微生物正交實(shí)驗(yàn)

微生物正交實(shí)驗(yàn)第1頁/共69頁

菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)是發(fā)酵生產(chǎn)的第一道工序,該工序又稱為種子制備。菌體數(shù)量增加種子制備高質(zhì)量的種子種子的擴(kuò)大培養(yǎng)任務(wù)：獲得純而壯且活力旺盛、接種數(shù)量足夠的培養(yǎng)物。

發(fā)酵時(shí)間長短和接種量的大小有關(guān)。將較多數(shù)量的成熟菌體接入發(fā)酵罐中，有利于縮短發(fā)酵時(shí)間，提高發(fā)酵罐利用率，減少染菌機(jī)會(huì)。第2頁/共69頁一、種子制備的過程1、固體培養(yǎng)基上生產(chǎn)大量孢子的孢子制備

2、液體培養(yǎng)基中生產(chǎn)大量菌絲的過程第3頁/共69頁1、孢子制備

孢子制備是種子制備的開始，孢子的質(zhì)量、數(shù)量對以后菌絲的生長、繁殖、發(fā)酵產(chǎn)量有明顯影響。（1）放線菌孢子的制備限制碳源、氮源（碳源1％，氮源不超過0.5％）；添加麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨、無機(jī)鹽；干燥。放線菌發(fā)酵生產(chǎn)的工藝流程：菌種母斜面子斜面搖瓶種子

種子罐

發(fā)酵罐（孢子）（孢子）（菌絲）第4頁/共69頁（2）霉菌孢子的制備一般以大米、小米、玉米、麩皮等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基（3）細(xì)菌培養(yǎng)物的制備斜面多為碳源限量、氮源豐富的配方第5頁/共69頁2、種子制備

種子制備是將固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的孢子或菌體轉(zhuǎn)入到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其繁殖成大量菌絲或菌體的過程。（1）搖瓶種子制備：某些孢子發(fā)芽和菌絲繁殖速度緩慢的菌種，需將孢子經(jīng)搖瓶培養(yǎng)成菌絲后再進(jìn)入種子罐，這就是搖瓶種子。分母瓶和子瓶。（2）種子罐種子制備：因菌種不同而異，一般可分為一級種子、二級種子和三級種子的制備。第6頁/共69頁A、一級種子：孢子或搖瓶菌絲被接入到體積較小的種子罐中，經(jīng)培養(yǎng)后形成大量菌絲。一級種子轉(zhuǎn)入到發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，稱為二級發(fā)酵。B、二級種子：將一級種子轉(zhuǎn)入體積較大的種子罐中，經(jīng)過培養(yǎng)形成更多的菌絲。二級種子轉(zhuǎn)入到發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，稱為三級發(fā)酵。C、三級種子，四級發(fā)酵種子罐的級數(shù)主要決定于菌株性質(zhì)和菌體生長速度及發(fā)酵設(shè)備的合理應(yīng)用。第7頁/共69頁二、種子培養(yǎng)

表面培養(yǎng)法：好氧靜置培養(yǎng)法固體培養(yǎng)法：曲法培養(yǎng)

液體深層培養(yǎng)液體表面培養(yǎng)固體表面培養(yǎng)淺盤固體培養(yǎng)深層固體培養(yǎng)第8頁/共69頁液體深層培養(yǎng)

液體深層種子罐從罐底部通氣，送入的空氣由攪拌漿葉分散成微小氣泡以促進(jìn)氧的溶解。這種由罐底部通氣攪拌的培養(yǎng)方法，相對于氣液界面靠自然擴(kuò)散使氧溶解的表面培養(yǎng)法，稱為深層培養(yǎng)法。深層培養(yǎng)基本操作的三個(gè)控制點(diǎn)：

