外源基因的表達(dá)系統(tǒng)

外源基因的表達(dá)系統(tǒng)第1頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四表達(dá)系統(tǒng)克隆的基因只有通過(guò)在宿主細(xì)胞中表達(dá)才能進(jìn)一步研究其功能和調(diào)控機(jī)理，同樣，也只有通過(guò)其表達(dá)才能獲得具有特定生物活性的目的產(chǎn)物。這種表達(dá)外源基因的宿主細(xì)胞就叫表達(dá)系統(tǒng)，它可分為原核(主要是大腸桿菌)表達(dá)系統(tǒng)和真核(酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳類動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞)表達(dá)系統(tǒng)兩類。要使克隆基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)，就要將它插入帶有基因表達(dá)所需要的各種元件的載體中，這種裁體就稱為表達(dá)載體。對(duì)不同的表達(dá)系統(tǒng)，需要構(gòu)建不同的表達(dá)載體。第2頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四基因表達(dá)遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞過(guò)程——中心法則（centraldogma）。第3頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四克隆基因的表達(dá)外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)。外源基因表達(dá)載體重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞在宿主細(xì)胞中表達(dá)出蛋白質(zhì)提取蛋白宿主細(xì)胞：原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。第4頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制1外源基因的起始轉(zhuǎn)錄

2mRNA的延伸與穩(wěn)定性

3外源基因mRNA的有效翻譯4表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性

5目的基因沉默

第5頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1外源基因的起始轉(zhuǎn)錄外源基因在宿主細(xì)胞中的有效表達(dá)是基因工程的核心問題，而外源基因的起始轉(zhuǎn)錄又是基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的限速步驟。選擇可調(diào)控的啟動(dòng)子和相關(guān)的調(diào)控序列，是構(gòu)建一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)首先要考慮的問題。一般來(lái)說(shuō)，理想的可調(diào)控的啟動(dòng)子在細(xì)胞生長(zhǎng)的初期不表達(dá)或低水平表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定的密度后，在某種特定的誘導(dǎo)因子(如溫度、光和化學(xué)藥物等)的誘導(dǎo)下，RNA聚合酶開始啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,合成

mRNA。第6頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四原核生物基因表達(dá)的啟動(dòng)子可分為:誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組成型啟動(dòng)子(前者如lactrp等的啟動(dòng)子,后者如T7噬菌體的啟動(dòng)子)。真核生物基因表達(dá)的啟動(dòng)子可分為：誘導(dǎo)型、組織特異型和組成型等類型。第7頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2mRNA的延伸與穩(wěn)定性轉(zhuǎn)錄后,保持

mRNA的有效延伸、終止及穩(wěn)定是基因有效表達(dá)的關(guān)鍵。在轉(zhuǎn)錄物內(nèi)的衰減和非特異性終止都可誘發(fā)轉(zhuǎn)錄中的mRNA提前終止。衰減子

(attenuator)類似于簡(jiǎn)單的終止子,在原核生物中一般位于操縱子的啟動(dòng)子與第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因之間。在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)要盡量避免該序列的存在。為了防止mRNA在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的非特異性終止可以在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)加入抗終止的序列元件。第8頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四另一方面，存在正常轉(zhuǎn)錄終止序列也是外源基因有效表達(dá)的重要因素，它可以防止產(chǎn)生不必要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，使mRNA的長(zhǎng)度限制在一定的范圍內(nèi)，從而增加外源基因表達(dá)的穩(wěn)定性。對(duì)于真核細(xì)胞來(lái)說(shuō)，表達(dá)載體上含有轉(zhuǎn)錄終止序列和poly(A)摻入位點(diǎn)是外源基因表達(dá)的重要條件。poiy(A)摻入的信號(hào)序列AAUAAA對(duì)mRNA3‘端的正確加工至關(guān)重要，AAUAAA位點(diǎn)的缺失甚至可以導(dǎo)致基因表達(dá)的減少。第9頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四mRNA的穩(wěn)定性直接決定翻譯產(chǎn)物的多少。對(duì)原核細(xì)胞來(lái)說(shuō),最佳的方法是選擇一個(gè)RNase缺失的受體菌。對(duì)真核細(xì)胞來(lái)說(shuō),則需要考慮增加

mRNA的正確加工

,提高成熟

mRNA的穩(wěn)定性。第10頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3外源基因mRNA的有效翻譯在原核細(xì)胞中影響翻譯起始的因素有:起始密碼子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(SD序列)、起始密碼與SD序列之間的距離和堿基組成、mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)、mRNA上游的5'端非翻譯序列和蛋白編碼區(qū)的5'端序列等。因此,外源基因mRNA有效翻譯須考慮下列基本原則:第11頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四mRNA有效翻譯須考慮的基本原則①AUG(ATG)是首選的起始密碼子。②SD序列為與核糖體16SrRNA互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，該序列至少含有AGGAGG序列中的4個(gè)堿基。③SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離為3～9個(gè)堿基。④在翻譯起始區(qū)周圍的序列不易形成明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

第12頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四對(duì)于真核細(xì)胞mRNA的5‘非翻譯區(qū)不存在SD序列，但絕大多數(shù)mRNA的起始序列都含有共同的序列5’-CCA(G)CCATGG-3‘，如果改變這一序列，可使翻譯的起始效率大大降低。此外，

