué)分析方法可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療單克隆抗體的優(yōu)點與局限性局限性：固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍反應(yīng)強(qiáng)度不如多克隆抗體制備技術(shù)復(fù)雜、費時費工、價格較高第25頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四

McAb

PcAb

抗原要求可以不純純度高得量高低特異性高低

穩(wěn)定低高沉淀反應(yīng)無有成本高低McAb與PcAb的比較第26頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四McAbandPcAb第27頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四基因工程抗體制備基因工程抗體(Geneticengineeringantibody)

根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體。主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價抗體和雙特異性抗體。第28頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四

將小鼠Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人Ig基因，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人Ab，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)，產(chǎn)生大量完全人源化抗體一、人源化抗體第29頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四Fab：抗原結(jié)合片斷Fv：可變區(qū)片段ScFv：單鏈可變區(qū)片段SdAb：單區(qū)抗體

二、小分子抗體第30頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四其它生物活性蛋白融合三、抗體融合蛋白第31頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四許多抗原抗體反應(yīng)要求雙價的抗原結(jié)合位點，使抗原分子上的兩個表位交聯(lián)或使兩個抗原分子連接。將識別腫瘤抗原的抗體和識別細(xì)胞毒性免疫效應(yīng)細(xì)胞表面分子的抗體連結(jié)在一起，可使效應(yīng)細(xì)胞更容易與腫瘤細(xì)胞結(jié)合識別，取得殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。四、雙特異性抗體第32頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四定義：將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。利用這一技術(shù)可以得到完全人源性的抗體，在HIV等病毒感染和腫瘤的診斷與治療方面有其獨特的優(yōu)越性

五、噬菌體抗體庫技術(shù)第33頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四原理與操作技術(shù)基因工程亦稱遺傳工程，即利用DNA重組技術(shù)的方法，把DNA作為組件，在細(xì)胞外將一種外源DNA（目的基因）和載體DNA重新組合連接（重組），最后將重組體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，使外源基因DNA在宿主細(xì)胞中，隨細(xì)胞的繁殖而增殖（cloning，克?。?，或最后得到表達(dá)，最終獲得基因表達(dá)產(chǎn)物或改變生物原有的遺傳性狀。第34頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四基因工程的操作技術(shù)

ForeignDNAtobeinsertedPlansmidvectorJoiningRecombinantDNAmoleculeIntroductionintohostcellsbytransformationofviralinfection

HostchromatemeSlectionforcellscoteiningarecombinantDNAmoleculeCloning+1、體外基因重組

目的基因的制備

載體的構(gòu)建：質(zhì)?；蚴删w

目的基因與載體重組2、重組體DNA的轉(zhuǎn)化增殖和表達(dá)

轉(zhuǎn)化

篩選

增殖和基因表達(dá)第35頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))第36頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四

PCR技術(shù)原理示意圖

靶序列變性和引物復(fù)姓循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3變性和引物復(fù)姓鏈延伸Tag酶鏈延伸第37頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四抗原的原核表達(dá)以脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP）為例：首先要合成或購買表達(dá)FABP的基因序列并設(shè)計合成引物第38頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四ATGGTGGACGCTTTCCTGGGCACCTGGAAGCTAGTGGACAGCAAGAATTTCGATGACTACATGAAGTCACTCGGTGTGGGTTTTGCTACCAGGCAGGTGGCCAGCATGACCAAGCCTACCACAATCATCGAAAAGAATGGGGACATTCTCACCCTAAAAACACACAGCACCTTCAAGAACACAGAGATCAGCTTTAAGTTGGGGGTGGAGTTCGATGAGACAACAGCAGATGACAGGAAGGTCAAGTCCATTGTGACACTGGATGGAGGGAAACTTGTTCACCTGCAGAAATGGGACGGGCAAGAGACCACACTTGTGCGGGAGCTAATTGATGGAAAACTCATCCTGACACTCACCCACGGCACTGCAGTTTGCACTCGCACTTATGAGAAAGAGGCATGA上游引物：HF1>5’CGGAATTCATGGTGGACGCTTTCCTGGGC3’>

