藥學(xué)5.核酸分子雜交技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)第一節(jié)

核酸分子雜交的基本原理原理：堿基互補(bǔ)配對(duì)原則

一、核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)

來源不同的兩條單鏈核酸分子通過堿基互補(bǔ)形成異源雙螺旋分子，稱為核酸分子雜交。雜交可分成：DNA/DNA、RNA/RNA、DNA/RNA之間的雜交。復(fù)性RNADNA待測(cè)核酸序列探針(probe)：已知核酸序列二、DNA的變性(denaturation)

定義：在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。方法：過量酸、堿、加熱、變性試劑如尿素、甲酰胺以及某些有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等。

變性后其它理化性質(zhì)變化：OD260增高 粘度下降比旋度下降 浮力密度升高酸堿滴定曲線改變 生物活性喪失DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂

例：變性引起紫外吸收值的改變DNA的紫外吸收光譜增色效應(yīng)：DNA變性時(shí)其溶液OD260增高的現(xiàn)象。熱變性解鏈曲線：如果在連續(xù)加熱DNA的過程中以溫度對(duì)A260值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。目錄Tm：變性是在一個(gè)相當(dāng)窄的溫度范圍內(nèi)完成，在這一范圍內(nèi)，雙鏈DNA變性一半所需要的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱熔解溫度(meltingtemperature,Tm)。其大小與G+C含量成正比。Tm=（G+C）%×0.41+69.3三、DNA的復(fù)性DNA復(fù)性(renaturation)的定義

在適當(dāng)條件下，變性DNA的兩條互補(bǔ)鏈可恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復(fù)性。

熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程稱為退火(annealing)。減色效應(yīng)DNA復(fù)性時(shí)，其溶液OD260降低。DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復(fù)性不同來源的DNA分子復(fù)性的速度受到諸多因素的影響：1.核酸分子的濃度：一般適宜的探針濃度為0.1～0.5μg。2.核酸分子的長度：核酸探針的長度控制在50～300bp3.溫度：適宜的復(fù)性溫度是較Tm值低25℃。4.離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度過低，不利于復(fù)性。5.核酸分子的復(fù)雜性。第二節(jié)

核酸分子雜交的基本方法核酸分子雜交的類別（一）DNA印跡技術(shù)(Southernblotting)

用于基因組DNA的定性定量分析、酶切圖譜分析、基因突變分析及限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）等。（二）RNA印跡技術(shù)(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。

蛋白質(zhì)的印跡分析(Westernblotting)

用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。其他斑點(diǎn)印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)（一）Southern印跡雜交

DNA印跡E.Southern 1975年方法1.酶解DNA限制性內(nèi)切酶（RestrictionEnzyme,RE）限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）在人類基因組中，平均約200對(duì)堿基可發(fā)生一對(duì)變異（稱為中性突變），中性突變導(dǎo)致個(gè)體間核苷酸序列的差異，稱為DNA多態(tài)性。不少DNA多態(tài)性發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上，酶切水解該DNA片段就會(huì)產(chǎn)生長度不同的片段，稱為限制性片段長度多態(tài)性。2.分離電泳

在電場中帶電粒子向帶符號(hào)相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis）。

＋－=－＋－3.凝膠中核酸的變性堿變性中和處理4.轉(zhuǎn)膜硝酸纖維素膜尼龍膜轉(zhuǎn)膜方法毛細(xì)管虹吸印跡法電轉(zhuǎn)印法真空轉(zhuǎn)移法毛細(xì)管虹吸印跡法

電轉(zhuǎn)印法

真空轉(zhuǎn)移法5.雜交預(yù)雜交：封閉非特異性DNA位點(diǎn)。雜交6.雜交結(jié)果的檢測(cè)放射自顯影照片Southern印跡的應(yīng)用基因診斷法醫(yī)學(xué)

DNA的多態(tài)性。微衛(wèi)星DNA和小衛(wèi)星DNA等是重要的多態(tài)性標(biāo)志。單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism,SNP)

DNA指紋（DNAfinger-print）分析的基本流程如下：DNA的提純與純化→限制性內(nèi)切酶消化→電泳分離→分子雜交→指紋圖的顯示假設(shè)一對(duì)夫妻，生了一男一女，又領(lǐng)養(yǎng)了一個(gè)女孩，妻子還帶來與其前夫所生的女兒。這一家人的DNA指紋如圖所示。由此可推斷出：A和C是親生兒女；B為妻子和其前夫所生；D為養(yǎng)女

