微生物指標(biāo)及微生物檢驗(yàn)

微生物指標(biāo)及微生物檢驗(yàn)第1頁/共42頁水質(zhì)常規(guī)指標(biāo)及限值修訂前修訂后微生物指標(biāo)限值微生物指標(biāo)限值細(xì)菌總數(shù)100CFU/mL菌落總數(shù)/（CFU/mL）100總大腸菌群每100mL水樣中不得檢出總大腸菌/（MPN/100mL或CFU/100mL）不得檢出糞大腸菌群每100mL水樣中不得檢出耐熱大腸菌/（MPN/100mL或CFU/100mL）不得檢出游離余氯在與水接觸30min后應(yīng)不低于0.3mg/L,管梢末水不應(yīng)低于0.5mg/L大腸埃希氏菌/（MPN/100mL或CFU/100mL）不得檢出第2頁/共42頁水質(zhì)非常規(guī)指標(biāo)及限值修訂前修訂后微生物指標(biāo)限值微生物指標(biāo)限值-菌落總數(shù)/（CFU/100mL）500小型集中式供水和分散式供水部分水質(zhì)指標(biāo)及限值修訂前修訂后微生物指標(biāo)限值微生物指標(biāo)限值-賈第鞭毛蟲/（個(gè)/10L）<1-隱孢子蟲/（個(gè)/10L）<1第3頁/共42頁生活飲用水水質(zhì)參考指標(biāo)及限值修訂前修訂后微生物指標(biāo)限值微生物指標(biāo)限值-腸球菌/（CFU/100mL）0-產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿/（CFU/100mL）0第4頁/共42頁一、菌落總數(shù)修訂前修訂后細(xì)菌總數(shù)原理：細(xì)菌總數(shù)是指水樣在一定條件下培養(yǎng)后（培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、pH、需氧性質(zhì)等）所得1ml水樣所含菌落的總數(shù)。按本規(guī)范規(guī)定所得結(jié)果只包括一群能在營養(yǎng)瓊脂上發(fā)育的嗜中溫的需氧的細(xì)菌菌落總數(shù)培養(yǎng)條件：36±1℃24h

菌落總數(shù)定義：水樣在營養(yǎng)瓊脂上有氧條件下37℃培養(yǎng)48h后，所得1ml水樣所含菌落的總數(shù)。36±1℃48h第5頁/共42頁二、總大腸菌群（埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬）除多管發(fā)酵法、濾膜法外，增加了酶底物檢測方法多管發(fā)酵法修訂前修訂后多管發(fā)酵法原理：總大腸菌群系指一群在37℃培養(yǎng)24h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌群主要來源于人畜糞便，具有指示菌的一般特征，故以此作為糞便污染指標(biāo)評(píng)價(jià)飲水的衛(wèi)生質(zhì)量。總大腸菌群定義：總大腸菌群指一群在37℃培養(yǎng)24h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。結(jié)果：5個(gè)10ml管中陽性管數(shù)為0時(shí)，MPN值為0（主要針對出廠自來水或需每天檢驗(yàn)一次的水樣）

結(jié)果：5個(gè)10ml管中陽性管數(shù)為0時(shí)，MPN值<2.2

第6頁/共42頁濾膜法修訂前修訂后濾膜法原理：用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過濾水樣,細(xì)菌被截留在濾膜上,將濾膜貼在選擇培養(yǎng)上,經(jīng)培養(yǎng)后,計(jì)數(shù)生長在濾膜上的典型大腸菌群菌落數(shù)。培養(yǎng)條件：37℃18-24h

濾膜法定義：總大腸菌群濾膜法是指用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過濾水樣,將濾膜貼在添加乳糖的選擇培養(yǎng)上,37℃培養(yǎng)24h，能形成特征菌落的需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌以檢測水中總大腸菌群的方法。培養(yǎng)條件：37℃24±2h

