微生物鑒定中常用的生理生化實(shí)驗(yàn)

微生物鑒定中常用的生理生化實(shí)驗(yàn)第1頁(yè)/共22頁(yè)實(shí)驗(yàn)九

微生物鑒定中常用的生理生化實(shí)驗(yàn)第2頁(yè)/共22頁(yè)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.證明不同微生物對(duì)各種有機(jī)大分子物質(zhì)的水解能力不同，從而說(shuō)明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)。2.掌握進(jìn)行微生物大分子物質(zhì)水解實(shí)驗(yàn)的原理和方法。3.了解IMViC與硫化氫反應(yīng)的原理及其在腸道細(xì)菌鑒定中的意義和方法。第3頁(yè)/共22頁(yè)二、實(shí)驗(yàn)材料1.菌種枯草芽孢桿菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，普通變形桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌。2.培養(yǎng)基固體淀粉培養(yǎng)基，明膠培養(yǎng)基試管，尿素瓊脂試管，醋酸鉛培養(yǎng)基，葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基。3.溶液和試劑革蘭氏染色用盧戈氏碘液，甲基紅指示劑。第4頁(yè)/共22頁(yè)三、實(shí)驗(yàn)原理1.蛋白質(zhì)水解試驗(yàn)：微生物

對(duì)大分子物質(zhì)如淀粉不能直接利用，必須依靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解后，才能被微生物吸收利用。胞外酶主要為水解酶，裂解大分子為較小化合物，使其能被運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)。如淀粉酶水解淀粉為小分子的糊精、雙糖和單糖，這過(guò)程可通過(guò)觀(guān)察細(xì)菌菌落周?chē)奈镔|(zhì)變化來(lái)證實(shí)。淀粉遇碘液會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色，在細(xì)菌水解淀粉的區(qū)域，用碘液測(cè)定時(shí)不再產(chǎn)生藍(lán)色，表明細(xì)菌產(chǎn)生淀粉酶。第5頁(yè)/共22頁(yè)2.明膠液化試驗(yàn)：明膠是由膠原蛋白水解產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在25℃以下可維持凝膠狀態(tài)，以固體形式存在，而在25℃以上明膠會(huì)液化。有些微生物可產(chǎn)生一種稱(chēng)作明膠酶的胞外酶，水解這種蛋白質(zhì)，而使明膠液化，甚至在4℃仍能保持液化狀態(tài)。第6頁(yè)/共22頁(yè)尿素是由大多數(shù)哺乳動(dòng)物消化蛋白質(zhì)分泌在尿液中的廢物，尿素酶能分解尿素釋放出氨，這是一個(gè)分辨細(xì)菌很有用的診斷試驗(yàn)。盡管許多微生物都可以產(chǎn)生尿素酶，但它們利用尿素的速度比變形桿菌屬的細(xì)菌要慢，因此，尿素酶試驗(yàn)被用來(lái)從其他非發(fā)酵乳糖的腸道微生物中快速區(qū)分這個(gè)屬的成員。尿素瓊脂含有尿素葡萄糖和酚紅，酚紅在pH6.8時(shí)為黃色，而在培養(yǎng)過(guò)程中，產(chǎn)生尿素酶的細(xì)菌將分解尿素產(chǎn)生氨，使培養(yǎng)基的pH升高，在pH升至8.4時(shí)，指示劑就轉(zhuǎn)變?yōu)樯罘奂t色。3.尿素試驗(yàn)：第7頁(yè)/共22頁(yè)4.硫化氫試驗(yàn)：硫化氫試驗(yàn)是檢測(cè)硫化氫的產(chǎn)生，也是用于腸道細(xì)菌檢查常用生化試驗(yàn)。有些細(xì)菌能分解含硫的有機(jī)物如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等產(chǎn)生硫化氫，硫化氫一遇培養(yǎng)基中鉛鹽或鐵鹽等，就形成黑色的硫化鉛或硫化亞鐵沉淀物。第8頁(yè)/共22頁(yè)5.甲基紅試驗(yàn)：甲基紅試驗(yàn)是用來(lái)檢測(cè)葡萄糖產(chǎn)生的有機(jī)酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。當(dāng)細(xì)菌代謝糖產(chǎn)生酸時(shí)，培養(yǎng)基就會(huì)變酸，使加入培養(yǎng)基中的甲基紅指示劑由橙黃色（pH6.3）轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色（pH4.2），即甲基紅反應(yīng)。盡管所有的腸道微生物都能發(fā)酵葡糖產(chǎn)生有機(jī)酸，但這個(gè)試驗(yàn)在區(qū)分大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌上仍然是有價(jià)值的。這兩個(gè)細(xì)菌在培養(yǎng)的早期均產(chǎn)生有機(jī)酸，但大腸桿菌在培養(yǎng)后期仍能維持酸性pH4，而產(chǎn)氣腸桿菌則轉(zhuǎn)化有機(jī)酸為非酸性末端產(chǎn)物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大約6。因此大腸桿菌為陽(yáng)性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。第9頁(yè)/共22頁(yè)6.檸檬酸鹽試驗(yàn)：檸檬酸鹽試驗(yàn)是用來(lái)檢測(cè)檸檬酸是否被利用。有些細(xì)菌利用檸檬酸鹽作為碳源；而另一些細(xì)菌不能利用檸檬酸鹽，如產(chǎn)氣腸桿菌。細(xì)菌在分解檸檬酸鹽及培養(yǎng)基中的磷酸銨后，產(chǎn)生堿性化合物，使培養(yǎng)基的pH升高，當(dāng)加入1%溴麝香草酚藍(lán)指示劑時(shí)，培養(yǎng)基就會(huì)由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樯钏{(lán)色。溴麝香草酚藍(lán)指示范圍為：pH小于6.0時(shí)呈黃色，pH在6.5~7.0時(shí)為綠色，pH大于7.6時(shí)呈藍(lán)色。第10頁(yè)/共22頁(yè)三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）、淀粉水解實(shí)驗(yàn)1.將固體淀粉培養(yǎng)基熔化后冷卻至50°C左右，無(wú)菌操作制成平板。2.用記號(hào)筆在平板底部劃成4部分。3.將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別在不同的部分劃線(xiàn)接種，在平板的反面分別在4部分寫(xiě)上菌名。4.將平板倒置在37°C溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)。5.觀(guān)察各種細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，打開(kāi)平板蓋子，滴入少量盧戈氏碘液于平板中，輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使碘液均勻鋪滿(mǎn)整個(gè)平板。第11頁(yè)/共22頁(yè)

