基因工程基本原理及操作程序

基因工程基本原理及操作程序現(xiàn)在是1頁\一共有40頁\編輯于星期三基因工程的概念

基因工程又叫基因拼接技術或DNA重組技術。通俗的說就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細胞里，定向的改造生物的遺傳性狀?，F(xiàn)在是2頁\一共有40頁\編輯于星期三蘇云金桿菌毒蛋白基因毒蛋白殺死害蟲棉花細胞抗蟲棉的培育現(xiàn)在是3頁\一共有40頁\編輯于星期三基因工程的概念

基因工程又叫基因拼接技術或DNA重組技術。通俗的說就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細胞里，定向的改造生物的遺傳性狀?，F(xiàn)在是4頁\一共有40頁\編輯于星期三DNA片段的連接工具（“分子縫合針”）

——DNA連接酶基因轉移工具（“分子運輸車”）

——運載體一、DNA重組技術的基本工具準確切割DNA的工具（“分子手術刀”）

——限制酶現(xiàn)在是5頁\一共有40頁\編輯于星期三

特點：一種限制酶只能識別DNA的一種核苷酸序列，并在特定的位點切割DNA.1、限制酶現(xiàn)在是6頁\一共有40頁\編輯于星期三限制性內切酶限制酶現(xiàn)在是7頁\一共有40頁\編輯于星期三限制酶切割的是么？DNA分子

切割DNA分子兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。現(xiàn)在是8頁\一共有40頁\編輯于星期三切割DNA分子后形成什么？黏性末端（在中軸線兩側切割DNA）平末端（在中軸線處切割DNA）現(xiàn)在是9頁\一共有40頁\編輯于星期三

會產生互補的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。

如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？現(xiàn)在是10頁\一共有40頁\編輯于星期三現(xiàn)在是11頁\一共有40頁\編輯于星期三

將雙鏈DNA分子片段“縫合”起來，恢復兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。DNA連接酶連接的是什么？2、DNA連接酶現(xiàn)在是12頁\一共有40頁\編輯于星期三AATTGCCTTAAG磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵現(xiàn)在是13頁\一共有40頁\編輯于星期三基因的針線：DNA連接酶

G

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G剪刀：用同種限制酶切割現(xiàn)在是14頁\一共有40頁\編輯于星期三DNA連接酶的種類T4

DNA連接酶：連接黏性末端和平末端E·coliDNA連接酶：黏性末端現(xiàn)在是15頁\一共有40頁\編輯于星期三3、運載體

常用的運載體：質粒、噬菌體和動植物病毒等標記基因，便于進行檢測。

質粒存在于許多細菌和酵母菌等生物中,是擬核或細胞核外能夠自主復制的很小的環(huán)狀DNA分子.

現(xiàn)在是16頁\一共有40頁\編輯于星期三特點：

1.結構簡單，能夠在宿主細胞中復制并穩(wěn)定地保存。

2.具多種限制酶的單一切點，以便與外源基因連接。

3.具有某些標記基因，便于進行篩選。

4.對宿主細胞沒有傷害。作用：將目的基因導入受體細胞常用運載體：質粒

動植物病毒噬菌體現(xiàn)在是17頁\一共有40頁\編輯于星期三基因工程基本操作的四個步驟1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構建3、將表達載體導入受體細胞4、目的基因的檢測與鑒定現(xiàn)在是18頁\一共有40頁\編輯于星期三一、目的基因的獲取1、目的基因主要是編碼蛋白質的基因2、獲取目的基因的常用方法?①從基因文庫中獲取②利用PCR技術擴增③人工合成現(xiàn)在是19頁\一共有40頁\編輯于星期三①從基因文庫中獲取目的基因基因文庫

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫?；蚪M文庫部分基因文庫（如:cDNA文庫）現(xiàn)在是20頁\一共有40頁\編輯于星期三基因組文庫