Ⅰ滅菌Ⅱ溫度控制Ⅲ通氣、攪拌第9頁/共69頁幾種深層培養(yǎng)法（1）控制培養(yǎng)法：根據(jù)罐內(nèi)部的變化情況，掌握短時(shí)間內(nèi)狀態(tài)變量的變化以及可能測定的環(huán)境因子對微生物代謝活動(dòng)的影響，以此為基礎(chǔ)作控制培養(yǎng)，以達(dá)到產(chǎn)物的最優(yōu)培養(yǎng)條件。（2）載體培養(yǎng)法：以天然或人工合成的多孔材料代替麩皮之類的固體基質(zhì)作為微生物的載體。（3）兩步法：酶制劑的兩步深層培養(yǎng)中，將菌體生長（營養(yǎng)期）和產(chǎn)酶條件（繁殖期）區(qū)分開。第10頁/共69頁三、種子質(zhì)量控制種子質(zhì)量主要受孢子質(zhì)量、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、種齡和接種量等因素的影響。種子的質(zhì)量是發(fā)酵能否正常進(jìn)行的重要因素之一，因?yàn)榉N子制備不僅是要提供一定數(shù)量的菌體，更為重要的是要為發(fā)酵生產(chǎn)提供適合發(fā)酵、具有一定生理狀態(tài)大的菌體。種子質(zhì)量的控制將以此為出發(fā)點(diǎn)。第11頁/共69頁三、種子質(zhì)量控制1、培養(yǎng)基：盡量選擇一些有利于孢子發(fā)芽和菌絲生長的培養(yǎng)基；營養(yǎng)成分要盡可能和發(fā)酵培養(yǎng)基相近。2、培養(yǎng)條件：最適溫度；通氣攪拌的控制。青霉素生產(chǎn)：通氣充足和通氣不足的種子都接入發(fā)酵罐，發(fā)酵單位可相差一倍。土霉素發(fā)酵生產(chǎn)：一級種子罐通氣量小卻有利。攪拌不足會(huì)引起菌絲結(jié)團(tuán)、菌絲粘壁等異常第12頁/共69頁3、種齡：即種子培養(yǎng)時(shí)間。一般選對數(shù)生長期，菌體量尚未達(dá)到最高峰時(shí)移種。最適種齡：細(xì)菌——7～24h；霉菌——16～50h；放線菌——21～64h

同一菌種的不同罐批培養(yǎng)相同的時(shí)間，得到種子質(zhì)量也不完全一致，因此最適的種齡更應(yīng)通過多次試驗(yàn)，根據(jù)本批種子質(zhì)量來確定。第13頁/共69頁4、接種量：即移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。接種量大小與該菌在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度有關(guān)。

近年來，生產(chǎn)上多以大接種量和豐富培養(yǎng)基作為高產(chǎn)措施，如谷氨酸生產(chǎn)：采用高生物素、大接種量、添加青霉素加大接種量雙種法種子罐染菌或不理想倒種法、混種進(jìn)罐第14頁/共69頁5、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（1）細(xì)胞或菌體：菌體形態(tài)：顯微鏡觀察

菌體健壯、菌形一致、均勻整齊（單細(xì)胞菌體種子）菌絲粗壯、對某些染料著色力強(qiáng)、生產(chǎn)旺盛、菌絲分枝和內(nèi)含物情況良好（霉菌和放線菌種子）菌體生長量：離心沉淀法、光密度法、物質(zhì)代謝的反應(yīng)種子液外觀：顏色、粘度。第15頁/共69頁

（2）生化指標(biāo)：種子液的糖、氮、磷、和pH值變化（3）產(chǎn)物生成量：（4）酶活力5、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)第16頁/共69頁6、種子異常的分析種子異常往往表現(xiàn)為：（1）菌種生長發(fā)育緩慢或過快：和孢子質(zhì)量和種子罐的培養(yǎng)條件有關(guān)。（2）菌絲結(jié)團(tuán)：液體培養(yǎng)條件下，繁殖的菌絲不分散舒展而聚集成團(tuán)為菌絲團(tuán)，與攪拌效果差、接種量小有關(guān)。（3）菌絲粘壁：與攪拌效果差、泡沫過多、種子罐裝料系數(shù)過少等有關(guān)。第17頁/共69頁種子帶菌及其防治：

a種子帶菌：發(fā)酵前期染菌的重要原因之一，是發(fā)酵成敗的關(guān)鍵。

b種子帶菌原因：保藏的斜面試管菌種染菌、培養(yǎng)基和器具滅菌不徹底、種子轉(zhuǎn)移和接種過程染菌以及種子培養(yǎng)基所涉及的設(shè)備和裝置染菌等。第18頁/共69頁C種子染菌防治：