第7頁/共42頁酶底物法酶底物法定義：總大腸菌群酶底物法是指在選擇性培養(yǎng)基上能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶的細(xì)菌群組，該細(xì)菌群組能分解色原底物釋放出色原體使培養(yǎng)基呈現(xiàn)顏色變化，以此技術(shù)來檢測水中總大腸菌群的方法。培養(yǎng)基：MMO-MUG培養(yǎng)基（MinimalMediumONPG-MUG）。本方法可分為定性和定量。定量法：10管法、51孔定量法

培養(yǎng)條件：36±1℃24h

能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶的細(xì)菌群組分解ONPG使培養(yǎng)基呈黃色酶底物法的主要特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：可同時(shí)判斷水樣中大腸菌群和大腸埃希氏菌檢測時(shí)間較短，只需18-24h，最長需要28h無需確證試驗(yàn)操作簡單，對試驗(yàn)條件和人員要求低缺點(diǎn)：檢測成本高第8頁/共42頁總大腸菌群三種方法的比較多管發(fā)酵法濾膜法酶底物法時(shí)間24-72h24-48h24-28h驗(yàn)證試驗(yàn)需要需要不需要步驟較繁較簡便簡便特殊設(shè)備顯微鏡顯微鏡、過濾設(shè)備壓膜機(jī)價(jià)格低低較高第9頁/共42頁三、耐熱大腸菌群（埃希氏菌屬、耐熱克雷伯氏菌）檢測方法：多管發(fā)酵法、濾膜法修訂前修訂后原理：用提高培養(yǎng)溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中大腸菌群區(qū)分開，在44.5℃仍能生長的大腸菌群,稱為糞大腸菌群。

定義：用提高培養(yǎng)溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中大腸菌群區(qū)分開，在44.5℃仍能生長的大腸菌群,稱為耐熱大腸菌群。