通過對受體菌群體的培養(yǎng)而儲存一種生物的全部基因。現(xiàn)在是21頁\一共有40頁\編輯于星期三cDNA文庫的構建提取生物某發(fā)育時期mRNA單鏈DNA逆轉錄酶雙鏈的cDNA(只含該生物的部分基因)與載體連接導入受體菌群儲存起來現(xiàn)在是22頁\一共有40頁\編輯于星期三基因組文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫)比較現(xiàn)在是23頁\一共有40頁\編輯于星期三真核細胞的基因結構編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)RNA聚合酶的結合位點內含子外顯子能轉錄翻譯成蛋白質不能轉錄翻譯成蛋白質啟動子終止子內含子：外顯子：現(xiàn)在是24頁\一共有40頁\編輯于星期三基因組文庫和cDNA文庫的比較現(xiàn)在是25頁\一共有40頁\編輯于星期三②利用PCR技術擴增目的基因③人工合成法：

基因較小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成儀人工合成?，F(xiàn)在是26頁\一共有40頁\編輯于星期三目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。質粒

目的基因

啟動子

終止子二、基因表達載體的構建現(xiàn)在是27頁\一共有40頁\編輯于星期三啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉錄標記基因：為了鑒別受體細胞中是否導入了目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來現(xiàn)在是28頁\一共有40頁\編輯于星期三①用一定的_________切割質粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。②用_____________切斷目的基因，使其產生____________③將切下的目的基因片段插入質粒的________處，再加入適量_______________，形成了一個重組DNA分子（重組質粒）。限制酶黏性末端同一種限制酶相同的黏性末端切口DNA連接酶

用同種限制酶分別切割目的基因和質粒，使之露出相同的粘性末端，再加入DNA連接酶。現(xiàn)在是29頁\一共有40頁\編輯于星期三三、將目的基因導入受體細胞轉化

方法將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞農桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法目的基因進入受體細胞內，并在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程?！狢a

處理細胞

2+現(xiàn)在是30頁\一共有40頁\編輯于星期三農桿菌轉化法農桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。原理：Ti質粒上的T—DNA可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上?，F(xiàn)在是31頁\一共有40頁\編輯于星期三基因槍法：單子葉植物花粉管通道法：抗蟲棉現(xiàn)在是32頁\一共有40頁\編輯于星期三

目的基因表達載體提純取卵（受精卵）顯微注射轉基因受精卵轉基因動物顯微注射法現(xiàn)在是33頁\一共有40頁\編輯于星期三顯微注射法現(xiàn)在是34頁\一共有40頁\編輯于星期三

用Ca2+處理細胞感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA分子將目的基因導入微生物細胞現(xiàn)在是35頁\一共有40頁\編輯于星期三四、目的基因的檢測與鑒定四環(huán)素抗性基因

青霉素抗性基因大腸桿菌現(xiàn)在是36頁\一共有40頁\編輯于星期三四、目的基因的檢測與鑒定分子水平檢測個體水平鑒定①檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質方法——DNA分子雜交方法——抗原-抗體雜交抗蟲鑒定、抗病鑒定等方法——DNA分子雜交現(xiàn)在是37頁\一共有40頁\編輯于星期三

DNA分子雜交原理：互補的DNA單鏈能夠在一定條件下結合成雙鏈，即能夠進行雜交。這種結合是特異的，即嚴格按照堿基互補配對進行。因此，當用探針和轉基因生物的DNA雜交時候，如果出現(xiàn)雜交帶（用特殊的顯影裝置可以看見），則說明目的基因已插入受體細胞的染色體DNA中。

基因探針：是一小段單鏈的DNA或RNA，帶有放射性同位素標記，并能與目的基因的的一條鏈發(fā)生堿基互補配對?，F(xiàn)在是38頁\一共有40頁\編輯于星期三現(xiàn)在是39頁\一共有40頁\編輯于星期三②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA方法——DNA與mRNA雜交③檢測目的基因