在起始密碼ATG的上游區(qū)域含有另一個(gè)起始密碼而又不被隨后的一個(gè)符合閱讀框的終止密碼所終止，則該起始密碼會(huì)影響mRNA翻譯的起始。第13頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四4表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性

外源基因的表達(dá)產(chǎn)物能否在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定積累而不被內(nèi)源蛋白水解酶所水解是基因有效表達(dá)的一個(gè)重要因素。如果表達(dá)的外源蛋白具有相同或類似于宿主細(xì)胞天然蛋白的構(gòu)象

,則被降解的可能性就會(huì)大大降低。第14頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四避免外源基因表達(dá)蛋白降解①構(gòu)建融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)：在融合蛋白中外源蛋白與受體細(xì)胞蛋白能形成良好的雜合構(gòu)象，它能在較大程度上封閉外源蛋白分子上的水解酶作用位點(diǎn)，從而增加其穩(wěn)定性。②構(gòu)建分泌蛋白表達(dá)系統(tǒng)：使外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞周質(zhì)腔或直接分泌到培養(yǎng)基中，避免細(xì)胞內(nèi)的水解酶對(duì)表達(dá)蛋白的降解。③構(gòu)建包涵體表達(dá)系統(tǒng)：外源基因的表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在于受體細(xì)胞中不易被宿主蛋白水解酶所降解。④選擇蛋白水解酶基因缺陷型的受體系統(tǒng)。第15頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

5目的基因沉默基因沉默(genesilencing)是導(dǎo)致外源基因不能正常表達(dá)的重要因素。其作用機(jī)制主要有三種：位置效應(yīng)的基因沉默、轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默和轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。基因沉默現(xiàn)象主要表現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中。第16頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四5.1位置效應(yīng)是指基因在基因組中的位置對(duì)其表達(dá)的影響。在植物和動(dòng)物轉(zhuǎn)基因中，外源基因進(jìn)入細(xì)胞核中并整合到染色體DNA上，其整合的位點(diǎn)與基因的表達(dá)密切相關(guān)。如果外源基因整合到甲基化程度高、轉(zhuǎn)錄活性低的異染色質(zhì)上,一般不能表達(dá);第17頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四5.2轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默是在DNA水平上的基因調(diào)控，主要是由于啟動(dòng)子的甲基化或外源基因的異染色質(zhì)化而引起的。重復(fù)序列可導(dǎo)致自身甲基化，外源基因若以多拷貝的形式整合到同一位點(diǎn)上，形成首尾相接的正向重復(fù)(directrepeat)或頭對(duì)頭、尾對(duì)尾的反向重復(fù)(invertrepeat)序列，則外源基因不能表達(dá)，并且拷貝數(shù)越多，基因沉默現(xiàn)象越嚴(yán)重。其原因可能是由于重復(fù)序列自發(fā)配對(duì)，甲基化酶特異性地識(shí)別這種配對(duì)結(jié)構(gòu)而使其甲基化，從而抑制其表達(dá)。

第18頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四5.3轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默是在RNA水平上的基因調(diào)控，比轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默更普遍。共抑制(cosuppression)是轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默的一種，指被整合的外源基因沉默的同時(shí)，與其同源的內(nèi)源DNA的表達(dá)也受到抑制。轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默的特點(diǎn)是外源基因能夠轉(zhuǎn)錄成mRNA，但正常的mRNA不能積累，mRNA合成后就被降解或被相應(yīng)的反義RNA或蛋白質(zhì)封閉，因而不能指導(dǎo)mRNA的翻譯。第19頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)外源基因表達(dá)系統(tǒng)1概述2原核基因表達(dá)系統(tǒng)3真核基因表達(dá)系統(tǒng)第20頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1概述外源基因表達(dá)系統(tǒng)由基因表達(dá)載體和相應(yīng)的受體細(xì)胞兩部分組成?；虮磉_(dá)系統(tǒng)有原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)和真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)。目前應(yīng)用最廣泛的是原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)，如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、芽子包桿菌表達(dá)系統(tǒng)、鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)和藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)等。第21頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2原核基因表達(dá)系統(tǒng)2.1原核生物作為基因表達(dá)系統(tǒng)的受體細(xì)胞具有如下特點(diǎn):①原核生物大多數(shù)為單細(xì)胞異養(yǎng)，生長(zhǎng)快，代謝易于控制，可通過(guò)發(fā)酵迅速獲得大量基因表達(dá)產(chǎn)物。②基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，便于基因操作和分析。③多數(shù)原核生物細(xì)胞內(nèi)含有質(zhì)?；蚴梢痼w，便于構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體。④生理代謝途徑及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較清楚。⑤不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物無(wú)特定的空間構(gòu)象。⑥內(nèi)源蛋白酶會(huì)降解表達(dá)的外源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定性。第22頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.2大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)2.2.1正確表達(dá)的基本條件基因在大腸桿菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)正確有效表達(dá)的基本條件是必須能夠正常地轉(zhuǎn)錄和翻譯，在許多情況下還需進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后加工以及在細(xì)胞中正確定位，這些過(guò)程中的任何一步發(fā)生差錯(cuò)，都會(huì)導(dǎo)致該基因表達(dá)的失敗。所以必須考慮表達(dá)載體、外源基因的性質(zhì)、原核細(xì)胞的啟動(dòng)子和SD序列、開放讀碼框架(openreadingframe，ORF)及宿主菌調(diào)控系統(tǒng)等基本條件，第23頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四正確表達(dá)的基本條件①外源基因不能帶有間隔序列(內(nèi)含子)；②必須利用原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動(dòng)子和SD序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達(dá)；③外源基因與表達(dá)載體連接后，必須形成正確的開放閱讀框架；④通過(guò)表達(dá)載體將外源基因?qū)胨拗骶?，并指?dǎo)宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白；⑤利用宿主菌的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)，防止外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主菌的毒害。第24頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.2.2大腸桿菌基因表達(dá)載體

