固定化酶與固定化細胞

固定化酶與固定化細胞2021/1/1221.酶是蛋白質，穩(wěn)定性差〔熱、酸堿、有機溶劑對其有影響〕。2.不能回收，使用本錢高。3.酶在游離體系中更容易自水解4.別離純化困難，也使產物中混雜酶蛋白

游離酶的缺點：2021/1/123固定化酶〔定義〕：用物理或化學手段定位在限定的空間區(qū)域，并使其保持催化活性，可重復利用的酶。〔1971年在美國召開的第一屆國際酶工程會議〕固定化細胞〔定義〕：將具有一定生理功能的生物細胞〔如微生物細胞、植物細胞或動物細胞等〕，用一定的方法將其固定，作為固體生物催化劑而加以利用的一門技術。固定化細胞意義：用完好的細胞作為生物催化劑，以充分有效地利用生物細胞內的特定酶或多酶系統(tǒng)。2021/1/124優(yōu)點①省去對酶的提取過程，使酶的損失和消費本錢降到最低程度；②可以利用細胞的多酶系統(tǒng)直接消費有價值的產物。2021/1/125第一節(jié)酶和細胞的固定化一、固定化酶和細胞的定義及特點二、固定化方法三細胞的固定化方法四原生質體的固定化方法2021/1/126一、固定化酶和細胞的定義及特點

1.固定化酶(immobilizedenzyme)

通過化學或物理的手段將酶定位于限定的空間區(qū)域內，使其保持活性并可反復利用。

2021/1/127什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶〔固定化酶〕固定化技術2021/1/128酶固定化方法要求①不破壞酶活性中心的構象：酶的固定化不能破壞酶活性中心的構象，盡量防止活性部位的氨基酸殘基受到影響；②載體要求：a.固定化的載體應與酶結合較為結實。B.載體不能與底物、產物等發(fā)生化學反響。C.載體必須有一定的機械強度，防止因機械攪拌而破碎。③位阻應該較?。罕M可能不阻礙酶與底物的接近。④本錢低：酶固定化的本錢要盡可能的低。2021/1/129優(yōu)點：(1)可進步穩(wěn)定性。(2)能回收，易與產物別離，可反復使用。缺點：(1)存在擴散限制。適于催化小分子物質。(2)酶活性下降。2021/1/12102.固定化細胞〔immobilizedcell〕固定在載體上并在一定空間范圍內進展生命活動〔生長、繁殖、新陳代謝〕的細胞。2021/1/1211優(yōu)越性：(1)降低本錢，省去酶的別離純化工作;(2)既可作為單一酶，也可作為復合酶系完成部分代謝過程。局限性：(1)細胞內多種酶的存在，會形成不需要的副產物。(2)細胞膜、細胞壁和載體都存在著擴散限制作用。2021/1/12123.固定化原生質體意義：(1)固定化原生質體去除了細胞壁的擴散障礙，有利于氧的傳遞，營養(yǎng)成分的吸收和胞內產物的分泌。(2)原生質體不穩(wěn)定，容易破裂，固定化后，由于載體的保護作用，穩(wěn)定性進步。2021/1/1213

二、固定化方法固定化方法〔一〕酶的固定化方法吸附法共價偶聯法交聯法包埋法網格型微囊型離子交換吸附物理吸附法2021/1/1214根據帶電的酶或細胞和載體之間的靜電作用，使酶吸附于惰性固體的外表或離子交換劑上。1.吸附法〔adsorption〕2021/1/1215根據吸附劑的特點分:1〕物理吸附法〔physicaladsortion〕作用力：氫鍵、疏水鍵常用載體：氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石、纖維素等。2〕離子結合法〔ionbinding〕作用力：離子鍵常用載體：DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、CM-纖維素2021/1/1216優(yōu)點：條件溫和，操作簡便，酶活力損失少。缺點：結合力弱，易解吸附。2021/1/1217借助共價鍵將酶的活性非必需側鏈基團和載體的功能基團進展偶聯。2.共價偶聯法〔covalentbindingorcovalentcoupling〕2021/1/12181〕載體：親水載體優(yōu)于疏水載體如:天然高分子衍生物:纖維素葡聚糖凝膠親和性好，機械性能差瓊脂糖合成聚合物：聚丙烯酰胺 聚苯乙烯機械性能好，但有疏水構造尼龍2021/1/12192〕偶聯方法：偶聯成功與否取決于： 載體：功能基團：芳香氨基，羧基，羧甲基等。酶分子:側鏈非必需基團：羧基，巰基，羥基，酚基，咪唑基。 2021/1/1220常用的偶聯反響有：重氮化法、疊氮法、溴化氰法、烷基化法等。2021/1/1221優(yōu)點：酶與載體結合結實，不會輕易脫落，可連續(xù)使用。缺點：反響條件較劇烈，易影響酶的空間構象而影響酶的催化活性。2021/1/12223.交聯法〔crosslinking〕借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯的固定化方法。雙功能試劑： 常用的是戊二醛 O O H—C—CH2—CH2—CH2—C—H2021/1/1223戊二醛有兩個醛基，均可與酶或蛋白質的游離氨基反響,使酶蛋白交聯。

