基因工程工具酶限制酶

基因工程工具酶限制酶第1頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四第2頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四一、限制性內切酶(restrictionenzyme)1．限制性核酸內切酶的發(fā)現(xiàn)

限制性核酸內切酶，是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結構的核酸內切酶。它們主要是從原核生物中分離純化出來的。根據(jù)1994年美國出版的《分子生物學百科全書》的統(tǒng)計數(shù)字，僅Ⅱ型核酸內切限制酶一項迄今就已從各種不同的微生物當中，分離出了2300種以上，可識別230種不同的DNA序列。早在本世紀中期，以Arber等人對入噬菌體在大腸桿菌不同菌株上的平板培養(yǎng)效應的研究為基礎，發(fā)現(xiàn)了原核生物體內存在著寄生控制的限制(restriction)和修飾(modification)系統(tǒng)。第3頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四第4頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四在限制修飾系統(tǒng)中限制作用是指一定類型的細菌可以通過限制性酶的作用，破壞入侵的外源DNA(如噬菌體DNA等)，使得外源DNA對生物細胞的入侵受到限制；

而生物細胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通過修飾酶的作用：在堿基中特定的位置上發(fā)生了甲基化而得到了修飾，可免遭自身限制性酶的破壞，這就是限制修飾系統(tǒng)中修飾作用的含義。第5頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四2．核酸內切限制酶的類型

特性I型II型III型限制和修飾活性單一多功能的酶分開的核酸內切酶和甲基化酶具有一種共同亞基的雙功能的酶核酸內切限制酶的蛋白質結構3種不同的亞基單一的成份2種不同的亞基第6頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四切割位點在距寄主特異性位點至少1000bp的地方可能隨機地切割位于寄主特異性位點或其附近

距寄主特異性位點3，端24~26bp處甲基化作用的位點寄主特異性的位點寄主特異性的位點寄主特異性的位點識別未甲基化的序列進行核酸內切酶切割能能能序列特異的切割不是是是DNA克隆中的用處無用十分有用用處不大第7頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四3．核酸內切限制酶的命名法

由于發(fā)現(xiàn)了大量的限制酶，所以需要有一個統(tǒng)一的命名法。H．O．Smith和D．Nathans(1973)提議的命名系統(tǒng)，已被廣大學者所接受。他們建議的命名原則包括如下幾點：（1）用屬名的頭一個字母和種名的頭兩個字母，組成3個字母的略語表示寄主菌的物種名稱。例如，大腸桿菌(Escherichia

coli)用Eco表示，流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)用Hin表示。第8頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四（2）用一個寫在右下方的標注字母代表菌株或型，例如Ecok。（3）如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個不同的限制與修飾體系，則以羅馬數(shù)字表示。因此，流感嗜血菌Rd菌株的幾個限制與修飾體系分別表示為HindI、HindII、HindIII等等。第9頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四（4）所有的限制酶，除了總的名稱核酸內切限制酶R外，還帶有系統(tǒng)的名稱，例如核酸內切酶R．HindIII。同樣地，修飾酶則在它的系統(tǒng)名稱之前加上甲基化酶M的名稱。相應于核酸內切酶R．HindIII的流感嗜血菌Rd菌株的修飾酶，命名為甲基化酶M.HindIII。

在實際應用上，這個命名體系已經作了進一步的簡化：①由于附有標注字母在印刷上很不方便，所以現(xiàn)在通行的是把全部略語字母寫成一行。②在上下文已經交待得十分清楚只涉及限制酶的地方，核酸內切酶的名稱R便被省去。第10頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四第11頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四4.Ⅱ型核酸限制性內切酶的基本特性

它具有三個基本特性：

a.在DNA分子雙鏈的特異性識別序列部位，切割DNA分子產生鏈的斷裂；

b.2個單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對的；

c.