大腸桿菌基因表達(dá)載體的構(gòu)建，應(yīng)包括這些基因元件：復(fù)制子、啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、終止子、密碼子、選擇標(biāo)記等。第25頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（1）復(fù)制子復(fù)制子：復(fù)制子是一段包含復(fù)制子起始位點(diǎn)和反式因子作用區(qū)在內(nèi)的DNA片段。大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體一般是質(zhì)粒表達(dá)載體，

含有大腸桿菌內(nèi)源質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)和有關(guān)序列組成的能在大腸桿菌中有效復(fù)制的復(fù)制子。

在同一大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，含同一類型復(fù)制子的不同質(zhì)粒載體不能共存，但含不同類型復(fù)制子的不同質(zhì)粒載體則可以共存于同一細(xì)胞中。第26頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（2）啟動(dòng)子啟動(dòng)子與

mRNA的合成有很大關(guān)系。在大腸桿菌細(xì)胞中大多數(shù)基因的啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間的距離為6～9bp,但啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的最佳距離還有待實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。第27頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四是DNA上的能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。

大腸桿菌的所有啟動(dòng)子中都有兩段一致順序（consensussequence）。

啟動(dòng)子-35Box和

-10Box

啟動(dòng)子序列

第28頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四consensussequences第29頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四5’-TTGACA-3’

5’-TATAAT-3’

②-10box（PribnowBox）TTGACA

TATAAT

轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)17bp5’

核糖體結(jié)合位點(diǎn)RNA聚合酶

亞基的識(shí)別位點(diǎn)

。①-35box第30頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四原核啟動(dòng)子共有序列的功能第31頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四①核糖體結(jié)合位點(diǎn)（

RBS）1）Shine-Dalgarno（SD）

sequence：mRNA上與核糖體16sRNA結(jié)合的序列。ribosomebindingsiteSDmRNA5’—AGGAGGU——AUG——

16SrRNA3’

UCCUCCAS-D序列距離AUG的距離也影響翻譯（3）翻譯的起始位點(diǎn)第32頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四AUG（91%）GUG（8%）UUG（1%）位于SD序列下游2）起始密碼：第33頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四E.coli中促使轉(zhuǎn)錄終止的DNA位置有一段反向回文順序，其后緊接一串A，稱為內(nèi)終止子，形成終止信號(hào)。終止子對(duì)外源基因的表達(dá)同樣起著非常重要的作用,它能有效控制目的基因mRNA的長(zhǎng)度,提高mRNA的穩(wěn)定性,避免質(zhì)粒上其他基因的異常表達(dá)。

內(nèi)終止子intrinsicterminator：?jiǎn)?dòng)子操縱子S-D序列目的基因終止子（4）轉(zhuǎn)錄終止子第34頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四由于莖環(huán)3’段緊接一串A/U的配對(duì)，穩(wěn)定性比較差，有利于轉(zhuǎn)錄物脫落而不利于轉(zhuǎn)錄延續(xù)。

原因：反向回文順序被轉(zhuǎn)錄后，立即形成一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄物與模板之間配對(duì)的堿基數(shù)降低，整個(gè)減弱了RNA與DNA的互作①莖環(huán)結(jié)構(gòu)②多聚A/U第35頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAACTTCTTTCT-33-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板)轉(zhuǎn)錄↓5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折疊↓mRNA折疊

UCC

UGG—CA—UC—GC—GG—CC—GC—GG—CAA

CCCACUUUU—3

DNARNA聚合酶脫落第36頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第37頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.2.3

宿主菌◆

大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng)的基因一般都是異源基因，某些甚至是真核生物基因，而在細(xì)胞內(nèi)積累大量的異源蛋白極易被降解。造成重組異源蛋白在大腸桿菌中不穩(wěn)定的原因包括：◆大腸桿菌缺乏復(fù)雜翻譯后加工和蛋白質(zhì)折疊系統(tǒng)?！舸竽c桿菌不具備類似真核細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定因子?！舸罅康漠愒粗亟M蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中形成高濃度微環(huán)境，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子之間的作用增強(qiáng)。

第38頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四為了使外源基因高效表達(dá)，必須構(gòu)建作為基因表達(dá)受體菌的大腸桿菌工程菌株。

第39頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.2.4常見的大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng)目前較為廣泛應(yīng)用的表達(dá)系統(tǒng)包括以下幾種：Lac和Tac表達(dá)系統(tǒng)、PL和PR表達(dá)系統(tǒng)、T7表達(dá)系統(tǒng)等。第40頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.2.5.1.細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)（1）包涵體（inclusionbody）是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種不溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。形成原理未知2.2.5外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位第41頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人生長(zhǎng)激素（humangrowthhormone,hGH）。例：使重組蛋白易于分離、免受蛋白酶降解、不損害寄主細(xì)胞回收的蛋白生物活性差。②缺點(diǎn)①優(yōu)點(diǎn)第42頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第43頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第44頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（1）周質(zhì)（periplasm）格蘭氏陰性大腸桿菌位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)的復(fù)雜機(jī)理目前不完全清楚優(yōu)點(diǎn)：容易被濃縮和純化、有利于正確折疊、被降解的少。2.2.5.2.周質(zhì)中表達(dá)第45頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、β-內(nèi)酰胺酶（lactamase）、腸毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等