此法與共價偶聯法利用的均是共價鍵，不同之處：交聯法不使用載體。2021/1/1224交聯反響既能發(fā)生在分子間，也可發(fā)生在分子內。酶濃度低時，交聯發(fā)生在分子內，酶仍保持溶解狀態(tài)。酶濃度高時，交聯發(fā)生在分子間，酶變?yōu)椴蝗軕B(tài)。2021/1/1225缺點：(1)反響條件劇烈，酶分子的多個基團被交聯，酶活力損失大。(2)制備的固定化酶顆粒較小，給使用帶來不便。

2021/1/12264.包埋法〔entrapment〕將酶用物理的方法包埋在各種載體〔高聚物〕內。分為：網格型：將酶包埋在高分子凝膠細微網格中。微囊型：將酶包埋在高分子半透膜中。2021/1/12271〕網格型包埋法〔gel(lattic)entrapment〕又稱凝膠包埋法凝膠包埋條件酶活性強度天然凝膠瓊脂、海藻酸鈣、角叉菜膠、明膠溫和不變差合成凝膠聚丙烯酰胺、光交聯樹脂聚合反應部分失活高使用的多孔載體及其特點2021/1/1228海藻酸鈣凝膠包埋法：滴至海藻酸鈉溶液＋E(orcell)CaCl2溶液中IE(orIC)

角叉菜膠包埋法：滴至角叉菜膠＋E(orcell)KCl

溶液中IE(orIC)聚丙烯酰胺凝膠包埋法：

APAcr+Bis+E(orcell)IE(orIC)TEMED2021/1/12292〕微囊型包埋法〔microencapsulation〕又稱半透膜包埋法將一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜內。半透膜：直徑幾十微米到幾百微米，厚約25nm。半透膜孔徑<酶分子孔徑，小于半透膜孔徑的小分子底物和產物可以自由進出，被稱為“人工細胞〞。2021/1/1230與網格型包埋法相比，微囊型包埋法的優(yōu)點：1〕固定化酶顆粒小，有利于底物和產物擴散。2〕半透膜能阻止蛋白質分子滲漏和進入，注入體內既可防止引起免疫過敏反響，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有較大的醫(yī)學價值。

缺點：反響條件要求高,制備本錢也較高。

2021/1/1231包埋法是目前應用最多的一種較理想的方法，與其它固定化方法相比：優(yōu)點：不與酶蛋白氨基酸殘基反響，很少改變酶的高級構造，酶活回收率高。缺點：只合適作用于小分子底物和產物的酶。2021/1/1232

吸附法共價偶聯法交聯法包埋法

酶的四種固定化方法2021/1/12332021/1/12342021/1/1235固定化方法吸附法包埋法共價結合法交聯法物理吸附法離子吸附法制備難易易易較難難較難結合程度弱中等強強強活力回收高，酶易流失高高低中等再生可能可能不能不能不能費用低低低高中等底物專一性不變不變不變可變可變各種固定化方法的優(yōu)缺點比較2021/1/1236三細胞的固定化方法1.固定化細胞的分類2.固定化方法2021/1/1237分類方式固定化細胞分類方式固定化細胞細胞類型微生物植物動物生理狀態(tài)死細胞:完整細胞,細胞碎片,細胞器活細胞:增殖細胞,靜止細胞,饑餓細胞1.固定化細胞的分類2021/1/12381)直接固定法不使用載體，借助物理〔如加熱、冰凍〕、化學方法〔如檸檬酸、各種絮凝劑〕將細胞直接固定。一般只用于單酶或少數幾種酶催化的反響。2)吸附法3)包埋法2.固定化方法2021/1/1239