淀粉水解試驗(yàn)第12頁(yè)/共22頁(yè)(二)、明膠水解實(shí)驗(yàn)1.取3支明膠培養(yǎng)基試管，用記號(hào)筆標(biāo)明各管欲接種的菌名。2.用接種針?lè)謩e穿刺接種枯草芽孢桿菌，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。3.將接種后的試管置于20度中培養(yǎng)3~5天。4.觀(guān)察明膠液化情況。第13頁(yè)/共22頁(yè)

穿刺接種

1)手持試管。2)旋松棉塞。3)右手拿接種針在火焰上將針端灼燒滅菌接著把在穿刺中可能伸入試管的其他部位，也灼燒滅菌；4)用右手的小指和手掌邊拔出棉塞。接種針先在培養(yǎng)基部分冷卻，再用接種針的針尖沾取少量菌種。

5)將接種過(guò)的試管直立于試管架上，放在37℃或28℃恒溫箱中培養(yǎng)。24h后觀(guān)察結(jié)果注意：若具有運(yùn)動(dòng)能力的細(xì)菌，它能沿著接種線(xiàn)向外運(yùn)動(dòng)而彌散，故形成的穿刺線(xiàn)較粗而散、反之則細(xì)而密。第14頁(yè)/共22頁(yè)(三)、尿素實(shí)驗(yàn)1.取2支尿素培養(yǎng)基斜面試管，用記號(hào)筆標(biāo)明各管欲接種的菌名。2.分別接種普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌。3.將接種后的試管置于35°C中培養(yǎng)24~28小時(shí)。4.觀(guān)察培養(yǎng)基顏色變化。第15頁(yè)/共22頁(yè)（四）、硫化氫試驗(yàn)1.用接種針將大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌分別穿刺接入2支醋酸鉛培養(yǎng)基中。2.置于37度培養(yǎng)48小時(shí)后，觀(guān)察有無(wú)黑色硫化鉛的產(chǎn)生。第16頁(yè)/共22頁(yè)（五）、甲基紅試驗(yàn)