嚴(yán)格控制無菌室污染；制備種子時(shí)對沙土管、斜面、搖瓶等嚴(yán)格進(jìn)行管理，防止雜菌的進(jìn)入而受到污染；對每一級種子的培養(yǎng)物進(jìn)行嚴(yán)格的無菌檢查；對菌種培養(yǎng)基或器具進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌處理。

第19頁/共69頁工業(yè)培養(yǎng)基及制備第20頁/共69頁培養(yǎng)基

定義：提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。第21頁/共69頁一、工業(yè)培養(yǎng)基的選擇從微生物的特點(diǎn)來選擇培養(yǎng)基液體和固體培養(yǎng)基選擇從生產(chǎn)實(shí)踐和科學(xué)試驗(yàn)的不同要求選擇從經(jīng)濟(jì)效益方面考慮選擇生產(chǎn)原料第22頁/共69頁二、培養(yǎng)基配置原則根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的恰當(dāng)配比滲透壓pH值氧化還原電位第23頁/共69頁三、工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基

消耗每克底物將產(chǎn)生最大的菌體得率或產(chǎn)物得率能產(chǎn)生最高的產(chǎn)品或菌體濃度能得到產(chǎn)物的最大速率副產(chǎn)品的得率小價(jià)廉質(zhì)量穩(wěn)定來源豐富且供應(yīng)充分第24頁/共69頁蚌埠豐原生化運(yùn)用先進(jìn)的生物發(fā)酵和現(xiàn)代化工分離技術(shù)，以生物發(fā)酵技術(shù)為起點(diǎn)，大力發(fā)展農(nóng)產(chǎn)品深加工產(chǎn)業(yè)，發(fā)展成為集生物化工、制藥、食品加工、油脂加工、生物新材料為一體的加工制造產(chǎn)業(yè)集團(tuán)。

檸檬酸及其鹽類產(chǎn)品生產(chǎn)能力處于全國發(fā)酵產(chǎn)品行業(yè)第一位，在世界同行業(yè)排名前列，位居全國精細(xì)化工之首。豐原生化以玉米、小麥、油料等農(nóng)作物為原料，借助自己獨(dú)創(chuàng)的“利用玉米清液一次發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸”專利技術(shù)，國內(nèi)首家開發(fā)利用,開辟了檸檬酸生產(chǎn)的新途徑，選育了適應(yīng)該原料的新菌株，縮短了發(fā)酵周期，提高了收率，總收率達(dá)80%以上。降低了成本，提高了產(chǎn)品質(zhì)量，其綜合經(jīng)濟(jì)技術(shù)指標(biāo)處于國內(nèi)領(lǐng)先水平。以玉米代替山芋干為原料，避免了環(huán)境污染，副產(chǎn)品還可開發(fā)利用。第25頁/共69頁1、工業(yè)常用碳源2、工業(yè)常用氮源3、無機(jī)鹽4、生長因子5、前體物質(zhì)和促進(jìn)劑四、工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基成分第26頁/共69頁工業(yè)常用碳源功能：供給菌體生命活動(dòng)所需的能量構(gòu)成菌體細(xì)胞以及代謝的基礎(chǔ)谷物淀粉、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、大麥酒精、簡單的有機(jī)酸、烷烴甲醇、甲烷第27頁/共69頁工業(yè)常用氮源

功能：構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物無機(jī)氮源：氨水、銨鹽、硝酸鹽等有機(jī)氮源：玉米漿、豆餅粉、魚粉、酵母浸出液等