第10頁/共42頁四、大腸埃希氏菌檢測方法：多管發(fā)酵法、濾膜法、酶底物法大腸埃希氏菌多管發(fā)酵法定義：大腸埃希氏菌是指多管發(fā)酵法總大腸菌群陽性，在含有熒光底物的培養(yǎng)基上44.5℃培養(yǎng)24h產(chǎn)生β-葡萄糖酫酸酶，分解熒光底物釋放出熒光產(chǎn)物，使培養(yǎng)基在紫外光下產(chǎn)生特征性熒光的細(xì)菌，以此來檢測水中大腸埃希氏菌的方法。培養(yǎng)基：EC-MUG（4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖酫酸苷）。培養(yǎng)條件：44.5±0.5℃培養(yǎng)24±2h。紫外燈：波長366nm，功率6W大腸桿菌能產(chǎn)生β-葡萄糖酫酸酶分解MUG，菌落在366nm紫外光下產(chǎn)生藍(lán)色熒光濾膜法定義：用濾膜法檢測水樣后，將總大腸菌群陽性的濾膜在含有熒光底物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能產(chǎn)生β-葡萄糖酫酸酶分解熒光底物釋放出熒光產(chǎn)物，使菌落能夠在紫外光下產(chǎn)生特征性熒光，以此來檢測水中大腸埃希氏菌的方法。培養(yǎng)基：NA-MUG培養(yǎng)條件：36±1℃培養(yǎng)4h紫外燈：波長366nm，功率6W第11頁/共42頁酶底物法定義：在選擇培養(yǎng)基上能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶分解色原底物釋放出色原體使培養(yǎng)基呈現(xiàn)顏色變化，并能產(chǎn)生β-葡萄糖酫酸酶分解熒光底物釋放出熒光產(chǎn)物，使菌落能夠在紫外光下產(chǎn)生特征性熒光，以此技術(shù)來檢測大腸埃希氏菌的方法為大腸埃希氏菌酶底物法。培養(yǎng)基：ONPG-MUG結(jié)果判定：水樣變黃色同時(shí)在366nm的紫外光下產(chǎn)生藍(lán)色熒光為陽性。水樣未變黃色而有藍(lán)色熒光產(chǎn)生不能判定為陽性。第12頁/共42頁五、賈第鞭毛蟲子和隱孢子蟲賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲是一類寄生于人和動(dòng)物體內(nèi)的腸道原蟲，可致人獸共患病。患此病的人和動(dòng)物從糞便中排出大量的卵(孢)囊污染環(huán)境，在地面水和防護(hù)差的地下水及處理不良的自來水中都可檢出卵(孢)囊。隨著社會(huì)發(fā)展，優(yōu)質(zhì)供水勢在必行。對一些潛在的危險(xiǎn)因素加以限制很有必要。在此基礎(chǔ)上，新標(biāo)準(zhǔn)中增加了賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的檢測方法。第13頁/共42頁Cryptosporidium隱孢子蟲特點(diǎn):單一細(xì)胞原生動(dòng)物，約3-7m。有微小隱孢子蟲、鼠隱孢子蟲和貝氏隱孢子蟲三種，寄生于人、牛等體內(nèi)的主要為微小隱孢子蟲（C．parvum）。宿主：人類、鳥類、鼠類、爬行類、魚類感染源:隱孢子蟲主要寄生在被感染的動(dòng)物體腸道內(nèi)，卵囊通過糞便排出體外污染環(huán)境。易感人群：免疫缺陷者（如愛滋患者）、兒童、老人、醫(yī)務(wù)人員等傳播方式:以糞-口，手-口途徑為主，污染的水源和空氣均可傳播。第14頁/共42頁Cryptosporidium隱孢子蟲生活周期子孢子滋養(yǎng)體Ⅰ型裂殖體裂殖子Ⅱ型裂殖體雌、雄配子體合子成熟卵囊裂殖子第15頁/共42頁Cryptosporidium隱孢子蟲(染色后熒光顯微鏡下)第16頁/共42頁特點(diǎn):單一細(xì)胞原生動(dòng)物，大小約10-15m，含4對鞭毛和雙核。人、動(dòng)物共染。寄生人體內(nèi)為藍(lán)氏賈第鞭毛蟲Giardialamblia。在不同溫度和緯度地區(qū)均能發(fā)現(xiàn)該病；發(fā)達(dá)國家感染率為2-5%；發(fā)展中國家感染率可高達(dá)到20-30%?？梢鸺甭愿篂a、腸吸收紊亂及延緩兒童的生長發(fā)育。傳染源：被孢囊污染的水和食物；往往一人帶孢囊全家感染；傳播:通過被污染的水和食物經(jīng)口傳播；接觸（往往一人帶孢囊全家感染）；娛樂用水；旅游。易感人群：3歲以內(nèi)嬰兒；免疫功能受損害者；旅游者。Giardia賈第鞭毛蟲第17頁/共42頁重要的動(dòng)物宿主賈第鞭毛蟲在自然界廣泛存在，包括兩棲動(dòng)物；鳥類；哺乳動(dòng)物在內(nèi)的40多種動(dòng)物均可成為賈第鞭毛蟲的宿主。調(diào)查表明，人排出孢囊可使狗、海貍、麝鼠、沙土鼠及大鼠等動(dòng)物感染。一些生活在水中的動(dòng)物可被來源于人的賈第鞭毛蟲孢囊感染，因此這些動(dòng)物即使不是主要宿主也可能作為賈第鞭蟲的傳播媒介。第18頁/共42頁Giardia賈第鞭毛蟲第19頁/共42頁兩蟲感染的特點(diǎn)賈第氏鞭毛蟲(Giardia)/隱孢子蟲(Cryptosporidium)/感染后無特殊臨床癥狀,無預(yù)防疫苗，絕大多數(shù)抗生素?zé)o效，治療依賴于自身抵抗力大部份作為源水的江河及水庫水等地表水是高危的,大部分地下水都有被地表水污染的潛在危險(xiǎn)可以通過被污染的源水而進(jìn)入供水系統(tǒng),水源性感染已成為最大的感染源，但孢/卵囊對傳統(tǒng)的水處理法中氯化消毒有抗性,氯不能滲透過卵囊，沙濾及膜過濾法也不能完全去除

飲用水高溫煮沸也并非有效對氯消毒耐受、對熱敏感、感染劑量低、感染率高第20頁/共42頁隱孢子蟲感染案例

1993年在美國威斯康星州的東南部港口城市密爾沃基暴發(fā)400,000人被Cryptosporidium感染，4,000人到醫(yī)院就醫(yī)，60人死亡。調(diào)查顯示致病源為處理不慎的飲用水。

