富硒補充劑的生物有效率以及生物利用度

富硒補充劑的生物有效率以及生物利用度第1頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四目錄一、前言二、背景三、主要材料四、技術(shù)路線、方法五、結(jié)果六、結(jié)論第2頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四前言硒是一種化學元素，1957年以前,微量元素硒是作為毒物進行研究的,1957年硒首次被證實為動物及人體必需的微量元素后,國內(nèi)外許多學者已對其進行了廣泛的研究，如1973年Rotruck和Flohe等人證實硒是谷胱甘肽的組成部分。隨著研究的深入，各國進而制定了有關(guān)硒的RDA，如英國60-75ug/d【2】，然而根據(jù)世界衛(wèi)生組織WHO)和國際糧農(nóng)組織(FAO)的標準,全球嚴重缺硒人群(日攝入量7~11μg)達5億~10億以上,缺硒人群遠遠多于硒過量的人群【1】.2023/4/6第3頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四研究背景食物中的硒濃度取決于土壤中硒的濃度，進而通過食物鏈影響人體中硒的濃度，因此，人群硒狀態(tài)呈地理分布。1984年芬蘭實施作物施肥強化硒政策后，到2001年，居民硒的攝入量由之前的38ug/d上升到80ug/d,表明了強化硒的有效性。然而，對于比利時這個國家而言，人們更依賴于富硒的膳食補充劑來改善他們的硒狀態(tài)。本研究作者將比利時市場上的富硒補充劑歸為三大類，通過體外消化模型比較研究三種不同類別的硒補充劑的生物有效性以及生物利用度。第4頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四主要實驗材料Se-enrichedyeast（167ug/gse)；多維多礦sodiumselenate(30ug/g)；多維多礦sodiumselenite(35ug/g)；pepsinI;bilesalt;Tris;pancreatin;ICP-MS;HPLC;Caco-2cell；DMEM;FBS,six-wellplate;HBSS;PEtrancewell。第5頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四主要材料ICP-MS:是電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，主要用途是進行化學元素分析檢測，特別是對金屬元素分析,檢出限比較低。caco-2細胞，人克隆結(jié)腸腺癌細胞，結(jié)構(gòu)和功能類似分化的小腸上皮細胞，可用來模擬體內(nèi)轉(zhuǎn)運的實驗.第6頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四transewell技術(shù)這是一類有通透性的杯狀的裝置，根據(jù)Corning公司的Transwell說明書中的介紹，可以認為這是一種膜濾器（Membranefilters），也可認為是一種有通透性的支架（permeablesupports）。將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以PET膜相隔。第7頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四將細胞種在上室內(nèi)，上室與下室加入同樣的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞直至分化后，上室再加入需要研究的物質(zhì)的溶液，通過caco-2單層細胞以及濾膜器，進而可以研究該物質(zhì)的轉(zhuǎn)運吸收。嵌套的多孔底部使研究者可以從上層或下層接觸到細胞，從而為體外的細胞運輸和其他代謝活性研究提供通用的工具。第8頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四技術(shù)路線第9頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四公式第10頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四方法：硒的分析50%硝酸微波消化后進入ICP-MS系統(tǒng)測得原始硒的濃度。酶法提取后進入ICP-MS系統(tǒng)可得到總硒濃度酶法提取后，進入反相HPLC與ICP-MS聯(lián)用系統(tǒng)測得原始不同形式硒的濃度（0–5min100%HFBA,5–10min70%HFBA-30%methanol）酶法提?。旱?1頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四方法：胃以及腸內(nèi)消化胃內(nèi)消化：用100ml錐形瓶稱量樣品，用40mlHBSS稀釋(PH=2)，加入2ml胃蛋白酶，充入氮氣在無氧狀態(tài)下37°C,350rpm水浴振搖2h。腸內(nèi)消化：用NaHCO3調(diào)整上述得到的消化液的PH到5.3然后加入膽汁以及胰酶，充入氮氣37°C,350rpm水浴振搖2h，消化結(jié)束后80°C,10min滅活酶類，然后3000rpm離心15min,取上清液進行分析。第12頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四方法：細胞培養(yǎng)以及處理caco-2細胞復蘇后，在DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并加入10%熱滅活FBS以及1%非必須氨基酸，以及200mm谷胱甘肽后，37攝氏度5%二氧化碳孵箱里培養(yǎng),傳代后以細胞密度約為4×105接種于有滲透性的PETtranswell細胞培養(yǎng)室里，trasewell放置于六孔板里，上室和下室分別加入1.5和2.5ml培養(yǎng)液培養(yǎng)直至細胞完全分化（21天），再將從消化過程得到的可溶性硒溶液加入上室里（下室加入1%的白蛋白），3小時后收集下室液體以及細胞，作進一步的檢測分析。