因此，斷裂的結果形成的DNA片段，也往往具有互補的單鏈延伸末端。第12頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四a.識別位點：

絕大多數(shù)的II型核酸內切限制酶，都能夠識別由4～8個核苷酸組成的特定的核苷酸序列。我們稱這樣的序列為核酸內切限制酶的識別序列。

切割位點的一個共同特點是，它們具有雙重旋轉對稱的結構形式，換言之，這些核苷酸對的順序是呈回文結構，例如：第13頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四

5'-CTGCAG-3,5'-CTGCAG-3,（a）PstI切割位點,

切割后形成3`—OH的單鏈粘性末端，3'-GACGTC-5，3'-G+ACGTC-5，(b)EcoRI切割位點,切割后形成5`-P的單鏈粘性末端，

5'-GAATTC-3’5'-G+AATTC-3’3'-CTTAAG-5’3'-CTTAAG-5’

（c）EcoRV切割位點,切割后形成平末端。

5'-GATATC-3’5'-GAT+ATC-3’3'-CTATAG-5’3`-CTATAG-5`第14頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四b.

切割類型：

檢驗了非常大量的實驗事例之后發(fā)現(xiàn)，由核酸內切限制酶的作用所造成的DNA分子的切割類型，通常是屬于下述兩種獨特的排列方式之一：（1）兩條鏈上的斷裂位置是交錯地、但又是對稱地圍繞著一個對稱軸排列，這種形式的斷裂結果形成具有粘性末端的DNA片段；（2）兩條鏈上的斷裂位置是處在一個對稱結構的中心，這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片段。第15頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四c.產生的末端特征：

我們所說的粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結構，它們能夠通過互補堿基間的配對而重新環(huán)化起來。

平末端的DNA片段則不易于重新環(huán)化。第16頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四(2)同裂酶(isoschizomers)

有一些來源不同的限制酶識別的是同樣的核苷酸靶序列，這類酶特稱為同裂酶(isoschizomers)。

同裂酶產生同樣的切割，形成同樣的末端。例如，限制酶HpaⅡ和MspI是一對同裂酶，共同的靶子序列是CCGG。第17頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四

與同裂酶對應的一類限制性內切酶,它們雖然來源不同，識別的靶序列也各不相同,但都能產生相同的粘性末端,特稱為同尾酶。常用的BamHI,BclI,BglI,XhoI就是一組同尾酶。它們切割DNA之后都形成由-GATC-4個核苷酸組成的粘性末端，很顯然，由同尾酶所產生的DNA片段，是能夠通過其粘性末端之間的互補作用而彼此連接起來的，因此在基因克隆實驗中很有用處。(3)同尾酶(isocaudamer)第18頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四

由一對同尾酶分別產生的粘性末端共價結合形成的位點，特稱之為“雜種位點”(hybridsite)。但必須指出，這類雜種位點的結構，一般是不再被原來的任何一種同尾酶所識別的。例如：SalI（5`-GTCGAC-3`）和XhoI(5`-CTCGAG-3`)的消化片段相連，但所形成的重組片段（5`-GTCGAG-3`）則不能被上述2種酶的任一種酶識別和切割。但也有例外。第19頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四5．影響核酸內切限制酶活性的因素(1)DNA的純度核酸內切限制酶消化DNA底物的反應效率，在很大程度上是取決于所使用的DNA本身的純度。污染在DNA制劑中的某些物質，例如蛋白質、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸(EDTA)、SDS(十二烷基硫酸鈉)、以及高濃度的鹽離子等，都有可能抑制核酸內切限制酶的活性。第20頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四為了提高核酸內切酶對低純度DNA的反應效率，一般采用如下三種方法：①增加核酸內切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高達10單位甚至更多些。②擴大酶催化反應的體積，以使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳叵♂尅＂垩娱L酶催化反應的保溫時間。在有些DNA制劑中，尤其是按微量堿法制備的，會含有少量的DNase的污染。由于DNase的活性需要有Mg2+的存在，而在DNA的貯存緩沖液中含有二價金屬離子螯合劑EDTA，因此在這種制劑中的DNA仍然是穩(wěn)定的。然而在加入了核酸內切限制酶緩沖液之后，DNA則會被DNase迅速地降解掉。要避免發(fā)生這種情況，唯一的辦法就是使用高純度的DNA。

第21頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四(2)DNA的甲基化程度

核酸內切限制酶是原核生物限制—修飾體系的組成部分，因此識別序列中特定核苷酸的甲基化作用，便會強烈地影響酶的活性。為避免產生這樣的問題，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大腸桿菌菌株制備質粒DNA。