第28頁/共69頁無機(jī)鹽硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物、含鉀、鈣、鈉、鎂、鐵的化合物微量元素：銅、錳、鋅、鉬等功能：構(gòu)成菌體成分、酶的組成部分、酶的激活劑或抑制劑、調(diào)節(jié)培養(yǎng)滲透壓、調(diào)節(jié)pH和氧化還原電位第29頁/共69頁生長因子定義：凡是微生物生長不可缺少的微量有機(jī)物質(zhì)，如：氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素（生物素、硫胺素）。功能：構(gòu)成細(xì)胞的組成，促進(jìn)生命活動(dòng)的進(jìn)行。并非必需的。提供生長因子的農(nóng)副產(chǎn)品原料：玉米漿、麩皮水解液、糖蜜、酵母第30頁/共69頁谷氨酸產(chǎn)生菌：生物素缺陷型生物素對菌體和谷氨酸積累都有影響發(fā)酵中添加“亞適量”濃度第31頁/共69頁前體物質(zhì)目的：有助于調(diào)節(jié)產(chǎn)物的形成，大幅度提高發(fā)酵產(chǎn)率、降低成本。絲氨酸前體甘氨酸色氨酸前體吲哚/氨茴酸前體直接被菌體在微生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物分子上，而其自身結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，產(chǎn)物產(chǎn)量大幅度提高。第32頁/共69頁促進(jìn)劑

定義：在氨基酸、抗生素、酶制劑發(fā)酵生產(chǎn)過程中，可在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入某些對發(fā)酵起一定促進(jìn)作用的物質(zhì)，稱為促進(jìn)劑。例如：酶制劑發(fā)酵過程，添加誘導(dǎo)物、表面活性劑等促進(jìn)劑。第33頁/共69頁總之，培養(yǎng)基配置可參照前人的經(jīng)驗(yàn)配方，再結(jié)合菌種和產(chǎn)品的特性，采用搖瓶等小發(fā)酵設(shè)備對碳、氮、無機(jī)因子等單因子逐個(gè)試驗(yàn)，觀察這些因子對菌體生長和產(chǎn)物合成的影響，再綜合考慮各因素的影響，以得到最優(yōu)配方。為減少試驗(yàn)次數(shù)，可考慮用“正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)”等方法確定培養(yǎng)基的組分和濃度。第34頁/共69頁正交試驗(yàn)法定義：用正交表安排多因素試驗(yàn)與分析試驗(yàn)結(jié)果的辦法，簡稱正交試驗(yàn)。因素：影響試驗(yàn)指標(biāo)的條件水平：因素所處的狀態(tài)第35頁/共69頁簡化試驗(yàn)次數(shù)諸因素中哪些因素對指標(biāo)的影響較大，哪些因素較小。所考察的因素各取什么水平能使實(shí)驗(yàn)指標(biāo)較好指標(biāo)在不同水平時(shí)的變化規(guī)律等正交試驗(yàn)意義第36頁/共69頁

常用的正交表例如：

L4（23），L16（44），L27（313）正交表格式：Ln（tq）

L代表正交表，n代表實(shí)驗(yàn)次數(shù)，

t代表因素水平數(shù)，q代表因素?cái)?shù)。

常用的正交表可查閱有關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)書籍直接套用。第37頁/共69頁正交表選擇依據(jù)：在能容納所研究的因素?cái)?shù)和因素水平數(shù)的前提下選用試驗(yàn)次數(shù)最少的正交表來安排試驗(yàn)正交表安排試驗(yàn)注意事項(xiàng)：盡可能使各因素的水平數(shù)相等，試驗(yàn)的重復(fù)次數(shù)相當(dāng)。第38頁/共69頁正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果分析

直觀分析

方差分析第39頁/共69頁直觀分析

K1：每一因素每一水平下試驗(yàn)指標(biāo)值的總和k1：每一因素每一水平下試驗(yàn)指標(biāo)值的平均數(shù)R（級差）：試驗(yàn)指標(biāo)隨因素水平變化而改變的最大范圍第40頁/共69頁正交設(shè)計(jì)表表頭設(shè)計(jì)