下游引物：HF2>5’GCCTCGAGTCATGCCTCTTTCTCATAAGT3’>

基因序列酶切位點第39頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四NdeIXbaICA

T

A

T

GG

T

A

T

ACTCT

A

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AA

G

A

TCTT

A

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G

ACTA

G

A

TCCAG

T

A

T

CT

A

G

A

T限制性內(nèi)切酶

限制性內(nèi)切酶可識別特定位點并切割DNA產(chǎn)生粘性末端或平端的外源片段，經(jīng)DNA的純化處理后用于連接反應(yīng)。第40頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四通過擴(kuò)增獲取足夠的聯(lián)結(jié)片段PCR擴(kuò)增第41頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四實驗步驟去離子水緩沖液dNTP引物模板DNA聚合酶混勻1、按下列體系配制反應(yīng)混合液，混勻，

TemplatecDNA

5.0μL10×buffer

2.5μLMgCl2（25mmol/L）

1.0μLPrimer1(10μmol/L)

0.5μLPrimer2(10μmol/L)

0.5μLdNTP（2mmol/L）

2.0μLTaq酶（5U/μL）

0.25μL加ddH2O至

50μL2、PCR反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置

94℃變性反應(yīng)1min；55℃退火反應(yīng)45s；72℃延伸反應(yīng)1min。進(jìn)行25個循環(huán)后，最后一個循環(huán)72℃延長至10min。迅速冷卻4℃。第42頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四實驗結(jié)果121.PCR產(chǎn)物2.MarkerPCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳第43頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四PCR片段的TA克隆第44頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四實驗原理T載體的特點是將普通的克隆載體切成線狀，并使之在3'末端含有一個凸出堿基T；Taq

DNA聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，可在DNA片段的3'末端添加一個核苷酸，通常為A。因此，TaqDNA聚合酶擴(kuò)增的產(chǎn)物可與T-載體進(jìn)行粘端互補(bǔ)連接，達(dá)到高效克隆的目的。因為TA克隆法操作最簡單，快速和高效的原因，成為Taq聚合酶PCR產(chǎn)物的最佳克隆方法。第45頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四試劑與器材1、材料：純化的PCR產(chǎn)物2、試劑

（1）LB液體培養(yǎng)基（2）1.5%瓊脂LB固體培養(yǎng)基（3）5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷（X-gal）儲存液(20mg/mL)（4）異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）儲液(20mg/mL)（7）pEASY-Blint載體系統(tǒng)3、儀器

全自動高壓滅菌鍋、恒溫水浴槽、高速冷凍離心機(jī)、

超凈工作臺、恒溫?fù)u床、電泳儀及電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)第46頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四實驗步驟PCR產(chǎn)物T載體連接緩沖液連接酶室溫10min轉(zhuǎn)化大腸桿菌37℃過夜鋪平板TA質(zhì)粒的構(gòu)建

⑴連接反應(yīng)一般在滅菌的0.5mL離心管中進(jìn)行。

⑵10μL體積反應(yīng)體系中：

pEasy載體1μL

純化的PCR產(chǎn)物3μL⑶輕輕混勻，室溫下放置反應(yīng)10min。第47頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)化（1）取一裝有的100μL感受態(tài)細(xì)胞的EP管，加入上一步聯(lián)結(jié)產(chǎn)物，冰浴上放置30min。（2）將該EP管放入預(yù)加溫至42℃的水浴中，熱激45s，快速轉(zhuǎn)移到冰浴中放置2min。（3）向每個EP管加入500μL的

LB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至37℃恒溫?fù)u床上，150r/min，溫育45min以復(fù)蘇菌株。

（4）將200μL上述培養(yǎng)物加到含100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上（平板表面涂有20mg/mL的X-gal40μL和20mg/mL的IPTG40μL），以玻璃涂布棒輕輕地將轉(zhuǎn)化細(xì)胞平鋪于瓊脂平板表面。

（5）將平板置于室溫下至液體被完全吸收，倒置平皿，37℃過夜培養(yǎng)。第48頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四實驗結(jié)果重組載體的藍(lán)白篩選第49頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四

連接第50頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四CA

T

A

T

GG

T

A

T

ACTCT

A

G

AA

G

A

TCT實驗原理第51頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四試劑與器材1、材料純化的片段及載體2、試劑

