大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化課件

實(shí)驗(yàn)九，十

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化

在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過(guò)細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi),但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中,一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因,因此不能自行完成從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌（受體細(xì)胞）經(jīng)理化方法處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生暫時(shí)性改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的細(xì)胞，稱(chēng)感受態(tài)細(xì)胞。一.實(shí)驗(yàn)原理1.概念感受態(tài)細(xì)胞

轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。轉(zhuǎn)化KCl法，CaCl2法，電擊感受態(tài)制備等

RbCl(KCl)法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高，但制備較復(fù)雜，不適合實(shí)驗(yàn)室用電擊感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率高，操作簡(jiǎn)便，但需電擊儀

CaCl2法簡(jiǎn)便易行，且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿(mǎn)足一般實(shí)驗(yàn)的要求，制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)，可加入占總體積15％的無(wú)菌甘油于-70℃以下保存半年，因此CaCl2法使用更為廣泛.常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的發(fā)現(xiàn)，其基本原理是：細(xì)胞處于0～4℃，CaCl2

低滲溶液中，大腸桿菌細(xì)胞膨脹成球狀。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃90秒熱激處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA混合物。將細(xì)菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時(shí)間，促使在轉(zhuǎn)化過(guò)程中獲得的新的表型，如卡那霉素耐藥基因得到表達(dá)，然后將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂在含卡那霉素的選擇性培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)過(guò)夜，即可獲得細(xì)菌菌落。

CaCl2

法制備感受態(tài)細(xì)胞原理提高轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)因素

細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度試劑的質(zhì)量防止雜菌和雜DNA的污染

質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度:

用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí),轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。提高轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)因素

試劑的質(zhì)量:

所用的試劑,如CaCl2

等均需是最高純度的,并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處

防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行,所用器皿,如離心管,tip頭等最好是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染,否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入,為以后的篩選、鑒定帶來(lái)不必要的麻煩。

提高轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)因素1）材料

E.coliDH5α菌株；

質(zhì)粒、

1.5ml離心管（又稱(chēng)eppendorf管）

卡那霉素；

2）設(shè)備

恒溫?fù)u床，電熱恒溫培養(yǎng)箱，臺(tái)式高速離心機(jī)，超凈工作臺(tái)，低溫冰箱，恒溫水浴鍋，制冰機(jī)，分光光度計(jì)，微量移液槍?zhuān)琫ppendorf管等。

二.材料，設(shè)備及試劑三.操作步驟

本實(shí)驗(yàn)以E.coliDH5a菌株為受體細(xì)胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態(tài),然后與質(zhì)粒共保溫,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于質(zhì)粒帶有卡那霉素抗性基因，可通過(guò)卡那霉素抗性來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒(méi)有轉(zhuǎn)入質(zhì)粒，則在含卡那霉素的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。能在卡那霉素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。受體菌的培養(yǎng)

1)從LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α單菌落,接種于3-5mlLB液體培養(yǎng)基中,37℃,180rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；

2)將該菌懸液以1:30-100的比例接種于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2－3小時(shí)至OD600在0.5左右;3)無(wú)菌條件下取1.5ml菌液到eppendorf管中，冰浴10min，4℃,8000rpm離心5min;4)徹底棄上清液，在冰浴上加入500ul預(yù)冷的無(wú)菌CaCl2(0.lmol/L)使細(xì)胞懸浮；

5)4℃,8000rpm離心4min，棄上清液;6)用100μl預(yù)冷的無(wú)菌CaC12(0.lmol/L)重新懸浮細(xì)胞，冰上備用；

42℃水浴中熱擊90秒（勿搖動(dòng)），熱擊后迅速置于冰上冷卻2min；向管中加入400μlLB液體培養(yǎng)基(不含卡那霉素)，混勻后37℃，180rpm振蕩培養(yǎng)40min，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(卡那霉素)；涂平板：將上述菌液搖勻后取80ul涂布于含Kana的篩選平板上，在菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，37℃倒置培養(yǎng)皿培養(yǎng)12~18h。

注意：1、含卡那霉素的LB固體