（3）常用的原核信號(hào)肽①大腸桿菌的信號(hào)肽：能帶領(lǐng)蛋白穿過(guò)膜到達(dá)周質(zhì)。但以后需要正確切割掉。（2）信號(hào)肽（signalpeptide）一般位于N端。第46頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四鼠源RNase、人生長(zhǎng)激素信號(hào)肽。也能在細(xì)菌中起作用。（2）真核信號(hào)肽④胡蘿卜歐氏桿菌的PelB蛋白。②金黃色葡萄球菌的蛋白A。③枯草芽孢桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶

（endoglucanase）。第47頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四由于需要穿過(guò)兩層膜，大腸桿菌只能分泌極少的蛋白質(zhì)到培養(yǎng)基中，效果都不太理想。用溶血素（hemolysin）基因構(gòu)建分泌性融合蛋白；使在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中?；蚺c細(xì)菌素釋放蛋白（bacteriocinreleaseprotein)共表達(dá)。2.2.5.3.胞外表達(dá)第48頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第49頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四5’-TTGACA-3’

5’-TATAAT-3’

①-35box②-10box（PribnowBox）2.2.6.1.啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響RNA聚合酶

σ亞基的識(shí)別位點(diǎn)（1）一致順序2.2.6影響外源基因表達(dá)效率的因素第50頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（2）-35區(qū)與-10區(qū)之間的距離間隔為17bp時(shí)，啟動(dòng)子最強(qiáng)。（3）

-35區(qū)和-10區(qū)的堿基順序越接近一致順序，啟動(dòng)子越強(qiáng)。5’-TTGACA

TATAAT

一致順序lactrpPL

recAtacItacII5’-TTTACA

TATGTT

5’-TTGACA

TTAACT

5’-TTGACA

GATACT

5’-TTGATA

TATAAT

5’-TTGACA

TATAAT

5’-TTGACA

TTTAAT

-35box-10box第51頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四5’-AGGAGGU-3’

S-D序列后面的4個(gè)堿基：如果是A（T）,翻譯效率最高；

如果是G（C）,效率只有50%或25%。（1）S-D序列？？？？2.2.6.2轉(zhuǎn)譯起始序列對(duì)表達(dá)效率的影響第52頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四AUG左側(cè)的三個(gè)堿基也有影響。（2）起始密碼AUG-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左側(cè)如果是UAU或CUU時(shí)，最為有效；如果是UUC、UCA或AGG時(shí)下降20倍。第53頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.2.6.3.啟動(dòng)子與外源基因之間的距離第54頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在保證載體不會(huì)轉(zhuǎn)錄非必須基因，不必浪費(fèi)源量和能量、不會(huì)干擾正常的表達(dá)。增加載體的拷貝數(shù)會(huì)增加轉(zhuǎn)錄出的mRNA數(shù)目。增加表達(dá)效率。2.2.6.5載體拷貝數(shù)及穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響2.2.6.6.外源蛋白在菌體中的穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響但過(guò)度的外源基因的表達(dá)會(huì)影響宿主的正常生長(zhǎng)。2.2.6.4.轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對(duì)表達(dá)效率的影響第55頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.2.7.1選擇強(qiáng)啟動(dòng)子序列，如tac

等2.2.7.2調(diào)整S-D序列與AUG堿的距離距離過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都影響真核基因的表達(dá)。根據(jù)不同的啟動(dòng)子選擇不同的距離。2.2.7.3改變起始密碼下面的幾組密碼子一般為5-9bp。能提高翻譯的起始效率。2.2.7提高表達(dá)水平常用的方法第56頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四在外源基因的下游插入“重復(fù)性基因外回文序列”能防止mRNA受到3’5’外切酶的攻擊。2.2.7.5.減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷合理地調(diào)節(jié)代謝負(fù)荷與外源基因高效表達(dá)的關(guān)系。將宿主生長(zhǎng)代謝與外源基因表達(dá)分開。（1）誘導(dǎo)表達(dá)

一般采用溫度誘導(dǎo)或藥物誘導(dǎo)。2.2.7.4.增加mRNA的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性第57頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四cI857阻遏物有活性，抑制PL啟動(dòng)子，外源基因不表達(dá)，宿主大量生長(zhǎng)。32°C:42°C:cI857阻遏物失活，PL啟動(dòng)子啟動(dòng)，外源基因高水平表達(dá)，宿主生長(zhǎng)受到限制。cI857PL外源基因POPL啟動(dòng)子是溫度誘導(dǎo)型第58頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四調(diào)節(jié)基因lacI（位于宿主基因組內(nèi)或載體上）始終產(chǎn)生阻遏物。無(wú)IPTG:阻遏物與lac操縱基因結(jié)合，抑制外源基因轉(zhuǎn)錄。宿主大量生長(zhǎng)。有IPTG:阻遏物與IPTG結(jié)合，lac操縱基因解放，外源基因大量轉(zhuǎn)錄。宿主生長(zhǎng)受抑制。tac啟動(dòng)子是藥物誘導(dǎo)型第59頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（2）表達(dá)載體誘導(dǎo)復(fù)制