1996年美國CDC將Cryptosporidium感染列入國家必須申報(bào)的傳染病名單，2002年將Giardia感染列入國家必須申報(bào)的傳染病名單—U.S.EPA第21頁/共42頁兩蟲的檢測方法（免疫磁分離熒光抗體法）檢測程序：水樣過濾洗滌離心免疫磁珠捕獲卵囊磁珠與卵囊復(fù)合物的分離熒光標(biāo)記和DAPI染色顯微鏡檢查記述結(jié)果報(bào)告檢測問題：方法操作復(fù)雜檢出率低無法進(jìn)行生物活性判定不能進(jìn)行屬、種鑒定價(jià)格高第22頁/共42頁IDEXXFilta-Max?

手動(dòng)/自動(dòng)系統(tǒng)－濾器及濾芯FiltaMaxXpress快速系統(tǒng)-濾器及濾芯過濾器濾芯第23頁/共42頁Filta-Max:濾芯結(jié)構(gòu)（手動(dòng)/自動(dòng)法）

60層環(huán)狀海綿:55mmx10mm

(18mm中孔)從60cm壓縮成3cm螺栓固定Filta-Maxxpress:快速法濾芯結(jié)構(gòu)40層海綿:55mmx10mm(18mm中孔)39層海綿:40mmx10mm(18mm中孔)交互疊放從79cm壓縮到3cm螺栓固定第24頁/共42頁水樣流向1.水樣過濾水樣從兩側(cè)流經(jīng)壓縮的海綿膜匯集至中孔“兩蟲”在濾芯表面被捕獲濾器連接套件濾器濾芯（過濾模塊）第25頁/共42頁

洗滌管濾芯置于洗滌管,并將濾芯下部的壓縮固定鑼栓解除周律性地壓縮/擴(kuò)展海綿濾芯2.洗滌(淘洗)濾芯第26頁/共42頁洗滌(淘洗)裝置Filta-Max?手動(dòng)淘洗裝置Filta-Max?自動(dòng)淘洗裝置FiltaMaxXpress快速淘洗裝置過濾器500ml錐形離心瓶第27頁/共42頁Filta-Maxxpress快速法淘洗流程

濾器（帶濾芯）放入淘洗裝置淘洗裝置連接緩沖液及空氣壓縮機(jī)加4.0巴(58psi)壓縮空氣按動(dòng)F1鈕2分鐘后收集400ml淘洗液快速全自動(dòng)壓縮空氣濾器＋濾芯淘洗液收集第28頁/共42頁1.將裝有淘洗液樣本的500mL離心管置2000g離心力下，離心15min。慢慢地減速，（不能使用制動(dòng)裝置！）以免攪起沉淀物。

2.用吸氣裝置將沉淀物上層8-10mL處的懸浮物小心吸出

（吸氣裝置的真空應(yīng)小于3.3kPa）。3.離心濃縮第29頁/共42頁4.免疫磁珠捕獲捕獲原理:

標(biāo)記A抗體的磁珠具有A抗原的C/G

DYNALMIX1混合器MPC-1磁極MPC-S磁極第30頁/共42頁5.免疫磁珠與孢（卵）囊復(fù)合物的分離60min5min10min染色鏡檢第31頁/共42頁6.染色及鏡檢單克隆免疫熒光染色（FA-異硫氰酸熒光素）或DAPI(4,6-二氨基-2-苯基吲哚)染色熒光顯微鏡（DifferentialInterferenceContrast,DIC）第32頁/共42頁

隱孢子蟲賈第鞭毛蟲兩蟲的單抗染色結(jié)果第33頁/共42頁隱孢子蟲的單克隆抗體染色結(jié)果第34頁/共42頁隱孢子蟲DAPI染色結(jié)果第35頁/共42頁賈第鞭毛蟲的單克隆抗體染色結(jié)果第36頁/共42頁賈第鞭毛蟲DAPI染色結(jié)果第37頁/共42頁賈第