例如：葡萄糖異構酶(白色鏈霉菌)，是一種胞內酶。在50--80℃加熱10分鐘，使菌體自溶作用的酶失活，而葡萄糖異構酶仍然保持活性，長期使用酶活力不減少。2021/1/1240

微生物細胞植物細胞動物細胞

吸附法吸附力較弱，細胞易脫落包埋法2021/1/1241實驗：2.4%左右的卡拉膠，70℃溶解,再冷卻到42℃,+10%左右的細菌菌體(預熱到42℃〕

迅速混合均勻4℃冰箱放置大約30min取出后切成3×3mm的小顆粒

2021/1/1242一般采用網格包埋法〔即凝膠包埋法〕。常用凝膠：瓊脂凝膠，海藻酸鈣凝膠，角叉菜膠和光交聯樹脂。注意：一般要加浸透壓穩(wěn)定劑，以防止原生質體破裂。四原生質體的固定化方法2021/1/1243

第二節(jié)

固定化酶和固定化細胞的性質與表征一、固定化酶的性質二、固定化細胞的性質三、固定化酶〔細胞〕的評價指標2021/1/1244一、固定化酶的性質影響酶催化活性的因素1.構象改變或立體屏蔽以及微擾2.分配效應和擴散限制效應〔一〕酶的活性〔二〕酶的穩(wěn)定性〔三〕酶的最適溫度〔四〕酶的最適pH〔五〕酶的動力學特征〔六〕酶的作用專一性2021/1/12452021/1/12462021/1/1247〔一〕酶的活性：通常低于天然酶〔有例外〕。〔二〕酶的穩(wěn)定性酶的耐熱性、對變性劑、抑制劑、蛋白酶的抵抗力增加。2021/1/1248可能的原因：①固定化增加了酶活性構象的結實程度，可防止酶分子伸展變形；②抑制酶的自身降解。③固定化部分阻擋了外界不利因素對酶的侵襲。2021/1/1249如：氨基?；?，70℃，15分鐘，酶失去活性。而固定化后，70℃，15分鐘，有>80%活性。2021/1/1250〔三〕酶的最適溫度最適溫度與酶穩(wěn)定性有關。多數酶固定化后熱穩(wěn)定性上升，最適溫度也上升〔有例外〕?！菜摹趁傅淖钸mpH帶負電荷載體：最適pH向堿性偏移。帶正電荷載體：最適pH向酸性偏移。2021/1/12512021/1/1252固定化酶的表觀米氏常數Km隨載體的帶電性能變化。固定化載體與底物電荷相反,固定化酶的表觀Km值降低。固定化載體與底物電荷一樣,固定化酶的表觀Km值顯著增加。〔五〕酶的動力學特征2021/1/1253與自然酶根本一樣。但大分子底物難于接近酶分子，導致酶的專一性發(fā)生改變?！擦趁傅淖饔脤Ｒ恍?021/1/1254與固定化酶相比，固定化細胞的情況比較復雜?！?〕有活性升高的現象?！?〕穩(wěn)定性的增加?！?〕最適溫度和最適pH常保持不變。二、固定化細胞的性質

2021/1/1255(一)酶(細胞)的活力固定化酶通常呈顆粒狀，一般用于測定自然酶活力的方法改進后才能用于測定固定化酶。(二)蛋白總量1.雙辛可寧酸法(BCA法)2.考馬斯亮藍法

三、固定化酶〔細胞〕的評價指標2021/1/1256(三)偶聯率及相對活力偶聯率=(參加蛋白活力一上清液蛋白活力)/參加蛋白活力×100%活力回收=固定化酶總活力/參加酶的總活力×100%相對活力=固定化酶總活力/(參加酶的總活力-上清液中未偶聯酶活力)×100%2021/1/1257