將宿主的生長(zhǎng)與載體的復(fù)制分開。當(dāng)宿主大量生長(zhǎng)后，再誘導(dǎo)載體制粒的復(fù)制，增加拷貝數(shù)。當(dāng)需要宿主大量生長(zhǎng)時(shí)，抑制載體質(zhì)粒的復(fù)制。第60頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四N末端：由原核基因編碼一段多肽，C末端：是完整的真核外源基因。（1）設(shè)計(jì)成融合蛋白

這是避免被降解的最好措施。質(zhì)?；虍a(chǎn)物目的基因產(chǎn)物NC切割防止被宿主的酶降解。2.2.7.6.提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性第61頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Z系列載體：ZUV5載體:lacZGAATTCCTTAAG外源基因Z2載體:lacZGGGAATTCCCCTTAAG外源基因Z3載體:lacZGGAATTCCCTTAAG外源基因提供三種融合插入閱讀框。第62頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四①使用次黃嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，減少宿主菌的蛋白酶合成。②大腸桿菌的htpR基因突變也減少蛋白酶的降解作用。③T4噬菌體的pin基因產(chǎn)物能抑制細(xì)菌的蛋白酶。可把pin增加到載體上。（2）

使用突變菌株，保護(hù)外源蛋白不被降解

減少宿主菌本身的蛋白酶的表達(dá)。第63頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（3）表達(dá)分泌蛋白

細(xì)胞質(zhì)外膜內(nèi)膜周間質(zhì)質(zhì)粒染色體“外排”：

蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過(guò)內(nèi)外膜到培養(yǎng)液中。“分泌”：

蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過(guò)內(nèi)膜到周間質(zhì)中。第64頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四細(xì)菌蛋白分泌的條件：位于N端，一般為15-30aa。真核與原核的結(jié)構(gòu)相似,功能相似，可以互換。

堿性氨基酸N疏水氨基酸核心區(qū)切割位點(diǎn)Arg、LysLeu、IleAlaGlySer信號(hào)肽酶外源蛋白

①有信號(hào)肽。第65頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四③細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。真核細(xì)胞中的分泌蛋白能在大腸桿菌中很好地分泌表達(dá)；但非分泌蛋白很難在大腸桿菌中分泌。信號(hào)肽酶I、信號(hào)肽酶II等近20多種蛋白質(zhì)的參與。②蛋白質(zhì)內(nèi)有與分泌相關(guān)的aa

序列。

為蛋白指明目的地。第66頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3真核基因表達(dá)系統(tǒng)3.1酵母表達(dá)系統(tǒng)3.2植物表達(dá)系統(tǒng)3.3動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)真核或病毒啟動(dòng)子MCSPolyA信號(hào)終止子外源基因第67頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因具有下列特點(diǎn)①真核細(xì)胞可識(shí)別并切除外源基因的內(nèi)含子，從而成功表達(dá)目的多肽，所以不必像原核細(xì)胞表達(dá)體系那樣必須從mRNA制備cDNA；②真核基因在真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，其S—D序列與細(xì)胞核糖體RNA(rRNA)16S亞基37末端的互補(bǔ)程度較高，對(duì)翻譯水平的調(diào)節(jié)有利；③在真核細(xì)胞內(nèi)，由外源基因表達(dá)的蛋白可被糖基化，成為糖蛋白，有利于保持或提高免疫原性；第68頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四④外源基因?qū)苏婧思?xì)胞的效率較低，其在染色體DNA上的整合是隨機(jī)的和自發(fā)的，目前還無(wú)法控制整合的位置和適當(dāng)?shù)目截悢?shù)；⑤真核細(xì)胞的培養(yǎng)要求較高，大量生產(chǎn)比較困難，成本也高。第69頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3.1酵母表達(dá)系統(tǒng)第70頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四①能在E.coli中克隆和擴(kuò)增。1.酵母克隆載體一、在酵母中表達(dá)Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;④

有合適的克隆位點(diǎn)。③

有酵母的選擇標(biāo)記Ori

②有大腸桿菌的選擇標(biāo)記Ampr、Tetr。第71頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四DividingSaccharomycescerevisiae(baker’syeast)cells第72頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的DNA片斷（選擇標(biāo)記）構(gòu)成。ColE1酵母Leu2+如

PYeleu10:（1）整合型載體(YIp)第73頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四①轉(zhuǎn)化率低（1-10轉(zhuǎn)化子/微克DNA）。特點(diǎn)：載體上只有細(xì)菌的復(fù)制區(qū)，沒有酵母的自主復(fù)制區(qū)?？膳c受體細(xì)胞的染色體DNA同源重組，隨染色體一起復(fù)制。②不能在酵母細(xì)胞中自主復(fù)制③整合到酵母的染色體上④不能從酵母細(xì)胞中提取載體。第74頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的DNA片斷(選擇標(biāo)記和酵母DNA自主復(fù)制順序ARS）構(gòu)成。大腸桿菌質(zhì)粒酵母ARS