考察指標(biāo)：糖酸轉(zhuǎn)化率（％）第41頁/共69頁

L16(44)正交實(shí)驗(yàn)

第42頁/共69頁正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀分析第43頁/共69頁實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析各因素對產(chǎn)酸影響的大小順序?yàn)椋浩咸烟?gt;KH2PO4>尿素>玉米漿，各因素的水平為：A2，B3，C2，D3

由此最終確立了菌株的優(yōu)化配方：葡萄糖4％；尿素1.5％；玉米漿1％；KH2PO40.5％。第44頁/共69頁直觀分析優(yōu)點(diǎn)：簡便、計(jì)算工作量小直觀分析缺點(diǎn)：判斷因素效應(yīng)的精度不夠，也不能給出誤差的大小。第45頁/共69頁正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析考察指標(biāo)：糖酸轉(zhuǎn)化率（％）第46頁/共69頁L16(44)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

第47頁/共69頁試驗(yàn)結(jié)果的方差分析第48頁/共69頁

以n表示試驗(yàn)的總次數(shù)，t代表A、B、C、D四因素每個(gè)水平的重復(fù)試驗(yàn)次數(shù)。n＝16，t＝4，方差分析的平方和

QA＝（∑Ki2）/t－（∑Xi）2/n

＝111818/4－6362/16＝2673.5QB＝19182/4－6362/16＝14.5QC＝101258/4－6362/16＝33.5QD＝101550/4－6362/16=106.5

Q＝∑Xi2－（∑Xi）2/n＝28137.6－6362/16

＝2856.4

Qe＝Q－(QA+QB+QC+QD)＝28.4第49頁/共69頁F＝s12/s22F檢驗(yàn)法通過計(jì)算方差之比來檢驗(yàn)兩組數(shù)據(jù)是否存在顯著性差異F（f1，f2）0.05＝9.28F（f1，f2）0.01＝29.46

第50頁/共69頁當(dāng)F>F（f1，f2）0.05時(shí)，該處理引起的差別有顯著意義；當(dāng)F>F（f1，f2）0.01時(shí)，該處理引起的差別有非常顯著意義；當(dāng)F<F（f1，f2）0.05時(shí)，該處理引起的差別有無顯著意義查單側(cè)F分布表第51頁/共69頁

根據(jù)F檢驗(yàn)可以看出因素A非常顯著，方差分析觀點(diǎn)認(rèn)為，只需對顯著的因素進(jìn)行選擇，不顯著的因素原則上可選試驗(yàn)范圍內(nèi)的任一點(diǎn)。因此可選A2，因素B、C、D可在試驗(yàn)范圍內(nèi)任取一點(diǎn)或由其它指標(biāo)確定。第52頁/共69頁微生物發(fā)酵方法第53頁/共69頁發(fā)酵方法

好氧發(fā)酵厭氧發(fā)酵：液體表面發(fā)酵固體表面發(fā)酵通氧深層發(fā)酵不通氧的深層發(fā)酵第54頁/共69頁

無論好氧或厭氧發(fā)酵都可通過深層培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)，這種培養(yǎng)均在具有一定徑高比的圓柱形發(fā)酵罐內(nèi)完成，操作方法可分為一下五種：分批式操作半分批式操作（流加式操作）反復(fù)分批式操作反復(fù)半分批式操作連續(xù)式操作第55頁/共69頁深層發(fā)酵操作方法（一）分批發(fā)酵（二）補(bǔ)料分批發(fā)酵法（三）連續(xù)發(fā)酵法

1、開放式連續(xù)發(fā)酵

2、封閉式連續(xù)發(fā)酵第56頁/共69頁（一）分批發(fā)酵

（batchfermentation)