（1）LB液體培養(yǎng)基（2）1.5%瓊脂LB固體培養(yǎng)基（3）T4連接酶及緩沖液3、儀器

全自動高壓滅菌鍋、恒溫水浴槽、高速冷凍離心機(jī)、

超凈工作臺、恒溫?fù)u床、電泳儀及電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)第52頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四實驗步驟表達(dá)載體目的片段SolutionI16℃30min轉(zhuǎn)化大腸桿菌37℃過夜鋪平板表達(dá)載體的構(gòu)建

⑴連接反應(yīng)一般在滅菌的

0.5mL離心管中進(jìn)行。

⑵10μL體積反應(yīng)體系中：目的片段3μL

表達(dá)載體2μLSolutionI5μL⑶輕輕混勻，16℃30min

。第53頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四重組子的鑒定質(zhì)粒的提取陽性重組子的酶切鑒定陽性重組子的PCR鑒定第54頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四實驗結(jié)果第55頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四

誘導(dǎo)表達(dá)第56頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四實驗步驟1、將工程菌接種LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)

OD600=0.62、加入終濃度為1mmol/L的IPTG。3、繼續(xù)培養(yǎng)5小時。第57頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四

表達(dá)產(chǎn)物的SDS鑒定第58頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四實驗原理SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳是對蛋白質(zhì)及小分子核酸進(jìn)行量化、比較和特性鑒定的一種快速方法。在蛋白質(zhì)樣品中加入SDS后，所有的蛋白質(zhì)分子都與SDS結(jié)合并帶有負(fù)電荷，因此蛋白質(zhì)在電場中的移動主要取決于蛋白質(zhì)分子量的大小，而于蛋白質(zhì)本身的等電點無關(guān)。為了增加分辨率通常采用不連續(xù)凝膠體系，該體系是由濃縮膠、分離膠兩部分組成。濃縮膠與分離膠由于有不同的凝膠濃度和緩沖液pH值，蛋白質(zhì)樣品在濃縮膠中受到濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)的影響，可被濃縮成一條極為狹窄的條帶，因此當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品進(jìn)入分離膠時就形成了彼此分離的清晰條帶，大大提高了分辨率。第59頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四試劑與器材試劑

1、丙烯酰胺溶液中含有甲叉雙丙稀酰胺2、過硫酸銨（聚合的引發(fā)劑）3、四甲基乙二胺（加速劑，可加快聚合的速度）儀器

垂直板電泳槽和電泳儀第60頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四實驗步驟1、倒制膠板。將兩玻璃板密封好，將所需濃度的分離膠溶液按比例加入燒杯混勻。倒入密封好的玻璃板間隙中，用少量正丁醇覆蓋液面，以隔絕空氣，并產(chǎn)生整齊的上液面。膠液的聚合大約需要半小時，隨后倒掉膠板上沿的液體并加入配置好的濃縮膠溶液，插入梳子，聚合后移去梳子。2、加樣與電泳蛋白質(zhì)樣品在加樣前需要和樣品緩沖液混合并煮沸5min，使蛋白質(zhì)發(fā)生溶解、變性。3、將制膠板中的密封膠條除去，裝入電泳槽，在正負(fù)極水槽中加入電極緩沖液，將預(yù)處理后的蛋白質(zhì)樣品加入對應(yīng)的梳空，裝好電泳槽，接好電源，開始電泳。4、染色與脫色電泳結(jié)束后，分離玻璃板，取出凝膠進(jìn)行染色，可將無色的凝膠直接放入考馬氏亮藍(lán)中振蕩染色約1h，再轉(zhuǎn)入脫色液中脫色。5、用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。第61頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四實驗結(jié)果

１、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白２,3、經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的工程菌４、未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的工程菌1234第62頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四表達(dá)產(chǎn)物的分離純化胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細(xì)胞破碎固液分離包含體細(xì)胞碎片分離變性復(fù)性濃縮初步分離高度純化發(fā)酵液細(xì)胞分離第63頁，共67頁，2023年，2月20日，星期四

在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，集聚狀態(tài)和共價修飾的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入復(fù)性過程，因此永遠(yuǎn)成為無活性的蛋白質(zhì)。包含體中的蛋白質(zhì)就屬于這兩種狀態(tài)，因此需要在體外進(jìn)行人