（二）Northernblot和Southernblot不同在于：A：靶核酸是RNA；B：RNA電泳時(shí)，凝膠中加入變性劑，防止

RNA分子形成二級(jí)結(jié)構(gòu)；C：電泳結(jié)束后直接轉(zhuǎn)膜。一、原理三種印跡技術(shù)的比較

(三）原位雜交(insituhybridization)

原位雜交是將分子雜交與組織化學(xué)相結(jié)合的一種技術(shù)。它是利用標(biāo)記的已知核酸探針，在組織、細(xì)胞及染色體上檢測(cè)特異的DNA或RNA序列的核酸雜交技術(shù)。主要過程：⑴制備標(biāo)記的核酸探針:

長度一般為50～300bp。⑵標(biāo)本的制作與處理:

注意防止核酸丟失、保持形態(tài)結(jié)構(gòu)、保證探針穿透到達(dá)靶區(qū)。⑶原位雜交:DNA探針雜交可在2-4小時(shí)內(nèi)完成，而RNA探針雜交則應(yīng)過夜。⑷雜交信號(hào)的顯示和結(jié)果分析。

1.斑點(diǎn)印跡雜交(dotbloting)將RNA或DNA變性后直接點(diǎn)樣于NC膜或尼龍膜上優(yōu)點(diǎn)：簡單、快速、可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品2.原位雜交(insituhybridization)將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱為原位雜交。特點(diǎn)能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究不需從組織或細(xì)胞中提取核酸，對(duì)含量極低的靶序列靈敏度高能準(zhǔn)確反映組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)核酸原位雜交的基本步驟細(xì)胞或組織的固定：載玻片組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質(zhì)探針的選擇和標(biāo)記雜交雜交結(jié)果檢測(cè)熒光原位雜交圖

（四）溶液雜交(Solutionhybridization)核酸酶S1保護(hù)分析法(nucleaseS1protectionassay)RNA酶保護(hù)分析法(RNaseProtectionAssay，RPA)1.核酸酶S1

保護(hù)分析法合成單鏈DNA探針與RNA樣品進(jìn)行雜交DNA/RNA核酸酶S1降解DNA和RNA單鏈放射自顯影2.RNA酶保護(hù)分析法制備標(biāo)記RNA探針RNA/RNA與待測(cè)RNA雜交RNaseT1和RNaseA降解單鏈RNA電泳第三節(jié)探針

探針(probe)

一小段用同位素、生物素或熒光染料等標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。一、核酸探針的來源

基因組DNA探針

cDNA探針

RNA探針寡核苷酸探針組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*基因組DNA文庫目錄mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫逆轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制*cDNA文庫逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTT

AAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目錄二、核酸探針的標(biāo)記物?①高度靈敏性；②標(biāo)記物與核酸探針結(jié)合，應(yīng)絕對(duì)不能影響核酸探針與模板的結(jié)合能力及結(jié)合的特異性；③當(dāng)用酶促方法進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，應(yīng)對(duì)酶促活性（Km值）無多大影響，以保證標(biāo)記反應(yīng)的效率和標(biāo)記產(chǎn)物的比活性；④高度特異性；⑤較高的化學(xué)穩(wěn)定性，保存時(shí)間長，標(biāo)記及檢測(cè)方法簡單；⑥對(duì)環(huán)境無污染，對(duì)人體無損傷；⑦價(jià)格低廉等。常用的探針標(biāo)記物：放射性同位素：

3H、32P、35S、125I等。非放射性同位素：熒光、地高辛素、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶等。放射性核素標(biāo)記物（靈敏度極高）①32P：釋放β-粒子,能量高,穿透力極強(qiáng)。②35S：35S的放射性亦較強(qiáng)，但β-粒子能量較低，因此其檢測(cè)靈敏度較32P稍低。③3H：適用于細(xì)胞原位雜交。④125I和131I：碘放射性同位素在70年代曾被廣泛應(yīng)用于核酸探針的標(biāo)記。非放射性標(biāo)記物無放射性污染，穩(wěn)定性好①半抗原：生物素、地高辛②配體：生物素③熒光素：④化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，可以像放射性核素一樣直接對(duì)X光膠片進(jìn)行