第22頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四(3)酶切消化反應的溫度

DNA消化反應的溫度，是影響核酸內切限制酶活性的另一個重要因素。不同的核酸內切限制酶，具有不同的最適反應溫度，而且彼此之間有相當大的變動范圍。大多數(shù)核酸內切限制酶的標準反應溫度都是37℃，但也有許多例外的情況，它們要求37℃以外的其它反應溫度。其中有些核酸內切限制酶的最適反應溫度低于標準的37℃，例如SmaI是25℃、ApaI是30℃；有些核酸內切限制酶的最適反應溫度則高于標準的37℃，例如MaeI是45℃、BclI是50℃、MaelII是55℃；還有些核酸內切限制酶的最適反應溫度可高達60℃以上，消化反應的溫度低于或高于最適溫度，都會影響核酸內切限制酶的活性，甚至最終導致完全失活。第23頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四DNA的分子結構

DNA分子的不同構型對核酸內切限制酶的活性也有很大的影響。某些核酸內切限制酶切割超螺旋的質粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化線性DNA的高出許多倍，最高的可達20倍。

此外，還有一些核酸內切限制酶，切割它們自己的處于不同部位的限制位點，其效率亦有明顯的差別。據(jù)推測，這很可能是由于側翼序列的核苷酸成份的差造成的。

第24頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四

(5)核酸內切限制酶的緩沖液

核酸內切酶的標準緩沖液的組份包括：氯化鎂、氯化納或氯化鉀、Tris-HCl,?-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常發(fā)揮，是絕對地需要二價的陽離子，通常是Mg2+。對絕大多數(shù)限制酶來說，在pH=7．4的條件下，其功能最佳。

第25頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四在“非最適的”反應條件下(包括高濃度的核酸內切限制酶、高濃度的甘油、低離子強度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等等)，有些核酸內切限制酶識別序列的特異性便會發(fā)生“松動”，從其“正確”識別序列以外的其它位點切割DNA分子。

有些核酸內切限制酶的切割特異性，受所用的緩沖液成份的影響比較明顯。例如，最常用的EcoRI限制酶，在正常的情況下，是在GAATTC識別序列處發(fā)生切割作用的，但如果緩沖液中的甘油濃度超過5％(V／V)，那么其識別序列的特異性就會發(fā)生松動，可在AATT或PuPuATPyPy序列處發(fā)生切割作用。EcoRI限制酶的這種特殊的識別能力，通常叫做星號活性，以EcoRI*表示。第26頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四

6.

限制性內切酶反應的終止

消化DNA樣品后，在進一步處理DNA樣品前往往需要鈍化內切酶的活性，鈍化大多數(shù)限制性內切酶的方法是65℃溫浴5分鐘。但有些酶，如BamHI和HaeⅡ對熱穩(wěn)定，則需加入終止反應液(如加入0．5mol／L的EDTA使之在溶液中的終濃度達到10mmol/L)螯合Mg2+，以終止反應。此外，還可以用等體積的酚抽提酶解產物，提取DNA。如果用限制性內切酶消化DNA分子后，為了進行凝膠電泳分析，則可直接加入凝膠電泳加樣緩沖液，振蕩混合后，直接上樣進行凝膠電泳。第27頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四7.利用限制酶對DNA進行消化的具體步驟第28頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四限制酶消化反應的進行以下是對0．2—1．0ugDNA進行消化的典型反應步驟，如要對更大量的DNA進行消化，則反應的各個成分須相應放大。1)將DNA溶液加入一滅菌的微量離心管中并與適量水混勻，使總體積為18ul。2)加入2ul適當?shù)?0X限制酶消化緩沖液。輕敲管外壁以混勻之。3)加入1—2單位限制酶，輕彈管外壁以混勻之。

1單位酶通常定義為，在建議使用的緩沖液及溫度下，在20u1反應液中反應1小時，使lugDNA完全消化所需的酶量。第29頁，共33頁，2023年，2月20日，星期四4)將上述混合的反應物置于適當溫度并按所需的時間進行溫育。5)加入0．5mol／LEDTA(pH8．0)使終濃度達1