（2）復(fù)制型載體(YRp)酵母選擇標(biāo)記

第75頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ARSARS（automouslyreplicatingsequence）:ATTTTATATTTATGT250bp保守區(qū)第76頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四特點(diǎn)：①轉(zhuǎn)化率高（102-103轉(zhuǎn)化子/微克DNA)。④不穩(wěn)定，容易丟失。②可從大腸桿菌和酵母中提取質(zhì)粒。既能在大腸桿菌中復(fù)制，又能在酵母細(xì)胞中自主復(fù)制。③穿梭載體（shuttlevector）第77頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四在YRp質(zhì)粒中插入酵母染色體的著絲粒區(qū)。特點(diǎn)：YRp質(zhì)粒酵母著絲粒（3）著絲粒質(zhì)粒(YCp)③不易從細(xì)胞中提取。①行為像染色體，能穩(wěn)定遺傳。②單拷貝存在。第78頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四由大腸桿菌質(zhì)粒、2m質(zhì)粒及酵母染色體DNA選擇標(biāo)記構(gòu)成。大腸桿菌質(zhì)粒酵母選擇標(biāo)記

2m質(zhì)粒如pYF92:pBR3222m酵母his3+（4）附加體型載體(YEp)第79頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2m質(zhì)粒：釀酒酵母的內(nèi)源質(zhì)粒，長(zhǎng)度是2m。含有自主復(fù)制起始區(qū)ori和STB序列（使質(zhì)粒在供體中維持穩(wěn)定）。第80頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四特點(diǎn)：①很高的轉(zhuǎn)化活性（103-105轉(zhuǎn)化子/微克DNA）.②拷貝數(shù)多（25-100分子/細(xì)胞）。③比YRp穩(wěn)定。第81頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四YEp24第82頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Leu-

酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2、PEG整合到染色體上，或獨(dú)立在酵母細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化Leu營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子克隆生長(zhǎng)酵母載體大腸桿菌提取插入外源基因鑒定克隆發(fā)酵表達(dá)外源基因產(chǎn)物分離、純化2.酵母轉(zhuǎn)化和表達(dá)的一般過(guò)程

第83頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（1）優(yōu)點(diǎn)①對(duì)其遺傳學(xué)和生理學(xué)的研究比較深入。②小量培養(yǎng)和大規(guī)模反應(yīng)器中都能生長(zhǎng)。③已經(jīng)分離出很強(qiáng)的啟動(dòng)子。④有翻譯后的加工。⑤本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的純

化。⑥安全性高（FDA確認(rèn)的安全生物），不

需要宿主的安全性檢驗(yàn)。3.酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)

第84頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四②常常發(fā)生質(zhì)粒丟失。③重組蛋白常常超糖基化①表達(dá)量普遍低。（2）缺點(diǎn)每個(gè)N-寡糖鏈上含有100多個(gè)甘露糖，④分泌困難。正常的高甘露糖寡糖鏈上僅有8-13個(gè)甘露糖。分泌型蛋白有時(shí)會(huì)留在壁膜間隙，第85頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四診斷試劑丙肝病毒蛋白HIV-1抗原種類名稱疫苗乙肝病毒表面抗原瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白HIV-1外殼蛋白4.在啤酒酵母中表達(dá)的重組蛋白第86頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四人類治療用蛋白藥物上皮生長(zhǎng)因子胰島素類胰島素生長(zhǎng)因子血小板源生長(zhǎng)因子胰島素前體成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子集落刺激因子1抗胰蛋白酶凝血因子VIIIa24第87頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（1）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)例：人Cu/Zn-SOD在酵母中表達(dá)：5.在啤酒酵母中表達(dá)外源蛋白的方式超氧化物H+H2O2H2O過(guò)氧化物酶表達(dá)出的SOD修飾正確：起始氨基酸被切掉，第二個(gè)氨基酸丙氨酸也被乙?；OD(超氧化物歧化酶)第88頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四宿主：亮氨酸合成缺陷型酵母。GAPD：甘油醛磷酸脫氫酶第89頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（2）表達(dá)分泌型蛋白在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白質(zhì)才能被糖基化。需要糖基化的重組蛋白必須是分泌蛋白。方法：構(gòu)建載體在重組蛋白的前面加一段編碼酵母菌交配類型因子a1的前導(dǎo)肽，與重組蛋白的N端通過(guò)Lys-Arg相連。前導(dǎo)肽（leaderpeptide）：第90頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四蛋白質(zhì)分泌到壁膜間隙時(shí)，酵母菌的內(nèi)切蛋白酶識(shí)別這個(gè)切點(diǎn)信號(hào)，把重組蛋白正確切下來(lái)。信號(hào)肽的切割：前導(dǎo)肽Lys-Arg重組蛋白（水蛭素）內(nèi)切蛋白酶第91頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四6.其它酵母表達(dá)系統(tǒng)（1）乙肝表面抗原在嗜甲烷酵母中表達(dá)在大型發(fā)酵反應(yīng)器中容易生長(zhǎng)；以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。有甲醇時(shí)，表達(dá)的乙醇氧化酶高達(dá)胞內(nèi)總蛋白的40%?、偈燃淄榻湍福≒ichiapastoris）的特點(diǎn)第92頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四HBsAg:乙肝表面抗原?？梢宰鳛橐呙?。Aox1：乙醇氧化酶基因1啟動(dòng)子（受甲醇激活調(diào)控）。His4：組氨酸合成所需的組氨酸脫氫酶基因。3’-aox1：整合到特定染色體的位點(diǎn)序列。②表達(dá)載體構(gòu)建（整合型）：誘導(dǎo)物：甲醇。產(chǎn)量：9×106劑疫苗/240L發(fā)酵罐。第93頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四整合到染色體中第94頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四三、外源基因在植物中表達(dá)根瘤存在于能引起植物形成冠癭瘤的土壤農(nóng)桿菌中，誘導(dǎo)冠癭瘤形成，又稱腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒（tumorinducingplasmid）。1.Ti質(zhì)粒:第95頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Tiplasmid第96頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四環(huán)狀雙鏈DNA，1.5×105-2.0×105bp（185kb）(相當(dāng)于細(xì)菌染色體的3%-5%）。（1）Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)第97頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