1.將上述兩菌分別接入2支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中。2.置于37度培養(yǎng)48小時(shí)后，將1支培養(yǎng)基內(nèi)加入甲基紅試劑2滴，培養(yǎng)基變?yōu)榧t色者為陽(yáng)性，變?yōu)辄S色者為陰性。第17頁(yè)/共22頁(yè)（六）、檸檬酸鹽試驗(yàn)

1.將上述兩菌分別接入2支檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基中。2.置于37度培養(yǎng)48小時(shí)后，觀(guān)察檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基上有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)和是否變色，藍(lán)色為陽(yáng)性，綠色為陰性。第18頁(yè)/共22頁(yè)問(wèn)題？第19頁(yè)/共22頁(yè)淀粉是逐級(jí)水解的,淀粉初步水解產(chǎn)物是麥芽糖,麥芽糖繼續(xù)水解則水解為葡萄糖。淀粉水解是生成葡萄糖的：(C6H10O5)n+nH2O=nC6H12O6葡萄糖（C6H12O6）是多羥基醛,可用醛的性質(zhì)進(jìn)行檢驗(yàn),如銀鏡試驗(yàn),有銀白色物質(zhì)生成；斐林實(shí)驗(yàn),有磚紅色沉淀生成.。1.不利用碘液,怎樣證明淀粉水解的存在?如果不用碘液鑒定淀粉的存在,可以使用斐林試劑來(lái)鑒定是否生成了還原性糖,麥芽糖和葡萄糖都是還原性糖,淀粉則是非還原性糖.新配的斐林試劑加入到盛有還原性糖溶液的試管中,混合均勻后,將試管在沸水浴條件下加熱1-2min,就會(huì)出現(xiàn)磚紅色沉淀.如果試管中淀粉沒(méi)有水解,因?yàn)榈矸蹫榉沁€原性糖,將斐林試劑加入后,水浴加熱不會(huì)出現(xiàn)磚紅色；如果試管中淀粉水解了,無(wú)論是初步水解還是徹底水解,都會(huì)產(chǎn)生還原性糖（麥芽糖和葡萄糖都是還原性糖）,還原性糖可以與斐林試劑反應(yīng),水浴加熱后,出現(xiàn)磚紅色沉淀.第20頁(yè)/共22頁(yè)2.為什么大腸桿菌在甲基紅反應(yīng)中為陽(yáng)性,而產(chǎn)氣腸桿菌為陰性?這個(gè)試驗(yàn)與伏—普試驗(yàn)最初底物和最終產(chǎn)物有何異同？大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌都屬于腸道微生物,所有腸道微生物都能夠利用葡萄糖作為其能量來(lái)源,但是它們的代謝途徑不同,因而所產(chǎn)生的產(chǎn)物不相同。大腸桿菌利用葡糖糖發(fā)酵,主要產(chǎn)生混合有機(jī)酸,比如乳酸,乙酸和甲酸等,使培養(yǎng)基pH下降（至4左右）；產(chǎn)氣腸桿菌利用葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵,主要產(chǎn)生乙醇,3-羥基丁醇和少量有機(jī)酸,培養(yǎng)基pH下降不很明顯（6.5左右）。甲基紅的變色范圍為pH4.2（紅）~6.3（黃）。大腸桿菌分解葡萄糖產(chǎn)生有機(jī)酸,培養(yǎng)液由原來(lái)的橘紅色變成紅色,因此反應(yīng)為陽(yáng)性；同理,產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。

V-P實(shí)驗(yàn)用于證明在糖代謝