每一批發(fā)酵過程都經(jīng)歷接種、生長繁殖、菌體衰老進(jìn)而結(jié)束發(fā)酵，最終提取出產(chǎn)物。發(fā)酵工業(yè)常見單罐深層分批發(fā)酵特點(diǎn)：微生物所處的環(huán)境是不斷變化的，可進(jìn)行少量多品種的發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)生雜菌污染能夠很容易終止操作，當(dāng)運(yùn)轉(zhuǎn)條件發(fā)生變化或需要生產(chǎn)新品種時(shí)，易改變處理對策，對原料組成要求粗放。第57頁/共69頁遲緩期對數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期第58頁/共69頁（二）補(bǔ)料分批發(fā)酵法

(fed-batchfermentation)補(bǔ)料分批發(fā)酵法又稱半連續(xù)發(fā)酵或半連續(xù)培養(yǎng)，是指在分批培養(yǎng)過程中，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法。補(bǔ)料分批發(fā)酵法廣泛適用于抗生素、氨基酸、酶制劑、有機(jī)酸、高聚物等的生產(chǎn)。與分批發(fā)酵相比，其優(yōu)點(diǎn)在于使發(fā)酵系統(tǒng)中維持很低的基質(zhì)濃度低基質(zhì)濃度優(yōu)點(diǎn)①可以除去快速利用碳源的阻遏效應(yīng)，并維持適當(dāng)?shù)木w濃度，不致加劇供氧的矛盾②避免培養(yǎng)基積累有毒代謝物第59頁/共69頁（三）連續(xù)發(fā)酵法

(continuousfermentation)

當(dāng)微生物培養(yǎng)到對數(shù)生長期時(shí)，在發(fā)酵罐中一方面以一定速度連續(xù)不斷地流加新鮮液體培養(yǎng)基，另一方面又以同樣地速度連續(xù)不斷地將發(fā)酵液排出，使發(fā)酵罐中微生物的生長和代謝活動(dòng)始終保持旺盛的穩(wěn)定狀態(tài)，而pH值、溫度、營養(yǎng)成分的濃度、溶解氧等都保持一定，并從系統(tǒng)外部予以調(diào)整，使菌體維持在恒定生長速度下進(jìn)行連續(xù)生長和發(fā)酵，大大提高發(fā)酵的生長效率和設(shè)備利用率。第60頁/共69頁連續(xù)發(fā)酵類型1、開放式連續(xù)發(fā)酵：培養(yǎng)系統(tǒng)中的微生物細(xì)胞隨著發(fā)酵液的流出而一起流出，細(xì)胞流出速度等于新細(xì)胞生成速度?？墒辜?xì)胞濃度處于某種穩(wěn)定狀態(tài)。最后流出的發(fā)酵液如部分返回（反饋）發(fā)酵罐進(jìn)行重復(fù)使用，則該裝置叫做循環(huán)系統(tǒng)，發(fā)酵液不重復(fù)使用的裝置叫做不循環(huán)系統(tǒng)。第61頁/共69頁（1）單罐均勻混合連續(xù)發(fā)酵：培養(yǎng)液以一定的流速不斷地流加到帶機(jī)械攪拌的發(fā)酵罐中，與罐內(nèi)發(fā)酵液充分混合，同時(shí)帶有細(xì)胞和產(chǎn)物的發(fā)酵液又以同樣流速連續(xù)流出。如果用一個(gè)裝置將流出的發(fā)酵液中部分細(xì)胞返回發(fā)酵罐，則構(gòu)成循環(huán)系統(tǒng)

單罐連續(xù)發(fā)酵

1－發(fā)酵罐2－分離器第62頁/共69頁（2）多罐均勻混合連續(xù)發(fā)酵將若干攪拌發(fā)酵罐串連起來，就構(gòu)成多罐均勻混合連續(xù)發(fā)酵裝置。新鮮培養(yǎng)液不斷流入第一次發(fā)酵罐，在最后一只罐中流出。多級連續(xù)發(fā)酵可以在每個(gè)罐中控制不同的環(huán)境