第13頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四結(jié)果1.樣品中硒的分析檢測結(jié)果N=3，n=3第14頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四富硒酵母硒酸鈉亞硒酸鈉硒標準曲線第15頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四結(jié)果表2表明：1硝酸消化后100%還原了提供的樣品里面的硒，并且確認了供應商的提供樣品的信息。2經(jīng)酶法提取后，富硒酵母里的硒變?yōu)榱嗽嘉鴿舛鹊?6%，無機硒的濃度保持不變。3根據(jù)反相HPLC-ICP-MS得出的圖譜，保留時間定性，富硒酵母里主要含有3種不同形式的硒，無機硒樣品中只含有單一形式的硒。第16頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四結(jié)果2三種FS中硒的生物有效性以及生物利用度富硒酵母硒酸鈉亞硒酸鈉6%+1%57%14%80%1%N=3，n=3第17頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四結(jié)果2由圖表3可以看出，富硒酵母中的硒生物有效性僅僅只有57%，根據(jù)公式，富硒酵母的生物有利用度應該是細胞內(nèi)的硒（1%原始硒濃度）與基底里的硒（6%原始硒濃度）的總和；硒酸鈉和亞硒酸鈉的生物有效性各自為100%和80%，生物利用度各自為14%和1%，無機硒的生物利用度僅由下室液里的硒構(gòu)成，因為在caco-2細胞里沒有檢測到硒。第18頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四結(jié)果3Fig.4PercentageoforiginalSespeciesfromyeast-FSthatwerereleasedingastrointestinaljuice(i.e.,bioaccessibleSe),andabsorbedthroughCaco-2monolayeroraccumulatedincellsduringa3-hperiod(i.e.,bioavailableSe).BlackbarSeMetdottedbarSe(IV),andhatchedbarMeSeCys.Resultsaregivenasmeans±standarddeviations(N=3,n=3)3富硒酵母里不同形式硒的生物有效性以及生物利用度semetMesecysse(IV)24%70%第19頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四結(jié)果3說明：富硒酵母里三種主要形式的硒分別為硒蛋氨酸、四價硒以及甲基硒代半胱氨酸，由圖表可以看出富硒酵母不同形式的硒釋放到小腸里的濃度以及被caco-2細胞利用的程度，由圖可以看出，硒蛋氨酸的生物有效性要低于其余兩種形式的硒，但是卻是富硒酵母FS里唯一種可以在下室液里以及細胞內(nèi)檢測到的形式。第20頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四討論由于比利時大多數(shù)的食物硒含量都比較低，因此大多數(shù)比利時居民硒攝入量不足，而補充硒膳食補充劑似乎成為了增加硒攝入量的一種可行的方式，本研究了三種不同類別的硒補充劑，模擬了從胃內(nèi)消化到最終吸收入血液的過程，模擬體外實驗比監(jiān)測人體更加方便，迅速，簡便的優(yōu)勢。第21頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四討論1：生物有效性根據(jù)實驗結(jié)果，我們得知富硒酵母的生物有效性要低于無機硒，分析其原因可能為可能是由于有機硒本身存在于混合物中，不像無機硒相對簡單而容易提取。也有可能是由于富硒酵母里含有一些未知的沒有生物有效性形式的硒（不穩(wěn)定，易揮發(fā)），還有可能是因為如硒蛋氨酸與食物中大蛋白質(zhì)結(jié)合，不容易被分離提取。第22頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四討論：生物有效性之前也有研究表明，體外消化8H后，生物有效性可高達89%，這可能與時間有關(guān)，因為研究中2h的生物有效率為35%，4h達到了45%，這些數(shù)據(jù)提示酵母硒FS的硒生物有效性的是受富硒酵母在消化道中的運輸速度影響的。第23頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四生物利用度先前有研究通過caco-2細胞模型得出的結(jié)果，就單一形式的硒來說，它們的生物利用度大致為，Se(IV)(12±1%)<Se(VI)(33±2%)<MeSeCys(46±2%)<SeMet(56±4%），這些值比本實驗觀察得到的值要高，可能是因為一些FS里基質(zhì)或消化酶的存在，會阻礙或者減緩細胞對FS中硒的吸收。第24頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四生物利用度雖然本實驗結(jié)果富硒酵母硒的生物利用度并不是很高，但是本實驗中只有源于富硒酵母FS的硒才可以在細胞中積累。因此可以考慮作為長期補充膳食硒的來源。而硒酸鹽FS具有獨特的較高生物利用率，并且比硒蛋氨酸更容易從機體排泄，因而可作為急性或者臨時缺硒的補充來源。第25頁，共27頁，2023年，2月20日，星期四國內(nèi)情況由于我國湖北省恩施縣在1960年初期地方性硒中毒病爆發(fā)，所以我國對硒元素的研究還比較早，以楊光圻教授為首。當時硒中毒地區(qū)玉米硒的含量高達4mg/kg,為正常地區(qū)的500—1000倍