(四)半衰期

在連續(xù)測定條件下，固定化酶(細胞)的活力下降為最初活力一半所經歷的連續(xù)工作時間，以t1/2表示。是衡量穩(wěn)定性的一項重要指標。2021/1/1258不同固定化方法的比較carriersRecoveryofenzymeactivity(%)Agar54.0po1yacrvlamldel5.24Gelatin40.77carragheenan69.13Glutaraldehyde02021/1/1259第三節(jié)固定化酶與固定化細胞的應用一、在工業(yè)消費上的應用二、固定化酶在醫(yī)學上的應用三、在分析檢測中的應用2021/1/1260乙酰-DL—AlaL—Ala+乙酸 乙酰-D—Ala一、在工業(yè)消費上的應用1.氨基酰化酶〔Aminoacylase〕世界上第一種工業(yè)化消費的固定化酶2021/1/1261泵儲罐反應產物離心機消旋反應器固定化酶柱子晶體L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala2021/1/12622.葡萄糖異構酶世界上消費規(guī)模最大，應用最為成功的一種固定化酶。2021/1/1263二、固定化酶在醫(yī)學上的應用1.消血栓：纖溶酶是異源蛋白質，在人體內引起免疫反響，無法長期使用。酶的不穩(wěn)定性使其在較短的時間內失活。用包埋法制備的酶固定化技術可抑制上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物質能自由進出。2021/1/12642.人工腎：原理：將病人血液中的尿素經脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微膠囊活性炭組成人工腎。2021/1/12652021/1/1266酶傳感器固定化酶和電化學傳感器的結合。優(yōu)點：①既有不溶性酶體系的優(yōu)點，又具有電化學電極的高靈敏度；②酶的專一反響性，使其具有較高的選擇性，可以直接在復雜試樣中進展測定。三、在分析檢測中的應用2021/1/1267SensitiveandspecificRapidSimpleBiosensor2021/1/1268

1967年Updike等采用酶的固定化技術，將葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧電極結合，組裝成了世界上第一個生物傳感器——葡萄糖氧化酶電極。2021/1/1269

葡萄糖酶電極

酶電極示意圖?－D－葡萄糖＋O2 D－葡萄糖酸－1，5－內酯＋H2O2半透膜酶膠層感應電極2021/1/1270GlucoseGluconicacidGlucoseoxidaseOxygenHydrogenperoxideMembraneElectrode根據反響中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以用氧電極、pH電極和H2O2電極來測定葡萄糖的含量。2021/1/1271繼酶傳感器〔enzymesensor〕后，又出現：細胞器傳感器〔cellorganellesensor〕組織傳感器〔tissuesensor〕微生物傳感器〔microbesensor〕免疫傳感器〔immunosensor〕2021/1/12721〕酶傳感器的原理生物傳感器由生物識別單元〔如酶、微生物、抗體等〕和物理轉換器相結合所構成的分析儀器。2021/1/12732021/1/1274生物識別元件

(Biologicalrecognitionelement)是酶、抗原(體)、細胞器、組織切片和微生物細胞等生物分子經固定化后形成的一種膜構造，對被測定的物質有選擇性的分子識別才能。2021/1/1275

換能器(Transducer)將識別元件上進展的生化反響中消耗或生成的化學物質，或產生的光或熱等轉換為電信號，并呈現一定的比例關系。2021/1/12762021/1/1277酶傳感器工作原理示意圖酶傳感器主要由固定化酶膜和變換器組成：固定化酶膜：選擇性地“識別〞并催化被檢測物質發(fā)生化學反響；變換器：把催化反響中底物或產物的變量轉換成電信號，通過儀表顯示出來。

2021/1/12782021/1/12792〕酶傳感器的應用水質監(jiān)測

用化學法測定酚時，硫化物、油類等可干擾其測定。從馬鈴薯中提純、經吸附交聯得到的固定化多酚氧化酶與氧電極構成酚傳感器，可檢測大多數酚類化合物。2021/1/1280德國研發(fā)的環(huán)境廢水BOD分析儀2021/1/1281醫(yī)療方面葡萄糖傳感器和血糖測定儀用