轉(zhuǎn)移DNA，編碼冠癭堿的合成，能隨機(jī)整合到植物的染色體上。長(zhǎng)度一般為12-24kb，是Ti質(zhì)粒最重要的部分。左邊界右邊界生長(zhǎng)素基因細(xì)胞分裂素基因冠癭堿合成①T-DNA（transfer-DNA）生長(zhǎng)素基因:iaaM（tms1）和iaaH（tms2）編碼合成吲哚乙酸（植物生長(zhǎng)激素）的酶iaaM:色氨酸-2-單加氧酶第98頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四色氨酸-2-單加氧酶色氨酸吲哚-3-乙酰胺iaaH:吲哚-3-乙酰胺水解酶吲哚-3-乙酰胺水解酶吲哚-3-乙酰胺吲哚乙酸細(xì)胞分裂素基因tmr（ipt）：異戊烯轉(zhuǎn)移酶,催化：二磷酸異戊烯（IPP）異戊烯酰嘌呤單磷酸（IPA）5’-AMP第99頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四章魚堿（octopine)胭脂堿（nopaline）NH-(CH2)3-CH-COOHNHCH3-CH-COOHHN=CNH2NH-(CH2)3-CH-COOHNHHOOC-(CH2)2-CH-COOHHN=CNH2Arg與丙酮酸縮合成Arg與酮戊二醛縮合成冠癭堿（opine）的類型和化學(xué)結(jié)構(gòu)第100頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四農(nóng)桿堿（agropine）冠癭堿（opine）的作用冠癭堿是在冠癭瘤內(nèi)合成并分泌出來(lái)的，是農(nóng)桿菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠癭堿。Glu的二環(huán)糖衍生物。第101頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四②毒性基因（vir）決定土壤農(nóng)桿菌對(duì)植物的感染和T-DNA的轉(zhuǎn)移，

進(jìn)入和整合。vir的產(chǎn)物能誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒產(chǎn)生T-DNA區(qū)域的單鏈拷貝。單鏈拷貝從Ti質(zhì)粒脫離后，可與vir的產(chǎn)物VIRD2蛋白結(jié)合，并在VIRD4和VIRB蛋白的幫助下穿過(guò)濃桿菌內(nèi)膜、外膜、壁和植物細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及核膜，最后整合到植物染色體上。單鏈的5’端是右邊界區(qū)域，含有25bp重復(fù)序列，參與整合。第102頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四章魚堿代謝基因和胭脂堿代謝基因：

④不相容性基因控制Ti質(zhì)粒的不相容性。③冠癭堿代謝基因分別編碼代謝這兩種冠癭堿的酶。維持農(nóng)桿菌生長(zhǎng)。第103頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（1）第一步:植物受傷植物受傷后能分泌酚類化合物（如乙酰丁香酮、羥基乙酰丁香酮），誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒上的毒性基因表達(dá)。2.農(nóng)桿菌的感染和生存第104頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（1）第二步

感染植物（3）第三步

毒性基因（vir）表達(dá)T-DNA上的產(chǎn)物催化產(chǎn)生過(guò)量的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，形成植物冠癭瘤。膿桿菌吸附于植物的表面?zhèn)诓课唬ǔＴ谇o的基部）。virA、virG、virD、virB（4）第四步

T-DNA轉(zhuǎn)移T-DNA被vir基因產(chǎn)物切下來(lái)，并運(yùn)送到植物細(xì)胞核里，整合到植物基因組中。（5）第五步

誘導(dǎo)冠癭瘤第105頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第106頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（6）第六步

土壤農(nóng)桿菌代謝冠癭堿。第107頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3.Ti質(zhì)粒的種類根據(jù)所編碼的冠癭堿（opine），分為（1）章魚堿（octopine)型質(zhì)粒第108頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（3）農(nóng)桿堿（agropine）型質(zhì)粒（2）胭脂堿（nopaline）型質(zhì)粒第109頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四裸子植物、雙子葉被子植物、禾谷類單子葉植物（玉米）。（1）能夠自發(fā)地整合到植物的染色體上。（2）能轉(zhuǎn)化多種植物。（3）強(qiáng)啟動(dòng)子4.Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的對(duì)象5.Ti質(zhì)粒作為載體的可能性T-DNA的opine合成酶基因上有一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，能啟動(dòng)外源基因的表達(dá)。25第110頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（1）分子量太大（200kb）?。?）限制性酶切位點(diǎn)太多。（3）被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞成為腫瘤，不能

再分化。（4）在大腸桿菌中不能復(fù)制。6.天然Ti質(zhì)粒作載體的缺點(diǎn)第111頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（4）冠癭堿合成對(duì)于植物無(wú)意義。應(yīng)剔除掉。（5）加入大腸桿菌的ori和選擇標(biāo)記。（6）加上真核生物的轉(zhuǎn)錄信號(hào)和結(jié)束信號(hào)以

及添加polyA的信號(hào)序列。（1）保留T-DNA的轉(zhuǎn)移功能部分（vir基因，

左右邊界）。（2）減少限制性酶切位點(diǎn)，引入單一插入位

點(diǎn)。（3）取消T-DNA的致瘤基因，使被轉(zhuǎn)化的植

物細(xì)胞不再成為腫瘤，能正常分化。7.Ti質(zhì)粒的改造第112頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四改造后的Ti質(zhì)粒載體模式leftrightMCSAMProriVirselect第113頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四8.Ti載體的類型（1）共整合載體（cointegratevectors）最早獲得廣泛應(yīng)用的Ti質(zhì)粒是比利時(shí)科學(xué)家P.Zambrisky等1983年改造的pGV3850需要同源重組才能插入外源基因。①pGV3850的特點(diǎn)：是一種受體質(zhì)粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于pBR322質(zhì)粒作為中間載體。第114頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第115頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四宿主土壤農(nóng)桿菌的選擇標(biāo)記是位于中間載體pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基因。位于T-DNA右半部分的胭脂堿合成酶基因（nos）。1）膿桿菌選擇標(biāo)記2）最終受體植物的選擇標(biāo)記②選擇標(biāo)記卡那霉素抗性（

Kanr

）基因（卡那霉素對(duì)植物有劇毒！）第116頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四③外源基因插入pGV3850的過(guò)程第117頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四外源基因KanrpBR322土壤農(nóng)桿菌含pGV3850植物組織卡那霉素篩選胭脂堿篩選抗卡那霉素的土壤農(nóng)桿菌外源基因表達(dá)鑒定轉(zhuǎn)化插入感染pBR322與pGV3850重組整合到染色體上pBR322不能在土壤農(nóng)桿菌中復(fù)制，只能同pGV3850重組。只有這樣，土壤農(nóng)桿菌才能得到抗卡那霉素性狀。第118頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)化后可誘導(dǎo)愈傷組織分化成轉(zhuǎn)基因植物第119頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（2）雙元載體（binaryvectors）既有大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)也有農(nóng)桿菌復(fù)制起點(diǎn)，是個(gè)穿梭載體。Ti質(zhì)粒被剔除了T-DNA、冠癭堿代謝基因、vir基因。大幅度減小質(zhì)粒的體積。（<10kb）①雙元載體的結(jié)構(gòu)Ti的精髓：Vir基因（轉(zhuǎn)移）和左右界（整合）第120頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第121頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四②雙元載體的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌之前，所有的克隆步驟都在大腸桿菌里操作。受體農(nóng)桿菌內(nèi)要求帶有整套vir基因（但缺失T-DNA及左右邊界）的“幫助質(zhì)?！碧峁﹙ir產(chǎn)物。1）基因插入2）幫助質(zhì)粒（

helperplasmid）Vir產(chǎn)物使雙元載體上的T-DNA左右邊界及其外源基因轉(zhuǎn)入到植物細(xì)胞，并整合到植物染色體上。第122頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四左右外源基因雙元載體Vir幫助質(zhì)粒農(nóng)桿菌Vir農(nóng)桿菌左右外源基因感染植物轉(zhuǎn)化左右外源基因進(jìn)入植物細(xì)胞核，整合，表達(dá)E.coli第123頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（3）三親融合法(triparentalmatig)含雙元載體的大腸桿菌：含有外源基因和左右邊界。含有幫助質(zhì)粒的輔助細(xì)菌：含vir基因。受體農(nóng)桿菌（空）：三種菌混合培養(yǎng)，然后通過(guò)各自的抗菌素抗性標(biāo)記選擇吸收了外源基因、左右界、和Vir的農(nóng)桿菌。三親第124頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四四、在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)1.動(dòng)物細(xì)胞基因克隆和表達(dá)載體---SV40病毒常用的SV40載體，是從猿猴空泡病毒SV40（simianvacuolatingvirus40）改造而來(lái)的。第125頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四①20面體外殼：由VP1、VP2和VP3三種病毒外殼蛋白構(gòu)成。5243bp的環(huán)狀雙鏈。②

DNA：（1）

SV40病毒的結(jié)構(gòu)第126頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四SV40猿猴細(xì)胞細(xì)胞裂解釋放SV40嚙齒類細(xì)胞細(xì)胞癌變SV40DNA整合到寄主染色體上permissivenonpermissive（2）SV40感染和生存方式第127頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四T-抗原（tumorantigen）:兩個(gè)6聚體的T抗原結(jié)合在SV40DNA的復(fù)制起始點(diǎn)上，分別向相反方向移動(dòng)，將雙鏈DNA解螺旋。隨后單鏈DNA結(jié)合蛋白（ssB）與解開的單鏈DNA結(jié)合維持解旋狀態(tài)。(3)SV40DNA的復(fù)制①解鏈SV40編碼的蛋白。功能是在SV40DNA復(fù)制的時(shí)候解開DNA雙鏈。第128頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第129頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第130頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四T抗原SV40DNA雙鏈第131頁(yè)，共148頁(yè)，2023年，2月20日，星期四②SV40復(fù)制起始位點(diǎn)5’-CTCACTACTTCTGGAATAGC3’-GAGT